专利名称：基于线粒体dna拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测用的试剂盒，具体涉及基于线粒体DM拷贝数预测高原肺 水胂发病风险的试剂盒，用于评定人体高原肺水肿的易感性。
背景技术：
高原肺水肿(high altitude pulmonary edema,缩写HAPE)是一种特发于高 原低氧环境的肺水肿，起病急，进展快，危害大，如果救治不及时，可在较短 的时间内发展至呼吸衰竭，甚至死亡，是严重威胁进入高原人群健康和生命的 急性重症高原病。近年的调查表明，在从平原进入海拔3000米以上高原的汉族 人群中，高原肺水肿的发病率高达O. 4%-2%。高原肺水肿发病有明显的家族和个 体易感倾向，环境因素和遗传貝素均可以影响高原肺水肿的发生。近年来，遗 传因素在高原肺水肿发病机制中的作用逐渐受到重视张雪峰，高原施工人群 急性重型高原病患病率调查，《高原医学杂志》，2005; 15(3): 7-8;陈有，高 原肺水肿发病机制研究进展，《高原医学杂志》，2005， 15 ( 2 ): 62-64;高钰琪， 高原肺水肿的发病机制及防治，《人民军医》，2005; 482 ( 2 ): 108-111。
由于线粒体是动物细胞内唯一含有DNA和蛋白质合成系统的细胞器，是氧 传送链的生理终点站，是细胞氧耗的主要位点。它在低氧习服和适应中发挥着 重要作用。高原肺水肿是一种低氧习服不良的急性高原病，因而线粒体在高原 肺水肺的发生中发生着重要的作用Moudgi 1 R， Hypoxic pulmonary vasoconstriction,《J Appl Physiol》，2005; 98: 390-403。线丰立体呼吸链氧化磷酸化不但与线粒体DNA结构的完整性相关，还与其拷贝数相关，线粒 体DNA拷贝数增加被认为是总线粒体呼吸功能的代偿，目前已经发现许多疾病 的易感性与线粒体DNA拷贝数相关周云丽，乳腺癌线粒DNA拷贝数改变的研 究及意义，《天津医科大学学报》，2005; 11 (5): 525-527;许洪波，喉癌线粒体 DNA拷贝数的临床意义，《中国耳鼻咽喉头颈外科》，2006， 13 ( 4 ): 219-222。 关于线粒体DNA拷贝数与高原肺水肿易感的相关性尚无报道。
通过SYBR (即SYBR GREEN染料，缩写SYBR )定量PCR(聚合酶链反应)的 方法检测线粒体DNA拷贝数，发现线粒体DNA拷贝数与高原肺水肿易感性之间 存在相关性。具体^L法是
(1 )健康对照组标本(25例)在成都采集拟进入高原人员静脉血2ml (EDTA 抗凝)，然后与他们一起乘飞机达到拉萨(海拔3658米)，并观察他们在拉萨一
周内没有发生高原肺水肿；
(2)高原肺水肿病例組标本(25例)为与健康对照组标本年龄匹配，按 高原病诊断标准我国高原病命名、分型及诊断标准，《高原医学杂志》，19%: 2-4符合高原肺水肿诊断标准的病例。样本收集过程中遵循"赫尔辛基"宣言， 本研究得到了收集对象的知情同意，采集静脉血2ml (EDTA抗凝)。
(3 )分别用上海生工生物技术服务有限公司UNIQ-10柱式临床样品基因组 抽提试剂盒(货号SK1342 )提取健康对照组标本和高原肺水肿病例组标本的血 液白细胞DNA,然后釆用定量PCR(SYBR染料法)的方法分别扩增健康对照组标 本和高原肺水肿病例组标本的线粒体DNA上的ND1基因(NADH Dehydrogenase Subunitl,缩写ND1 )和核基因编码的看家基因Beta-actin;再分别计算每例 标本的NDl拷贝数与Beta-actin的拷贝数的比值，结果经SPSS 12.0 (—种统计软件)中的独立样本T检验进行检验，以P<0. 05为相差显著，并通过该软件 计算出95%的可信区间，以分別得到健康对照组和高原肺水肿病例组 NDl/Beta-actin拷贝数的参考值，结果发现在高原肺水肿病例组中 舰/Beta-actin的拷贝数比值显著降低(表1 )。
表l高原肺水肿病例组和健康对照组中NDl/Beta-actin拷贝数比值
健康对照组(n=25)高原肺水肿病例组(n=25)
NDl/Beta-actin0. 0822±0. 00940. 0291±0. 00554
95%可信区间0. 0625-0. 10200. 0176-0. 0407
"高原肺水肿病例组vs健康对照组P=0. 000
发明内容
本发明的目的是提供基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试 剂盒，能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿 的预防和治疗，减轻急性重症高原病的威胁。 —
本发明所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒， 包括分离包装的ND1引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌 去离子水，定值标准品，健康对照13M，其特征是，
所述的ND1引物混合液中的上游引物(F)和下游引物U)的序列为 F: 5， -ATACAACTACGCAAAGGCCCCA-3，和R: 5， -AATAGGAGGCCTAGGTTGAGGT-3，； 所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为 F: 5，-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3，和R: 5，-GAAGGMGGCTGGAAGAGTG-3，； 所述的PCR反应液,含有PCR緩冲液、MgCl2、 dNTPs(脱氧核苷三磷酸)、SYBR 染料、Ex Taq酶;
