专利名称：一种重组融合蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及一种抑制内皮细胞增殖的重组融合蛋白及其制备
方法和在制药中的应用。
背景技术：
迄今为止，癌症仍为人类健康最大威胁之一，因此抗肿瘤药物始终是世界各国医 药厂商的新药开发重点。传统的肿瘤治疗方法是针对肿瘤细胞，但在治疗过程中，常常由于 肿瘤细胞发生遗传突变而产生抗药性，或由于化疗药物的毒副作用导致整个治疗失败。科 学家们一直在追寻治疗癌症的有效方法。上世纪70年代，哈佛大学的佛克曼教授提出的 抗血管生成疗法为癌症的治疗找到了一条新的途径。这一观点已为大量的研究结果所证 实。以血管为靶点治疗肿瘤已成为肿瘤研究的热点之一，并有多种血管生成抑制剂进入临 床试验阶段。其中，血管抑制素(angiostatin)和内皮抑制素(endostatin)由于其作用 的特异性、无耐药性而越来越受到人们的关注。2005年9月，rH-Endostatin(Endostar) 获得我国国家食品药品监督管理局的批准用于治疗非小细胞肺癌。研究人员发现，来自 于endostatin N端的30个左右的合成短肽，具有与endostatin —样的抗肿瘤、抗转移 活性。同样来自于血纤维蛋白溶酶原，与angiostatin中的Kringlel具有57. 5 %同源 性的Kringle5对毛细血管内皮细胞的增殖抑制效果好于angiostatin。 Endostatin和 angiostatin在肿瘤治疗上不仅因为其自身优势而倍受注目，在不断的实验过程中也逐渐 注意到它们的联合使用更具有协同的抗血管生成作用和抗肿瘤生长作用。已有的实验结果 表明，endostatin和angiostatin联合使用对肿瘤生长的抑制作用更为明显；同时联合治 疗组的抗肿瘤作用比预期的效果强2倍，这进一步表明了 endostatin和angiostatin联合 使用对癌症生长抑制有协同增效作用。然而由于分别生产endostatin和angiostatin的 成本太高，而且如果直接把endostatin和angiostatin组成一融合蛋白分子量比较大(分 子量约65KD) ， 二硫键过多(13对二硫键)，将严重影响目的蛋白的产量与得率，不利于后续 的产业化。
发明内容
本发明的目的是提供一种抑制内皮细胞增殖的重组融合蛋白。 本发明的另一个目的是提供所述重组融合蛋白的制备方法。 本发明还有一个目的是提供所述重组融合蛋白在制药中的应用。 本发明的目的是通过下列技术措施实现的 —种重组融合蛋白，该重组融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No. 2。 编码所述重组融合蛋白的核苷酸序列，优选核苷酸序列为SEQ ID No. 1。 —种基因工程菌株，该菌株能表达所述的重组融合蛋白。 所述的重组融合蛋白的制备方法，包括下列步骤 a.以插入全基因合成片段(编码所述重组融合蛋白的核苷酸序列)的pMD 18-T为模板，以SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4为上下游引物，进行PCR反应，收集PCR产物； b.将PCR产物插入表达载体构建重组表达载体，鉴定，将重组载体转化大肠杆菌； c.转化体发酵培养，诱导表达目的蛋白，收集纯化目的蛋白。 所述的制备方法，其中表达载体为pET25b。 所述的制备方法，其中诱导剂为乳糖、IPTG。 所述的制备方法，其中纯化蛋白采用亲和层析法。 所述重组融合蛋白在制备抑制内皮细胞增殖的药物中的应用， 所述的应用，其中抑制内皮细胞增殖的药物为肿瘤新生血管抑制剂。 具体来说，本发明技术路线如下 1、SMEK基因的设计与获得 SMEK基因包括Endostatin前27个氨基酸及Kringle5两个活性片段，中间用3 个重复的连接肽Gly-Gly-Ser-Gly-Ser连接，从而不影响融合蛋白各自的活性区域。该目 的基因的全序列由上海英骏生物技术有限公司合成，并插入载体pMD 18-T中。根据SMEK 序列，选择原核生物偏爱的密码子，借助于计算机设计两条寡核苷酸链，分别作为上游、下 游引物，并在上游引物5'端加上限制性核酸内切酶Nco I的酶切位点，下游引物5'端加上 限制性内切酶Xhol I的酶切位点，以pMD 18-T(已插入目的基因)为模板，通过聚合酶链 式反应(PCR)法获得SIMEK基因的核苷酸序列。
