专利名称：一种血吸虫感染性钉螺检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种基于环介导等温DNA扩增检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒 及检测方法，属于一寄生虫病传播媒介检测领域。
背景技术：
钉螺是血吸虫的唯一中间宿主，是血吸虫病的唯一的传播媒介。消灭血吸 虫感染性钉螺可以阻断血吸虫病的传播与流行。对血吸虫感染性钉螺的分布进 行调查，有选择性地进行化学灭螺是提高血吸虫病传播阻断效果，最大限度地 保护生态平衡的一个重要手段。检测血吸虫感染性钉螺的方法有多种
肉眼观察法
在自然光线下或人工灯光照射下，通过观察钉螺的第4螺层以下的螺壳的 顏色与透光度的变化，以及钉螺肝组织与螺壳之间有无间隙来判断钉螺是否感
染血吸虫。这个方法虽然简便易行，但误差大，准确性只有60%左右，漏检率 高，不能鉴定血吸虫感染早期的钉螺。 压片镜检法
将钉螺外壳压碎，使钉螺软组织暴露出来，显微镜下通过观察钉螺组织中 是否有血吸虫母胞呦或尾呦来判断钉螺是否感染了血吸虫。该方法对血吸虫感 染晚期，尤其是对体内有发育成熟的血吸虫尾蚴存在的感染性钉螺检测的准确 性很高，但对于处于血吸虫感染早期阶段钉螺仍不能检出，检测过程需要使用 显微镜，不便于血吸虫病防治现场使用。
孵化法
将钉螺置于盛有清水的试管或其它玻璃容器中，室温下(22-25°C)孵育2-3 小时，观察钉螺体内是否有血吸虫尾呦孵出，以判断是否是血吸虫感染性钉螺。 该方法同样操作简便，对血吸虫感染晚期的感染性钉螺检测出率高，但同样不 能检出血吸虫感染早期的钉螺。
循环抗原检测法
先制备抗血吸虫循环抗原的特异性单克隆抗体，再构建检测血吸虫循环抗 原的酶联免疫吸附法(ELISA)，以此方法来检测血吸虫感染性钉螺。该方法的 优点是鉴定血吸虫感染性钉螺有很高的敏感性与特异性，但操作烦琐，技术、 设备要求高，不适合于血吸虫病防治现场使用。
聚合酶链反应法
设计血吸虫基因特异性引物，通过对钉螺组织的DNA样本进行聚合酶链反应(PCR)扩增，观察钉螺DNA样本中是否存在血吸虫特异性DNA片段存在。 该方法检测血吸虫感染性钉螺具有高度的敏感性与特异性，但是需要使用PCR 仪，DNA电泳仪等昂贵设备，耗时长，成本高，难于在血吸虫病防治现场使用。 环介导等温DNA扩增法
选择血吸虫基因中的特异性DNA片段，根据环介导同温DNA扩增原理， 设计4对或6对特异性引物，在同一个温度下对样本中的血吸虫特异性DNA片 段进行扩增，通过肉眼观察扩增产物顔色的变化来判断样本中是否存在血吸虫 特异性DNA片段，具有高度的特异性和敏感性，检测时间短，操作简便，能检 测血吸虫感染早期的感染性钉螺，适合于血吸虫病现场防治人员对血吸虫感染 性钉螺进行鉴定和用于大规模的分布调査。
发明内容
本发明的目的是提供一种环介导等温DNA扩增检测血吸虫感染性钉螺的试 剂盒及检测方法，可以解决以往的血吸虫感染性钉螺检测方法敏感性不足、或 需要复杂仪器设备等缺点，可用于血吸虫病流行区有螺地带血吸虫感染性钉螺 的鉴定与分布调査。
为达到上述目的，本发明选择日本血吸虫基因非长未端重复反转录转座子 基因(AF412214, SEQIDNO.l)的第20 bp至231 bp之间的DNA片段(SEQ IDN0.6)作为环介导等温DNA扩增的靶DNA片段，根据环介等温DNA扩增 的原理设计一组环介导等温DNA扩增检测血吸虫感染性钉螺的引物。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是构建一种环介导等温DNA扩 增检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒，该试剂盒由一套引物混合物，10倍浓縮的 环介导等温DNA扩增反应缓冲液，DNA聚合酶，阳性对照样本，阴性对照样 本，显色试剂和样本DNA抽提试剂组成；
所述的一套引物混合物是由一对外引物和一对内引物组成，其名称和序列 如下
外引物1: SEQIDNO.2, 外引物2: SEQIDN0.3， 内引物1: SEQIDN0.4， 内引物2: SEQIDNO.5,
所述的一对外引物与一对内引物之间的摩尔数比例为1:6 9; 所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活性单位为 8U/|aL;