6所述的定值标准品是用Beta-act in的上下游引物在PTC-200 PCR仪中进行 目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆栽体
pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Beta-actin基因片段的菌 液中提取质粒。
所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的健康对照DNA是采集拟进入高原前的人员的静脉血2ml (EDTA抗凝)，并且到 高原后在一周内没有发生高原肺水肿，然后，提取血液白细胞DNA，再将DNA 浓度调为50ng/y 1。
所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的ND1引物混合液为lOOpl;其中上游引物和下游引物各50jal，浓度均为 10pmo1/)J 1。
所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的Beta-actin引物混合液为400 nl;其中上游引物和下游引物各200 p 1，浓 度均为lOomol/ p 1。
所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的定值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每管体积200 yl，浓度分别为 1X104、 1X105、 1X106、 1X107、 1X1。8拷贝/jn 1。
所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，其所述 的无菌去离子水为1500ja 1。
本发明建立了利用定量PCR (SYBR染料法)方法检测来线粒体DM拷贝数 的方法，能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水 肿的预防和治疗，减轻急性重症高原病的威胁，有利于进入高原人群健康；该试剂盒使用简单，操作方便，检测快速。
具体实施例方式
本发明所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肺发病风险的试剂盒， 包括分离包装的ND1引物混合液，Beta-act in引物混合液，PCR反应液，无菌 去离子水，定值标准品，健康对照DNA;
试剂盒中的ND1引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为
F:5， -ATACAACTACGCAAAGGCCCCA-3'和5， -AATAGGAGGCCTAGGTTGAGGT-3，；
所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为
F: 5，-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3，和R: 5，-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3,;
试剂盒中的PCR反应液，含有PCR緩冲液、MgCh、 dNTPs(脱氧核苷三磷酸)、 SYBR染料、ExTaq酶，直接购于宝生物工程(大连)有限公司，货号DRR041S。
试剂盒中的定值标准品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200 PCR仪中 进行目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆 栽体pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序^;从证实含Beta-actin基因片段 的菌液中提取质粒。
试剂盒中的健康对照DNA是采集拟进入高原前的人员的静脉血2迈1 (EDTA抗 凝)，并且到高原后在一周内没有发生高原肺水肿，然后，提取血液白细胞MA， 再将DM浓度调为50ng/nl。
试剂盒中的ND1引物混合液为IOO卩1;其中上游引物和下游引物各50y 1， 浓度均为10pfflol/y 1。
试剂盒中的的Beta-actin引物混合液为400 p 1;其中上游引物和下游引物 各200inl，浓度均为10pmol/p 1。试剂盒中的定值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每管体积200ji 1， 浓度分别为lx104、 lxl05、 lxio'、 lxl07、 lxl(T拷贝/pl。 试剂盒中的无菌去离子水为1500 pl。
试剂盒中的定值标准品用Beta-act in上下游引物，在PTC-200 PCR仪中进行 扩增，条件为94"C预变性5min， 94"C变性30s， 60TC退火30s， 721C延伸45s， 94 TC变性30s， 60匸退火30s， 721C延伸45s……其中94匸变性30s， 60匸退火30s， 72 r延伸45s循环29次，72t:终末延伸8min, PCR产物经电泳检测后用将目的片段 (扩增产物)插入克隆栽体pMD18-T(购于宝生物工程有限公司)中，并将阳性 克隆增菌后测序發江；
从证实含有Beta-actin基因片段的菌液中提取质粒，采用分光光度仪测得 质粒浓度，再算出摩尔浓度Ot量除以碱基数+ 324. 5 + 10),再乘以阿拂加的罗 常数(6. 02x10")，得到质粒的浓度为lxl(T拷贝/yl。将质粒进行倍比稀释(共 稀释五个梯度)。稀释后将标准品(即上述质粒)分别装在200 n 1小管内，于 -201C的水箱内保存，避免质粒反复冻融导致降解；
