专利名称：：一种鉴别胆管正常上皮细胞或胆管癌细胞的方法
技术领域：
：本发明涉及医学分子生物学
技术领域：
，是一种用于鉴别正常胆管上皮细胞或胆管细胞癌细胞的方法。
背景技术：
：小RNA是一种长度大约为1825个核苷酸的RNA小分子，自参与调控线虫时序发育的小RNA分子lin-4与let-7被发现以来,至2004年初已有700多个线虫、果蝇、人、拟南芥等真核生物小RNA被报道。目前根据国际权威小RNA数据库统计，人体中已经发现695个小RNA分子(SangerInstitute,Release12.0)。小RNA的特点主要表现为它的保守性、基因簇集现象和特异性表达。由于小RNA分子本身长度很短，很难被机体中RNA酶降解，因此它在不同类型组织中的丰度非常稳定，有利于应用各种方法对其表达水平进行检测。测定的具体方法为将相应的组织样本匀浆后，抽提组织中总的RNA，再通过定量PCR、表达谱芯片或液相芯片技术分别检测不同小RNA分子在组织中的表达丰度。有人通过使用上述技术对小RNA表达水平进行大规模筛查后发现肺癌、大肠癌、白血病、肝癌、脑胶质瘤、乳腺癌等组织中许多小RNA的表达水平与正常组织相比均发生了明显的改变。有报道指出，小RNA分子let-7表达水平的显著降低与非小细胞肺癌病人更差的预后密切相关，let-7表达水平越低，其预后越差，术后生存期越短[TakamizawaJ,KonishiH，YanagisawaK,TomidaS，OsadaH,EndohH，HaranoT,YatabeY,NaginoM,NimuraY,MitsudomiT，TakahashiT.CancerRes.2004Jun1;64(11):3753-3756]。还有文献报道，不同组织来源的样本，其小RNA表达谱差异明显[LuJ，GetzG，MiskaEA,Alvarez-SaavedraE，LambJ，PeckD,Sweet-CorderoA,Ebert已L,MakRH，FerrandoAA，DowningJR,JacksT'HorvitzHR，GolubTR.Nature.2005Jun;435(7043):834-838]。但至今未见将小RNA的表达丰度用于鉴别正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞的报道。
发明内容鉴于临床上出现正常组织和恶性肿瘤组织难以区分的问题，特别是正常胆管上皮细胞和胆管癌细胞容易相混，本发明提供一种用一组标志性小RNA的表达丰度鉴别正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞的方法。本发明根据不同组织来源的样本，其相关小RNA的表达丰度存在明显差异的特点，将正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞的小RNA表达丰度的数据分别进行筛选、归类，用一组正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞的标志性小RNA的表达丰度值Ct减去18sRNA的表达丰度值所得的标准化表达丰度值ACt值作为标准数据，采用聚类分析软件GeneCluster3.0，分别输入标准数据和待测样本的标志性小RNA的ACt值，由显示的聚类分析图谱，来判定该样本是否来源于正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞，若彩色图谱显示该样本归入胆管癌细胞部分，说明其来源于胆管癌组织；若显示该样本归入正常胆管上皮细胞部分，说明其来源于正常胆管上皮细胞；若显示其既不归入胆管癌细胞部分，也不归入正常胆管上皮细胞部分，就说明该样本既非来源于胆管癌组织，也非来源于正常胆管上皮组织。本发明方法如下1.制备总RNA:将同种不同体的正常胆管上皮细胞或胆管癌样本若干例，分别用lnvitrogen公司的RNA抽提液TriZol按常规抽提总RNA，并测定各例正常胆管上皮细胞或胆管癌样本相应的总RNA的浓度。2.小RNA表达丰度的测定使用AppliedBiosyste公司的小RNA检测试剂盒(TaqManMicroRNAAssayHumanPanel-EarlyAccessKit,P/N:4365409)，以及荧光实时定量PCR技术，按常规分别检测各例正常胆管上皮细胞或胆管癌样本中总RNA样本中的156种小RNA的表达丰度，各例分别得156种小RNA的表达丰度值(Ct值)。3.筛选标志性小RNA:用上述方法先检测各例正常胆管上皮细胞或胆管癌样本的总RNA中18sRNA的表达丰度值，将其作为内参照，再将上述156种小RNA的表达丰度值(Ct)减去18sRNA的表达丰度值后得标准化的表达丰度值(ACt)。