2、 BL21-pET25b-SIMEK重组基因工程菌的构建 SMEK基因经Nco I、 Xhol I双酶切后插入同样经Nco I、 Xhol I双酶切的载体 pET25b中，构建重组质粒pET25b-SMEK。转化入大肠杆菌BL21 (DE3)中，经菌落PCR法及 双酶切法及测序鉴定筛选得到阳性克隆，，并将重组基因工程菌保种。本发明使用的表达载 体pET25b，在其多克隆位点的3'端融合一段编码6个组氨酸的基因序列，经翻译表达后，融 合蛋白的C端含有6-His-Tag，便于其表达鉴定与分离纯化。
3、工程菌发酵及融合蛋白SMEK的获得 以液体LB为发酵培养基，发酵条件如下新鲜活化重组菌，接种于LB培养基(氨 节青霉素50ii g/mL) ，37°C，215r/min培养3h，加入终浓度为0. 5 %的乳糖，20°C ， 150r/min 诱导12h，收集菌体。菌体经超声破碎，镍柱亲和层析及采用去内毒素亲和填料处理样品后 获得内毒素含量小于2. 5EU/mg的纯品。用15% SDS-PAGE检测表达产物SMEK的纯度。
本发明的第二个方面是该重组蛋白的用途，如上所述，此种重组融合蛋白能够抑 制内皮细胞的增殖，进一步，能够抑制肿瘤新生血管的形成。
本发明的有益效果 本发明创造性地把endostatin N端的活性片段和Kringle5连接起来，利用基因 工程的方法构建重组蛋白SMEK(分子量仅约为16KD，其中只有三对二硫键)，以发挥两者 在抑制内皮细胞增殖和抗肿瘤方面的作用。
图1为重组质粒pET25b-SMEK的构建示意图。 图2为SMEK基因的PCR扩增图。(泳道M为DNA Marker :1200bp， 900bp， 700bp， 500bp， 300bp， 100bp ;泳道1为PCR扩增样品；泳道2为PCR扩增样品)
4
图3为菌落PCR鉴定图。(泳道M为DNA Marker ;泳道1_9为单菌落克隆)
图4为SMEK在BL21 (DE3)中的表达电泳图。(泳道1为无诱导的整菌；泳道2为 蛋白质Marker :94. 0KDa，66. 2KDa，45. 0KDa，35. 0KDa，26. 0KDa，20. OKDa， 14. 4KDa ;泳道3为 37tH秀导整菌；泳道4为2(TC诱导整菌) 图5为SIMEK细胞定位电泳图(泳道1为整菌；泳道2为超声沉淀；泳道3为超声 上清) 图6为不同乳糖浓度对SMEK表达量的影响 图7为SIMEK蛋白纯化图(泳道1-2为纯化后SIMEK ;泳道3为蛋白质Marker)
图8为不同浓度的SMEK抑制HUVEC细胞增殖的检测结果
图9为不同浓度的SIMEK抑制BCE细胞增殖的检测结果
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述
材料 宿主菌E. Coli BL21 (DE3)是基因工程常用的工具菌种，在与基因工程研究有关的 实验室一般都有保存。质粒pET25b购自Novagen公司。 酶和试剂分子克隆工具酶和试剂为Takara公司产品；质粒抽提试剂盒、PCR回收 试剂盒和PCR纯化试剂盒为Qiagen公司产品。
PCR模板和引物由Invitrogen公司合成。 LB培养基蛋白胨1.0X (g/ml)，酵母粉0.5X，氯化钠1.0X，其余为水。蛋白胨， 酵母粉为Oxoid公司产品。
方法 分子生物学操作方法质粒提取、聚合酶链反应、限制性核酸内切酶酶切、DNA片 段回收、连接和大肠杆菌转化实验在基因工程研究领域都是常规操作方法，参见《分子克隆 实验指南》。 重组蛋白表达量采用SDS-PAGE方法测定参见《蛋白质技术手册》。
实施例1 :重组质粒pET25b-SMEK的构建 本发明人工合成了 SIMEK基因序列，并根据此序列，选用大肠杆菌偏爱的密码子， 在计算机的辅助下设计出2条寡核苷酸片段。上游引物序列为:5，-GCCCATGGCATAGCCACCG CGACTTC-3'(划线处为Nco I的酶切位点)(SEQ ID No. 3)。下游引物序列为:5，-GCCTCGAG GGCCGCACACTGAGGGAC-3'(划线处为Xhol I的酶切位点)(SEQ ID No. 4)。重组质粒构建示 意图如图l所示。 通过PCR获得SIMEK基因94。C ， lmin， 60°C ， 50s， 72°C ， lmin，共30个循环；72。C ， 10min。扩增结果如图2所示，在400bp左右有一明显扩增条带。将扩增获得的PCR产物经 试剂盒纯化后用限制性核酸内切酶Nco I和Xhol I消化，与用相同限制性内切酶消化的 pET25b质粒连接。取已连接的产物转化至E. coli T0P10宿主菌中，用菌落PCR扩增及双酶 切方法筛选阳性克隆。菌落PCR扩增图见图3，从图中可以看出单克隆样品6、8、9在400bp 处有扩增条带，初步鉴定是阳性克隆。经测定，质粒中插入的SMEK基因序列正确。
实施例2 :SIMEK融合蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3)中的表达