健康对照DM，在成都采集拟i^高原人员静脉血2ml，然后与他们一起乘 飞机达到拉萨，并观察他们一周且在这周内没有发生高原肺水肺，抽取静脉血 2ml (EDTA抗凝)并提^jfe液白细胞DNA。
该试剂盒的使用说明
第一步，待测个体样品准备，采用上海生工生物技术服务有限公司UNIQ-10 柱式临床样品基因组抽提试剂盒(货号SJQ342 )提取待测个体静脉血液中白细 胞基因组总DNA,然后用紫外分光光度仪对DM进行定量；
第二步，PCR反应体系配制，共配制十管；第一管到第五管为定值标准品，共5管，浓度分别为 取10n 1浓度为1 x 108拷贝/" 1的质粒；
取10pl浓度为1 x 1()8拷贝/u 1的质粒，加入90nl无菌去离子水，混匀 得到浓度为lxl(T拷贝/p 1的质粒；
取IOM 1浓度为1 x 107拷贝/" 1的质粒，加入90p 1无菌去离子水，混匀 得到浓度为lxl()6拷贝/jLil的质粒；
取10Ml浓度为lxlO'拷贝/pl的质粒，加入90m1无菌去离子水，混匀 得到浓度为lxl()5拷贝/p 1的质粒；
取lOp 1浓度为1 x 1()5拷贝/u 1的质粒，加入90 u 1无菌去离子水'混匀 得到浓度为lxl(T拷贝/^il的质粒；
各取0. 5 m 1浓度从1 x 104至1 x 108拷贝/微升的标准品，然后每管都依次 加入Beta-actin引物混合液lpl， PCR反应液12. 5 ji 1,无菌去离子水llnl， 混匀；
第六管为待测个体冊l的扩增，取待测个体的DNA 0. 5pl，然后依次加入 NDl引物混合液lpl， PCR反应液12. 5 n 1，无菌去离子水llul，混匀；
第七管为待测个体看家基因Beta-actin的扩增，取待测个体的DNA 0. 5 p 1，然后依次加入Beta-actin引物混合液1 m 1， PCR反应液12. 5 p 1，无菌去 离子水llnl，混匀；
第八管为空白对照，分别取Beta-act in引物混合液1 1， PCR反应液12. 5 Ml,无菌去离子水11.5pl，混匀；
第九管为健康对照样本ND1的扩增，取对照DNAO. 5pl，然后依次加入ND1 引物混合液lnl， PCR反应液12. 1，无菌去离子水lliil，混匀；第十管为健康对照样本看家基因Beta-act in的扩增，M照DNA 0. 5p 1， 然后依次加入Beta-actin引物混合液lpl， PCR反应液12. 5 ju 1，无菌去离子 水11 p 1，混匀；
第三步，PCR扩增条件，将第二步的十管已经混匀的物质分别;^Opticon monitor 1定量PCR 4义中，均按以下条件进行PCR反应951C预变性10s; 95 iC变性5s，60X:退火延伸20s，读板，重复39个循环；
其中，NDl引物扩增产物长度为221bp，序列如下
ATACAACTACGCAAAGGCCCCAACGTTGTAGGCCCCTACGGGCTACTACAACCCTTCGCTGACG CCATAAAACTCTTCACCAAAGAGCCCCTAAAACCCGCCACATCTACCATCACCCTCTACATCACCGCC
CCTCAACCTAGGCCTCCTATT;
Beta-actin引物扩增产物长度为180bp,序列如下
CGGGAAATCGTGCGTGACATCAAGAAGCTGTGCTACGTCGCCCTGGACTTCGAGCGGGAGATGG CCATGGTGGCCTCCAGCTCC丁CCCTGGAGMGAGCTACAAGCTGCTCGATGGCCAGGTCATCACCATC GGCAACGAGCGGTTCCACTGCCCCGAGGCGCTCTTCCAGCCTTCCTTC。
第四步，数据分析，PCR反应结束后，定量PCR仪通过比较待测标本的Ct 值与标准曲线Ct值，自动生成每例样本NDl和Beta-actin的拷贝数，然后， 分别用待测个体和对照的NDl拷贝数除以Beta-actin拷贝数，分別求得待测个 体和对照的NDl/Beta-actin拷贝数比值，如果对照的NDl/Beta-actin (第九 管/第十管)拷贝数比值位于0. G625-0. 1020之间时，提示我们实验准确性和灵 敏度可信，当此时待测个体(第六管/第七管)的拷贝数比值位于高原肺水肿易 感者原肺水肿的易感个体。
第一至第五管为定值标准品的扩增，以获得标准曲线；
第六、七管是为了获得待测个体的NDl基因和Beta-actin基因的拷贝数;
第八管为空白对照管，以检测整个PCR过程中是否有污染；
第九、十管是为了获得健康对照的NDl基因和Beta-actin基因的拷贝数。序列表
<110>中国人民解放军第三军医大学
<120>基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肺发病风险的试剂盒 <130>
<140> 200810232919.8 <141> 2008-10-24 <160> 6
<170> Patentln 3. 3
<210> 1 <211> 22 <212> DM <213>人工合成 <221> ND1上游引物 <400> 1
atacaactac gcaaaggccc ca 22
<210> 2 <211> 22 <212>腿 <213>人工合成 <221> ND1下游引物 < 2
aataggaggc ctaggttgag gt 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213>人工合成
<221> Beta-actin上游引物
<400> 3
cggg固tcg tgcgtgacat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>人工合成