将各例正常胆管上皮细胞或胆管癌样本的156种小RNA中相应小RNA的标准化表达丰度值(ACt)之差AACt的阈值设定为3.5，使用数据显著性差异分析软件(SAM，http:〃www-stat.stanford.edu/tJbs/SAM/)，从这156种小RNA中筛选得到AACt>3.5的13种小RNA，它们是mir-21、mir-374、mir-25、mir-15a、mir國193、mir陽106a、mir画204、mir-198、mir-337、mir画302d、mir匿320、mir-371、mir-184，以这13种小RNA作为鉴别正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞样本的标志性小RNA。取各例13种小RNA的ACt值，分别将各例正常胆管上皮细胞和胆管癌样本的13种小RNA的ACt值归为一组，作为标准数据(见表1、表2)用于鉴别无法判定恶性程度的胆管细胞样本是否为正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞。4.鉴别正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞的方法应用数据聚类分析软件(GeneCluster3.0，http:〃bonsai.ims.u-tokyo.ac.jp/mdehoon/software/cluster/),分另ij输入上述木示准数据(见表1、表2),和未知样本中13种标志性小RNA的ACt值，由软件通过聚类分析程序将其进行归类，如果落入正常胆管细胞标志性小RNAACt值的范围内，则聚类分析彩色图谱显示其归入正常胆管上皮细胞部分，说明该样本来源于正常胆管上皮细胞；如果落入胆管癌细胞标志性小RNAACt值的范围内，则聚类分析彩色图谱显示其归入胆管癌部分，说明该样本来源于胆管癌细胞样本。实验证明，本发明方法能从无法判定恶性程度的胆管细胞样本中鉴别出是否为正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞，具有检测方便、准确率高的优点。图1正常胆管上皮细胞和胆管癌小RNAACt值聚类分析图谱图2K值法对应用13种标志性小RNAACt值作鉴别的可靠性交叉验证图图3(l，II)应用表1、2的标准数据鉴别正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞的聚类分析图谱具体实施方式现结合附图和实施例，对本发明作详细描述。实施例1.建立鉴别正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞标志性小RNA的ACt标准数据。1.RNA抽提选取27例胆管癌组织和10例正常胆管上皮组织，每例样本分别取100mg组织加入1mlTriZol(lnvitrogen公司)，用液氮研磨充分研碎组织块。加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1分钟左右，室温下静置5分钟。4°C、12，000rpm离心15分钟后小心转移上清液入新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10分钟。4'C、12000rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70%乙醇，4°C、12000rpm离心洗涤沉淀5分钟。去上清，将沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解，测定总RNA的浓度。2.实时定量PCR反应使用AppliedBiosyste公司的小RNA检测试剂盒(TaqManMicroRNAAssayHumanPanel-EarlyAccessKit,P/N:4365409)，禾口荧光实时定量PCR技术，分别检测37例样本中各例的156种小RNA的表达丰度值(Ct)。3.实时定量PCR数据标准化处理用上述方法先检测各例正常胆管上皮细胞或胆管细胞癌的总RNA中18sRNA的表达丰度值，将其作为内参照，再将上述156种小RNA的表达丰度值(Ct)减去18sRNA的表达丰度值后得标准化的表达丰度值(ACt)。4.标志性小RNA的筛选将上述各例正常胆管上皮细胞与胆管癌的156种小RNA中相应小RNA的标准化表达丰度值(ACt值)之差AACt的阈值设定为3.5，使用数据显著性差异分析软件(SAM，http:〃www-stat.stanford.edu/tibs/SAM/)，筛选出ACt〉3.5的13种小RNA，它们是mir-21、mir-374、mir-25、mir-15a、mir-193、mir-106a、mir画204、mir曙198、mir-337、mir隱302d、mir-320、mir國371、mir誦184，以这13种小RNA作为鉴别正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞的标志性小RNA，取各例13种小RNA的ACt值，分别将各例正常胆管上皮细胞或胆管细胞癌的13种小RNA的ACt值归为一组，作为标准数据(见表1、表2)用于鉴别组织样本是否为正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞。