用于检测玉米shrunken4基因的特异性引物组及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测玉米ShrunkeM基因的特异性引物组及其应用。
【背景技术】
[0002]玉米(Zea mays L)属于禾本科玉蜀黍属玉米种，为一年生草本植物，是世界三大粮食作物之一。据FAO统计，从1998年开始，玉米的总产量已超过小麦和水稻成为全球第一大粮食作物(http://www.fa0.0rg/)，并且与其他两大主要的谷类作物产量差距逐年拉大。同时，随着世界经济的发展，玉米的需求量却在不断增加，预计到2017年，全球玉米和小麦的年产量需要再增加2亿吨才能满足全世界的需求。玉米是“饲料之王”，对畜牧业和养殖业的发展具有举足轻重的作用。我国目前的玉米消费量和产量均为世界第二，并且产量和需求一直在不断的增长中。因此，这对玉米产量和品质的改良与创新提出了更高的要求。
[0003]除了产量，玉米的主要生产性状还表现在营养价值这一方面。玉米籽粒包含三大有机营养成分:70-75%的淀粉，8-10%的蛋白和4-5%的油脂。通常，玉米胚乳蛋白，以蛋白体的形式进行蛋白储藏，其中70%的成分是醇溶蛋白，也称作玉米蛋白(zein)。然而，这些含量丰富的醇溶蛋白氨基酸组成很不平衡。玉米胚乳缺乏一些单胃动物必需的氨基酸，尤其是赖氨酸，仅含有胚乳干重的1.5-2%，而赖氨酸最佳的人类营养比例是5%。大多数粉质胚乳突变体都有一个共同的特征:显著增加赖氨酸的含量、改良蛋白品质。其中，以opaque2的突变尤为显著，赖氨酸含量增加接近2倍。研究表明大多数此类突变体蛋白品质的改善得益于非醇溶蛋白和醇溶蛋白比例的增加。
[0004]shrunken4(简称sh4)也是一个高赖氨酸突变体，具有Opaque表型(图1)。对sh4突变体的遗传学分析表明:sh4突变体是单基因控制的隐性突变，能够引起玉米籽粒的不透明表型。sh4突变体在多个背景下(如w22和B73)，能产生赖氨酸含量增加，蛋白品质提高。经典的遗传学研究将sh4基因定位在5号染色体。目前该基因尚未被克隆，而且该基因至今未通过杂交育种被很好的利用，主要是该基因是由隐性基因突变引起，通过杂交选育需要较长的时间。配制了 sh4突变体在W22，B73，W64A等背景下的遗传群体，从中选择出外显率良好的群体材料用于sh4基因的遗传定位。其次，利用网上玉米基因组序列信息结合相关生物信息学软件的分析进行了 SSR，InDeI等分子标记的开发，筛选出多态性良好的分子标记用于对群体材料的检测。最终通过对11400颗左右突变体籽粒群体的检测，将sh4基因限定在5号染色体长臂上InDel575和InDel592区间内。
[0005]DNA分子标记辅助育种是一种新的育种技术。该技术是通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对控制目标性状的基因进行间接选择的现代育种技术。该技术对目标基因的转移，不仅可以在早代进行准确、稳定的选择，而且可以克服再度利用隐性基因时识别难的问题，从而加速育种过程，提高育种效率。与常规育种相比，该技术可提高育种效率2-3倍。由于其明显的优越性，该技术已得到了发达国家的高度重视和应用。DNA分子标记辅助育种技术的关键是:(I)获得的分子标记应该是能够区分育种过程中杂交亲本(纯合sh4类型和纯合野生型类型)以及他们的杂交子代(Fl代)的共显性标记；(2)获得的共显性分子标记位于该基因在染色体物理位置的两侧；(3)两侧的分子标记都应该与控制目标性状的基因紧密连锁。但是，以往的研究中没有获得与sh4基因紧密连锁的共显性DNA分子标记，故无法对该基因所控制的目标性状进行DNA分子标记辅助的选择。所以，对于该种标记的获得和鉴定是对玉米产量相关基因sh4进行DNA分子标记辅助育种的基础。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一在于提供一种用于检测玉米shrunkeM基因的特异性引物组。
[0007]本发明的目的之二在于提供该特异性引物组在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本中的应用。
[0008]本发明的目的之三在于提供该特异性引物组在检测和区分野生型自交系《22、B73、BSSS53、昌7_2、W64A和郑58类型以及他们杂交子代类型中的应用。
[0009]为达到上述目的，本发明采用如下的技术方案:
一种用于检测玉米ShrUnken4基因的特异性引物组，其特征在于该特异性引物组中扩增该shrunken4基因左侧DNA片段的一对特异性引物Indel592的碱基序列为:
正向引物从5'端至3'端为:GGAAAGCGAAGCAGGTAA ；
反向引物从Y端至Y端为:GTGGCTCAATCTGGAAACAT ；
扩增该shrunken4基因右侧DNA片段的一对特异性引物Indel575的碱基序列为:
正向引物从5'端至3'端为:CTGGGACTTCCTATGCCT;
反向引物从5'端至3'端为:ACGGGAGATTTTGATTGAG。
[0010]一种上述的用于检测玉米shrUnken4基因的特异性引物组在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。
[0011]一种上述的用于检测玉米shrUnken4基因的特异性引物组在检测和区分野生型自交系￥22、873、833353、昌7-2、￥64六和郑58类型以及他们杂交子代类型中的应用。。
[0012]本发明提供的两对位于sh4基因染色体物理位置两侧的与其紧密连锁的共显性DNA分子标记，以及利用这两对分子标记能对玉米sh4基因进行分子标记辅助选择的方法。利用这两个分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中sh4基因的存在与否以及杂合或纯合状态。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用sh4基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。
【附图说明】
[0013]图1、玉米sh4突变体和野生型籽粒外形及透光观察。Wt为野生型籽粒；sh4为突变体籽粒。
[0014]图2、玉米sh4突变体和野生型籽粒中赖氨酸含量测定结果。
[0015]图3、用于进行sh4基因定位的BC群体构建路线。
[0016]图4、是标记InDel592在B73背景的F2群体中的分离情况;其中sh4/sh4为纯合体；sh4/+为杂合体;+/+为野生纯合体。
[0017]图5、是标记InDel575在B73背景的F2群体中的分离情况;其中sh4/sh4为纯合体；sh4/+为杂合体;+/+为野生纯合体。
[00? 8]图6、是本发明中分子标记在玉米5号染色体长臂上的不意位置，其中CEN5代表5号染色体着丝粒，TEL代表端粒。
[0019]图7、是标记InDel592在不同自交系