<221> Beta-actin下游引物
<400> 4
gaaggaaggc tggaagagtg 20
<210> 5<211> 221
<212> DNA
<213> ND1核酸序列
<221> ND1 PCR扩增产物
<400> 5
atacaactac gcaaaggccc caacgttgta ggcccctacg ggctactaca acccttcgct 60 gacgccataa aactcttcac caaageigccc ctaaaacccg ccacatctac catcaccctc 120 tacatcaccg ccccgacctt agctctcacc atcgctcttc tactatgaac ccccctcccc 180 atacccaacc ccctggtcaa cctcaaccta ggcctcctat t 221
<210> 6 <211> 180 <212〉 ■
<213> Beta-act in核絲列 <221> Beta-actin PCR扩增片段 <400> 6
cgggaaatcg tgcgtgacat caagaagctg tgctacgtcg ccctggac" cgagcgggag 60 atggccatgg tggccyccag ctcctccctg gagaagagct acaagctgct cgatggccag 120 gtcatcacca tcggcaacga gcggttccac tgccccgagg cgctcttcca gccttccttc 180
权利要求
1、基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的ND1引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照DNA，其特征是，所述的ND1引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-ATACAACTACGCAAAGGCCCCA-3’和R5’-AATAGGAGGCCTAGGTTGAGGT-3’；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’；所述的PCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SYBR染料、Ex Taq酶；所述的定值标准品是用Beta-actin的上下游引物在PTC-200PCR仪中进行目的片段的扩增，得到含有目的片段的PCR产物，然后将目的片段插入克隆载体pMD18-T中，并将阳性克隆增菌后测序验证；从证实含Beta-actin基因片段的菌液中提取质粒。
2、 根据权利要求1所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险 的试剂盒，其特征是，所述的健康对照DNA是采集拟进入高原前的人员的静脉 血2ml，并且到高原后在一周内没有发生高原肺水肿，然后，提取血液白细胞 DM,再将DNA浓度调为50ng/ ja 1。
3、 根据权利要求1所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险 的试剂盒，其特征是，所述的ND1引物混合液为100y 1;其中上游引物和下游 引物各50pl，浓度均为10pmol/p 1。
4、 根据权利要求1所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险 的试剂盒，其特征是，所述的Beta-actin引物混合液为400 pl;其中上游引 物和下游引物各200 " 1,浓度均为10pmol/M 1。
5、 根据权利要求1所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险 的试剂盒，其特征是所述的定值标准品用无菌去离子水倍比稀释为5管，每管 体积200 pl，浓度分别为1X104、 1X105、 1X106、 1X107、 lXl()8拷贝/微升。
6、 根据权利要求1所述的基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险 的试剂盒，其特征是，所述的无菌去离子水为！500 p 1。
全文摘要
本发明涉及基于线粒体DNA拷贝数预测高原肺水肿发病风险的试剂盒，包括分离包装的ND1引物混合液，Beta-actin引物混合液，PCR反应液，无菌去离子水，定值标准品，健康对照DNA，其特征是，ND1引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-ATACAACTACGCAAAGGCCCCA-3’和5’-AATAGGAGGCCTAGGTTGAGGT-3’；所述的Beta-actin引物混合液中的上游引物和下游引物的序列为F5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’和R5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。本发明能用于平原人进入高原前对高原肺水肿易感者的筛选，指导高原肺水肿的预防和治疗，有利于进入高原人群健康；该试剂盒使用简单，操作方便，检测快速。
文档编号C12Q1/68GK101475981SQ200810232919
公开日2009年7月8日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者刘福玉, 罗勇军, 丽 陈, 有 陈, 高文祥, 高钰琪, 黄大愿, 黄学文 申请人:中国人民解放军第三军医大学