表1.10例正常胆管上皮细胞(cholangjocyte)的13种小RNA的△Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>将上述表1、2的标准数据输入聚类分析软件(GeneCluster3.0，http7/bonsai.ims.u-tokyo.ac.jp/~mdehoon/software/cluster/)f寻至(J正常月旦管上皮细胞和胆管癌小RNAACt值聚类分析图谱，见图1。5.标志性小RNAACt值作鉴别的可靠性的交叉验证使用表达谱预测分析软件(Predictionanalysismicroarray,PAM)对使用本发明表1和表2的标准数据鉴别正常胆管上皮细胞和胆管癌细胞的可靠性进行K值法交叉验证。结果见图2、图3，由图2和图3可见，本发明方法鉴别的准确率接近100%。实施例2.用本发明方法鉴别受检组织样本取2份受检组织样本，分别以每100mg组织加入1mlTriZol抽提样本中总的RNA，应用实时定量PCR技术测定18sRNA的表达丰度值作为内参照。另以5ng/孔/为标准，使用AppliedBiosystem公司小RNA检测试剂盒，测定13个标志性小RNA的表达丰度值(Ct)。将相应小RNA的表达丰度值Ct减去18sRNA的表达丰度值，得到标准化的表达丰度值(ACt)。将待测样本中13种标志性小RNA的ACt值与标准数据分别输入聚类分析软件(GeneCluster3.0)，并进行如下设置设定。/。present参数大于等于80，设定连锁方式为averagelinkage,输出聚类分析图谱，并以此来判定各样本的起源。结果1号样本在聚类分析图谱上显示其归入胆管癌部分，说明相应小RNAACt值落入胆管癌标志性小RNAACt值的范围内，该样本来源于胆管癌(见图3，I);2号样本在聚类分析图谱上显示其归入正常胆管上皮细胞部分，说明相应小RNA△Ct值落入正常胆管上皮细胞标志性小RNA△Ct值的范围内，该样本来源于正常胆管上皮细胞(见图3，ll)。权利要求1.一种鉴别正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞的方法，其特征在于用一组正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞的标志性小RNA的表达丰度值Ct减去18sRNA的表达丰度值所得的标准化表达丰度值ΔCt值作为标准数据，采用聚类分析软件GeneCluster3.0，分别输入标准数据和待测样本的相应标志性小RNA的ΔCt值，并进行如下设置设定％present参数大于等于80，设定连锁方式为averagelinkage，由显示的聚类分析图谱，来判定其是否为正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞，所说的标志性小RNA分别为mir-21、mir-374、mir-25、mir-15a、mir-193、mir-106a、mir-204、mir-198、mir-337、mir-302d、mir-320、mir-371、mir-184。2.按权利要求1所述的鉴别正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞的方法，其特征在于所说的标准数据如表1和表2所示；表1.10例正常胆管上皮细胞(cholangiocyte)的13种小RNA的ACt值<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>全文摘要本发明是一种鉴别正常胆管上皮细胞或胆管癌细胞的方法。本方法用一组胆管癌细胞和正常胆管上皮细胞的标志性小RNA的表达丰度值Ct减去18sRNA的表达丰度值所得的标准化表达丰度值ΔCt值作为标准数据，采用聚类分析软件GeneCluster3.0，分别输入标准数据和待测样本的标志性小RNA的ΔCt值，由显示的聚类分析图谱来作出判定，若彩色图谱显示该样本归入胆管癌细胞部分，说明其来源于胆管癌组织；若显示该样本归入正常胆管上皮细胞部分，说明其来源于正常胆管上皮细胞；若显示既不归入正常胆管癌细胞部分，也不归入正常胆管上皮细胞部分，就说明该样本既非胆管癌细胞，也非正常胆管上皮细胞。本方法鉴别方便，准确率高。文档编号C12Q1/68GK101407842SQ20081020361公开日2009年4月15日申请日期2008年11月28日优先权日2008年11月28日发明者亮李,王红阳,良胡,鄢和新,磊陈申请人:中国人民解放军第二军医大学