所述10倍浓縮的环介导等温DNA扩增反应缓冲液组成是200mmol三羟 甲基氨基甲烷、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、60-120mmol/L硫酸镁、 体积百分"/。曲拉通-X100、 4 10mol/L甜菜碱和16mmol/L的dNTP;所述阳性对照样本为含本发明试剂盒检测的日本血吸虫靶DNA片段的重组 质粒；
所述的阴性对照样本为灭菌去离子水；
所述的显色试剂为10倍浓縮的荧光试剂SYBR Green I溶液； 所述的样本DNA抽提试剂包括含50mmol/L三羟甲基氨基甲垸、体积百 分0.5。/。Tween-20、 pH8.0的样本裂解液；10mg/mL蛋白酶K;用O.lmol/L的三 羟甲基氨基甲烷溶液平衡到pH8.0的苯酚；氯仿；8mol/L醋酸胺；无水乙醇； 70%乙醇；灭菌去离子水。
一套引物混合物为一对外引物与一对内引物，外引物与内引物之间的摩尔
数比例为1:8;
所述的一套引物混合物的组成是外引物l、 2|amol;外引物2、 2)imiol;内 引物l、 16|amol;内引物2、 16pmo1。
10倍浓縮的环介导等温DNA扩增反应缓冲液组成，其中硫酸镁的优选浓度 为80mmo1,甜菜碱的优选浓度为8mo1。
试剂盒中阳性对照样本为日本血吸虫基因组DNA的PCR扩增产物与TA克 隆质粒pGEM-T连结构建的重组质粒，其中含血吸虫的SEQ IDN0.6基因序列；
制备的方法以所述外引物对日本血吸虫基因组DNA进行PCR扩增，扩 增产物与TA克隆质粒pGEM-T连结构建的重组质粒，转化大肠杆菌DH5a，抽 提质粒DNA，经DNA测序确定含耙DNA片段；紫外分光光度计测定质粒DNA 的浓度后再用TE缓冲液稀释到10ng/pL，即为阳性对照样本；
TE缓冲液为pH值8.0、含200mmol/L三羟甲基氨基甲烷和lmmol/L四氨 基二乙酸。
基于环介导等温DNA扩增LAMP的血吸虫感染性钉螺的检测方法，通过 使用一套特异性引物，利用LAMP技术扩增血吸虫特定DNA片段区域，观察 判断钉螺是否感染了血吸虫；
所用的一套特异性引物序列是SEQ IDN0.2 SEQ IDNO.5;
利用LAMP技术扩增血吸虫特异性DNA片段区域，该特定区域是日本血 吸虫基因非长未端重复反转录转座子基因AF412214的第20 bp至231 bp之间长 度为212bp的DNA片段；
(1)、钉螺样本DNA的提取将钉螺外壳压破，剪取约3mn^的钉螺肝组 织，置于一个无菌的玻璃匀浆器中，加入0.5mL样本裂解液，手工匀浆，破碎 组织；将匀浆液转移到一无菌的1.5mL塑料离心管中，加入蛋白酶K溶液10pL， 混匀，55。C水浴保温1小时；10， OOOrpm离心10min，将上清液转移到一新的 1.5mL塑料离心管中；加入2倍体积苯酚，颠倒混匀200次，再以10， 000rpm 离心10min，将上清液转移到另一的1.5mL塑料离心管中；加入2倍体积氯仿颠倒混匀200次，再以10， OOOrpm离心10min，将上清液转移到另一的1.5mL 塑料离心管中；加入O.l体积8mmol/L醋酸胺，混匀，加入2倍体积无水乙醇， 混匀，以10， 000rpm离心10min，去掉上清液，沉淀物用70%乙醇洗涤2次； 在室温下千燥沉淀物，再加入20pL无菌去离子水溶解沉淀的DNA;
(2) 、环介导等温DNA扩增取3个0.2mLPCR用薄壁管，分别标记为阳 性对照管，检测管，阴性对照管；各管中加入如下成分10倍LAMP缓冲液2.5i^iL， 2mmoldNTP8iaL，引物混合物2.5pL;阳性对照管加入阳性对照样本DNA 1|liL;
检测管中加入待检样本DNA l!LlL;阴性对照管中加入去离子水l(LlL;最后各管
中加入去离子水lOpL;混匀，IO(TC水浴煮沸5min,立即至冰上冷却，加入lpL 8U的BstDNA聚合酶，混匀，短暂离心后置60'C水浴箱保温60min;然后转 移到80。C水浴保温5min;
(3) 、结果判断选用如下两种观察方法之一，观察判断钉螺是否感染了 血吸虫；
