之间的多态情况;-为负对照。
[0020]图8、是标记InDel575在不同自交系之间的多态情况;-为负对照。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual ,3rd ed.)或植物分子生物学一实验手册(Plant Molecular B1logy—A Laboratory Manual, Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022]实施例一:两个共显性分子标记的获得
由于sh4突变体与其相应的野生型相比，赖氨酸(Lys)含量升高了55.43%，参见图2。
[0023]本发明通过经典的遗传定位获知sh4基因定位在玉米第5号染色体的长臂上(81115.04^115.05)。通过在8114位点附近为纯合突变体和纯合野生型的植株构建的？2群体，提取纯合突变体、野生型以及F2群体各单株的基因组DNA。在前人粗定位的基础上，通过筛选已有的SSR分子标记，获取有多态性的SSR类型分子标记(umc2164与umcl524)，将sh4基因定位于分子标记umc2164与umcl524之间。然而这两个标记和sh4的连锁性并不十分紧密，在实际使用上仍有一定的问题。因此根据umc2164与umcl524之间已知的B73基因组序列(http://www.genome.arizona.edu/fpc/maize)，设计引物，进行突变体序列测定获得纯合突变体与纯合野生型亲本间的序列差异，然后根据序列差异设计特异性InDel标记。
[0024]扩增DNA片断InDel592的特异性引物及碱基序列为:
正向引物从5'端至3'端为:GGAAAGCGAAGCAGGTAA ；
反向引物从Y端至Y端为:GTGGCTCAATCTGGAAACAT ；
扩增DNA片断InDel575的特异性引物及碱基序列为:
正向引物从5'端至3'端为:CTGGGACTTCCTATGCCT;
反向引物从5'端至3'端为:ACGGGAGATTTTGATTGAG。
[0025]获得能够区分育种过程中杂交亲本(纯合sh4类型和纯合野生型类型)以及它们杂交子代(Fl代)的共显性分子标记InDel575与InDel592。
[0026]实施例二:分子标记InDel575与InDel592与sh4连锁关系的确定
分别抽提sh4/sh4与B73背景杂交后获得的Fl群体中的4个籽粒及突变体籽粒的DNA用于分子标记InDel575与InDel592与sh4连锁关系的分析，其中野生型表型的基因型为sh4/+，sh4纯合突变体的基因型为sh4/sh4。以这8个样本来分析分子标记InDel575与InDel592与sh4基因的遗传连锁关系(参见附图4和5)。分析结果表明，这两个标记与位于sh4基因连锁，大群体分析表明，在B73背景的分离群体中，标记InDel575的交换率为3.51 X 10—4，标记InDel592的交换率为8.77\10—5。分子标记111061575与111061592与8114基因在染色体上的物理位置关系参见附图6。
[0027]实施例三:分子标记在不同亲本间的多态性鉴定
提取sh4和6种育种中广泛使用的自交系昌7-2、W22、W64A、B73、郑58、和BSSS53的基因组DNA，通过PCR反应分析在不同品种间的多态性。结果表明，使用本发明中的分子标记InDel575和分子标记InDel592可以区别sh4与其余所有自交系(图7和图8)。此结果证明，分子标记InDel575和分子标记InDel592能够在任何育种背景群体中准确检测到sh4基因的存在，辅助选择时的错选率为3.08 X I O—8，可以满足选择要求。
【主权项】
1.一种用于检测玉米shrunken4基因的特异性引物组，其特征在于该特异性引物组中扩增该shrunken4基因左侧DNA片段的一对特异性引物Indel592的碱基序列为: 正向引物从5'端至3'端为:GGAAAGCGAAGCAGGTAA ； 反向引物从Y端至Y端为:GTGGCTCAATCTGGAAACAT ； 扩增该shrunken4基因右侧DNA片段的一对特异性引物Indel575的碱基序列为: 正向引物从5'端至3'端为:CTGGGACTTCCTATGCCT; 反向引物从5'端至3'端为:ACGGGAGATTTTGATTGAG。2.—种根据权利要求1所述的用于检测玉米shrUnken4基因的特异性引物组在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。3.—种根据权利要求1所述的用于检测玉米shrUnken4基因的特异性引物组在检测和区分野生型自交系w22、B73、BSSS53、昌7_2、W64A和郑58类型以及他们杂交子代类型中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测玉米<i>shrunken4</i>基因的特异性引物组及其应用。该特异性引物组中扩增该<i>shrunken4</i>基因左侧DNA片段的一对特异性引物Indel592？的碱基序列为：正向引物从5′端至3′端为：GGAAAGCGAAGCAGGTAA；反向引物从5′端至3′端为：GTGGCTCAATCTGGAAACAT；？？？？扩增该<i>shrunken4</i>基因右侧DNA片段的一对特异性引物Indel575？的碱基序列为：正向引物从5′端至3′端为：CTGGGACTTCCTATGCCT；反向引物从5′端至3′端为：ACGGGAGATTTTGATTGAG。利用这两个分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中<i>shrunken4</i>基因的存在与否以及杂合或纯合状态。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用<i>shrunken4</i>基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105624323
【申请号】CN201610189558
【发明人】宋任涛, 孙晓亮, 姚东升, 韩东洲, 祁巍巍, 梅冰, 唐远平
【申请人】上海大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月30日