用构建正确的质粒pET25b-SMEK转化E. coli BL21 (DE3)表达菌后，接种单菌落 于LB液体培养基(含50i!g/mL氨苄青霉素)中37。C过夜，按1 %的接种量转接于新鲜的 LB液体培养基(含50 ii g/mL氨苄青霉素)中，37。C培养3h，加入终浓度为l.OmMIPTG诱导 大肠杆菌表达目的蛋白SIMEK5。菌体经离心回收后，用SDS-PAGE电泳检测，经扫描显示重 组融合蛋白SMEK的表达量占细菌总蛋白的30X左右，结果见图4。根据pET操作手册，对 目的蛋白SIMEK的表达进行细胞定位，结果见图5。从图中可以看出，目的蛋白部分以可溶 形式表达，部分以包含体形式表达。大肠杆菌中包含体的形成主要是由于启动子很强，蛋白 表达效率高，来不及正确折叠，因此降低诱导温度可以适当增加可溶形式的表达。
实施例3 :SIMEK的表达优化 已有的实验表明，乳糖可以很好地替代IPTG诱导目的蛋白的表达。而且，乳糖不 仅是一种诱导剂，同时还可以作为很好的碳源，有利于提高工程菌的生物量。本发明考察了 不同乳糖浓度对目的蛋白表达量的影响。具体结果见图6，从图中可以看出，乳糖和IPTG均 可以诱导目的蛋白的表达。乳糖作为诱导剂，可以明显提高菌的生物量及目的蛋白的表达 量。故以后实验采用0.5%的乳糖作为诱导剂。
实施例4 :SMEK融合蛋白的制备 从新鲜转接的平皿中挑取单菌落接入LB液体培养基中，37t:培养至对数期作为 一级种子，以1 %接种量接入到含70mL LB培养基的500mL摇瓶中，37°C ， 215rpm培养3h后， 加入0. 5%乳糖2(TC诱导12h，以8500rpm离心5min收集菌体。用超声波破碎细胞，即每 lg湿菌体加入lOmLA相缓冲液(25mM咪唑，lmol/L氯化钠，0. 01mol/L PBS，pH7. 2_7. 4)，超 声破碎30min，10000rpm，4。C离心45min，收集上清。用Ni-NTA进行柱层析，用含45mmo1/ L咪唑到含270mmol/L咪唑梯度洗脱，具体洗脱条件如下45mmol/L、70mmol/L、 170mmol/L、 270mmol/L咪唑浓度下分别洗脱5个柱床体积，分布收集进行SDS-PAGE电泳检测，SIMEK在 170mmol/L咪唑洗脱峰中，用SDS-PAGE电泳检测样品的纯度。如图7所示，经Ni-NTA纯化 后的样品可以达到电泳纯。 实施例5 :SMEK抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及小牛主动脉内皮细胞(BCE)增 殖实验 HUVEC (购自Cascade公司)培养至第四代，用培养基(M200+5. 0 % FBS+2. 0 % LSGS)重悬，按照100iil，3000个/孔的细胞量接种至96孔板中，培养过夜，使细胞贴壁。 弃去培养液，添加新的完全培养基(M200+5. 0% FBS+2. 0% LSGS)诱导细胞增殖，同时加入 药物及对照物，阳性对照为5-FU，阴性对照是用相同剂量的PBS代替药物，培养72h。待 培养至相应的时间后，加入10 yl CCK8试剂，孵育4h后，检测450nm波长下的光吸收值。 M200 (Media 200)是HUVEC常用的培养基，CCK8 (cell countingkit)，类似MTT，用于细胞计 数。 BCE细胞购自美国clonetics公司，抑制细胞增殖检测方法同HUVEC细胞增殖实 验。 结果如图8，9所示，实验结果表明融合蛋白SMEK能明显抑制HUVEC细胞的增殖。 给药剂量为250ii g/mL时，抑制率可以达到58. 86%。同样，SMEK也可以抑制BCE细胞的 增殖，但没有明显的剂量依赖关系。相同剂量的蛋白对正常的小鼠成纤维细胞NIH3T3没有 明显的抑制作用，说明该蛋白主要作用于内皮细胞。
序列表
〈110〉江苏先声药物研究有限公司
〈120〉 一种重组融合蛋白及其制备方法和.
〈160>4
〈210>1
〈211>420
〈212>DNA
〈213〉人工序列
应用
〈400>1 cat age
His 1
朋c Asn
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gag Glu
tac Tyr
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Asp
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45
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60
cag 225