方法l):将含l吗/ml溴化乙啶的2。/。琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入pH8.0、 含0.04mol/L三羟甲基氨基甲烷和lmmol/L四胺基二乙酸的电泳缓冲液，使凝 胶浸于液面下3-5mm，取5pL扩增产物与2pL的含0.25%溴酚兰、质量浓度40% 蔗糖水溶液的凝胶载样缓冲液混合，加入凝胶孔中，以l-5V/cm的电压进行电 泳，使样本向阴极移动，当溴酚蓝移到凝胶的三分之二处时停止电泳，将凝胶 放在紫外灯上，观察扩增产物中有无梯形DNA条带出现，有梯形DNA条带出 现，样本为阳性；无梯形DNA条带出现，样本为阴性；
方法2):在反应管中加入2pL 10倍浓缩的荧光试剂SYBRGreen I，混匀， 在自然光下观察反应物是否出现绿色荧光，有绿色荧光出现，样本为阳性；无 绿色荧光出现，样本为阴性。
本发明的有益效果本发明构建了用于检测感染性钉螺体内血吸虫基因的 LAMP方法，达到区别血吸虫感染性钉螺和非常感染性钉螺之目的。该方法与 常规的血吸虫感染性钉螺检测方法相比，具有操作简便快速、敏感特异、不需 要特殊的设备等特点，适合于血吸虫病现场防治人员使用。
图l: M、 50bpDNA低分子标志物，1、 LAMP扩增产物，2、阴性对照。 图2: 1、 LAMP扩增产物，2、阴性对照。
图3: M、 100bp DNA低分子标志物，1 10、 DNA模板量分别为10ng， lng， 100pg， 10pg， lpg， 100fg， 10fg, lfg， 0.1 fg,阴性对照。
图4: 1 10、 DNA模板量分别为10ng， lng， 100pg， 10pg， lpg， 100fg， 10fg， lfg， 0.1 fg，阴性对照。
图5: M、 100bpDNA低分子标志物；1、日本血吸虫基因组DNA; 2、华支睾吸虫基因组DNA; 3、恶性疟原虫基因组DNA; 4、大肠杆菌基因组DNA。 图6: 1、日本血吸虫基因组DNA; 2、华支睾吸虫基因组DNA; 3、恶件 疟原虫基因组DNA; 4、大肠杆菌基因组DNA; 5、无离子水对照。
具体实施例方式
实施例l:灵敏性研究
1) 标准靶DNA分子模板的制备
取纯化的阳性对照样本DNA，用TE缓冲液进行稀释10ng， lng， 100pg， 10pg， lpg， 100fg， 10fg， lfg， O.lfg。
2) 、环介导等温DNA扩增与结果判断
取一0.2mLPCR用薄壁管10个，按顺序编号，分别加入如下成分10倍 LAMP缓冲液2.5|iL; dNTP (2mM) 8(iL; 10倍引物混合物2.5pL; 1 9管加入 不同浓度的DNA样本lpL，第10号管为阴性对照加入lpL去离子水；各管再 加入去离子水10juL。混匀，IO(TC水浴煮沸5 min，立即至冰上，加入lpL (8U) BstDNA聚合酶，混匀，短暂离心后置60'C水浴箱保温60min;然后转移到80°C 水浴保温5min。将扩增产物取5)aL与2pL的含0.25%溴酚兰、质量浓度40%蔗 糖水溶液的凝胶载样缓冲液混合，加入凝胶孔中。以l-5V/cm的电压进行电泳， 电泳结束将凝胶放在紫外灯上进行观察，1 8管均有梯形DNA条带山现，荧光 强度逐渐减弱，第9、 IO管没有条带出现为阴性。如附图3所示。
在反应管中加入2iuL 10倍浓縮的荧光试剂SYBR Green I，混匀，在自然光 下观察1 8管均有出现绿色荧光，第9、 IO管没有发生顔色改变。附图4。
说明该方法的敏感性为lfg/^LDNA。
实施例2:特异性研究
分别取血吸虫基因组DNA、肝吸虫基因组DNA，疟原虫基因组DNA，大 肠杆菌基因组DNA，用本发明试剂盒进行扩增，同时以灭菌去离子水做阴性对 照。只有血吸虫基因组出现阳性反应，其余样本均为阴性反应。附图5， 6。
实施例3:现场钉螺样本检测
在血吸虫病流行区现场收集钉螺1000只。提取基因组DNA。用本发明的试 剂盒进行检测，同时以常规PCR方法检测进行对照。结果，IOOO只钉螺用本发 明的环介导同温DNA扩增试剂盒检测有56只钉螺为阳性，阳性率为5.6%，而 用PCR方法检测，有52个钉螺为阳性，阳性率为5.2%,显示环介导等温DNA 扩增方法的敏感性比常规PCR方法的灵敏性高，操作更加简单。
9序 列 表
<210〉 SEQIDNO: 1 <211> 4120 <212> DNA
<213〉 曰本血卩及虫(5b/7/^stosom" y(2pow/cwm)
<400> 1
atcccgctcc cattcgcttg cggggacccc agctgaacag aaatgg犯cg tgcctatgct ttatgacctt tgcccaagta ggctcaacga tctcgcaagc atcaacccaa
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2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4120
<210〉 SEQIDNO.2: <211〉 19 <212> DNA
<400> 2
tgctgcatct ctgaaacgc 19<210〉 SEQ ID NO.3: <211> 18 <212> DNA
<400> 3
gcgcacaatc gactgtct 18
<210> SEQ ID NO.4: <211> 42 <212> DNA
<400〉 4
gagtgaactg agccggttcc ttatccaagc acagtcattc gc 42
<210〉 SEQ ID NO.5: <211> 39 <212> DNA
<400> 5
cgctaccact cgaggccttg cagtcgagga gagcctgtt 39
<210> SEQ ID NO.6: <211> 212 <212> DNA
<400> 6
tgctgcatct ctgaaacgcg tatacaggat ccaagcacag tcattcgctt gacttcacct 60
tgtgaaaata aggaaccggc tcagttcact cttcgtgttt ccggggaccc caccgctacc 120
actcgaggcc ttgctggtgt aggtatagca ctaagtttaa aagctgaaca ggctctcctc 180
gactggattc caatagacag tcgattgtgc gc 21权利要求
1、一种血吸虫感染性钉螺检测试剂盒，其特征是该试剂盒由一套引物混合物，10倍浓缩的环介导等温DNA扩增反应缓冲液，DNA聚合酶，阳性对照样本，阴性对照样本，显色试剂和样本DNA抽提试剂组成；所述的一套引物混合物是由一对外引物和一对内引物组成，其名称和序列如下外引物1SEQ ID NO.2，外引物2SEQ ID NO.3，内引物1SEQ ID NO.4，内引物2SEQ ID NO.5，所述的一对外引物与一对内引物之间的摩尔数比例为1:6～9；所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活性单位为8U/μL；所述10倍浓缩的环介导等温DNA扩增反应缓冲液组成是200mmol三羟甲基氨基甲烷、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、60-120mmol/L硫酸镁、体积百分1％曲拉通-X100、4～10mol/L甜菜碱和16mmol/L的dNTP；所述阳性对照样本为含本发明试剂盒检测的日本血吸虫靶DNA片段的重组质粒；所述的阴性对照样本为灭菌去离子水；所述的显色试剂为10倍浓缩的荧光试剂SYBR Green I溶液；所述的样本DNA抽提试剂包括含50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、体积百分0.5％Tween-20、pH8.0的样本裂解液；10mg/mL蛋白酶K；用0.1mol/L的三羟甲基氨基甲烷溶液平衡到pH8.0的苯酚；氯仿；8mol/L醋酸胺；无水乙醇；70％乙醇；灭菌去离子水。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是一套引物混合物为一对外引物 与一对内引物，外引物与内引物之间的摩尔数比例为1:8;所述的一套引物混合物的组成是外引物K 2pmol;外引物2、 2pmol;内 引物l、 16,ol;内引物2、 16|amol。
3、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是10倍浓縮的环介导等温DNA 扩增反应缓冲液组成，其中硫酸镁的优选浓度为80mmo1,甜菜碱的优选浓度为 8mo1。