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75
cca 270
Pro
90
aac 315
Asn
105
cca 360
Pro
120
cac 405
His
135
420
7
〈210〉2〈211>140<212>PRT〈213〉人工序列〈400>2His Ser HisArg AspPheGinProValLeuHis Leu Val Ala Leu151015Asn Ser ProLeu SerGlyGlyMetArgGlylie Arg Gly Gly Ser202530Gly Ser GlyGly SerGlySerGlyGlySerGly Ser Pro Asp Val354045Glu Thr ProSer GluGluAspLysMetPheGly Asn Gly Lys Gly505560Tyr Arg GlyLys ArgAlaThrThrValThrGly Thr Pro Cys Gin657075Asp Trp AlaAla GinGluProHisArgHisSer lie Phe Thr Pro808590Glu Thr AsnPro ArgAlaGlyLeuGluLysAsn Tyr Cys Arg Asn95100105Pro Asp GlyAsp ValGlyGlyProTrp CysTyr Thr Thr Asn Pro110115120Arg Lys LeuTyr AspTyrCysAspValProGin Cys Ala Ala His125130135His His HisHis His140<210>3〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>3gcccatggcatagccaccgc gacttc 26〈210〉4〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>4gcctcgagggccgcacactg agggac 26
8
权利要求
一种重组融合蛋白，该重组融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2。
2. 编码权利要求l所述重组融合蛋白的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述重组融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No. 1。
4. 一种基因工程菌株，其特征在于该菌株能表达权利要求1所述的重组融合蛋白。
5. 权利要求1所述的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于包括下列步骤a. 以插入编码所述重组融合蛋白的核苷酸序列的pMD 18-T为模板，以SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 4为上下游引物，进行PCR反应，收集PCR产物；b. 将PCR产物插入表达载体构建重组表达载体，鉴定，将重组载体转化大肠杆菌；c. 转化体发酵培养，诱导表达目的蛋白，收集纯化目的蛋白。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于表达载体为pET25b。
7. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于诱导剂为乳糖、IPTG。
8. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于纯化蛋白采用亲和层析法。
9. 权利要求1所述重组融合蛋白在制备抑制内皮细胞增殖的药物中的应用
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于抑制内皮细胞增殖的药物是肿瘤新生血 管抑制剂。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及一种重组融合蛋白及其制备方法和应用。该重组融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2。该重组融合蛋白能够抑制内皮细胞的增殖，发挥抗肿瘤的作用。
文档编号C12N1/21GK101768219SQ200810242790
公开日2010年7月7日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者原雪, 文勇, 殷晓进, 陈亚利, 陈悦 申请人:江苏先声药物研究有限公司