4、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是试剂盒中阳性对照样本为曰本 血吸虫基因组DNA的PCR扩增产物与TA克隆质粒pGEM-T连结构建的重组质粒，其中含血吸虫的SEQIDNO,6基因序列；制备的方法以所述外引物对日本血吸虫基因组DNA进行PCR扩增，扩 增产物与TA克隆质粒pGEM-T连结构建的重组质粒，转化大肠杆菌DH5oc，抽 提质粒DNA，经DNA测序确定含靶DNA片段；紫外分光光度计测定质粒DNA 的浓度后再用TE缓冲液稀释到10ng/pL，即为阳性对照样本；TE缓冲液为pH值8.0、含200mmol/L三羟甲基氨基甲烷和lmmol/L四氨 基二乙酸。
5、一种基于环介导等温DNA扩增LAMP的血吸虫感染性钉螺的检测方法， 其特征是通过使用一套特异性引物，利用LAMP技术扩增血吸虫特定DNA片 段区域，观察判断钉螺是否感染了血吸虫；所用的一套特异性引物序列是SEQ ID N0.2 SEQ ID NO.5;利用LAMP技术扩增血吸虫特异性DNA片段区域，该特定区域是日本血 吸虫基因非长未端重复反转录转座子基因AF412214的第20 bp至231 bp之间长 度为212bp的DNA片段；(1) 、钉螺样本DNA的提取将钉螺外壳压破，剪取约3mmS的钉螺肝组 织，置于一个无菌的玻璃匀浆器中，加入0.5mL样本裂解液，手工匀浆，破碎 组织；将匀浆液转移到一无菌的1.5mL塑料离心管中，加入蛋白酶K溶液10pL， 混匀，55。C水浴保温1小时；10， 000rpm离心10min，将上清液转移到一新的 1.5mL塑料离心管中；加入2倍体积苯酚，颠倒混匀200次，再以10， 000rpm 离心10min，将上清液转移到另一的1.5mL塑料离心管中；加入2倍体积氯仿 颠倒混匀200次，再以10， 000rpm离心10min，将上清液转移到另一的1.5mL 塑料离心管中；加入O.l体积8mmol/L醋酸胺，混匀，加入2倍体积无水乙醇， 混匀，以10， 000rpm离心10min，去掉上清液，沉淀物用70%乙醇洗涤2次； 在室温下干燥沉淀物，再加入20pL无菌去离子水溶解沉淀的DNA;(2) 、环介导等温DNA扩增取3个0.2mLPCR用薄壁管，分别标记为阳 性对照管，检测管，阴性对照管；各管中加入如下成分10倍LAMP缓冲液2.5^iL， 2mmoldNTP8pL，引物混合物2.5jxL;阳性对照管加入阳性对照样本DNA lpL; 检测管中加入待检样本DNA lpL;阴性对照管中加入去离子水lpL;最后各管 中加入去离子水10|_iL;混匀，IO(TC水浴煮沸5 min,立即至冰上冷却，加入l|dL 8U的Bst DNA聚合酶，混匀，短暂离心后置6(TC水浴箱保温60min;然后转 移到8(TC水浴保温5min;(3) 、结果判断选用如下两种观察方法之一，观察判断钉螺是否感染了 血吸虫；方法l):将含l吗/ml溴化乙啶的2。/o琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入pH8.0、 含0.04mol/L三羟甲基氨基甲烷和lmmol/L四胺基二乙酸的电泳缓冲液，使凝胶浸于液面下3-5mm，取5fiL扩增产物与2fiL的含0.25%溴酚兰、质量浓度40% 蔗糖水溶液的凝胶载样缓冲液混合，加入凝胶孔中，以l-5V/cm的电压进行电 泳，使样本向阴极移动，当溴酚蓝移到凝胶的三分之二处时停止电泳，将凝胶 放在紫外灯上，观察扩增产物中有无梯形DNA条带出现，有梯形DNA条带出 现，样本为阳性；无梯形DNA条带出现，样本为阴性；方法2):在反应管中加入2pL 10倍浓縮的荧光试剂SYBR Green I，混匀， 在自然光下观察反应物是否出现绿色荧光，有绿色荧光出现，样本为阳性；无 绿色荧光出现，样本为阴性。
全文摘要
一种血吸虫感染性钉螺检测试剂盒及其检测方法，属于寄生虫病传播媒介检测领域。本发明提供一种基于环介导等温DNA扩增技术(LAMP)检测血吸虫感染性钉螺的试剂盒和检测方法，该试剂盒是根据LAMP技术原理，设计扩增日本血吸虫非长未端重复反转录转座子基因(AF412214)的第20bp至231bp之间的DNA片段的6对特异性引物，构建用于检测感染性钉螺体内血吸虫基因的LAMP方法，达到区别血吸虫感染性钉螺和非常感染性钉螺之目的。该方法与常规的血吸虫感染性钉螺检测方法相比，具有操作简便快速、敏感特异、不需要特殊的设备等特点，适合于血吸虫病现场防治人员使用。
文档编号C12Q1/68GK101457258SQ20081024271
公开日2009年6月17日 申请日期2008年12月26日 优先权日2008年12月26日
发明者余传信, 殷旭仁, 琪 高 申请人:江苏省血吸虫病防治研究所