结肠癌的早期检测和预后的制作方法

专利名称：：结肠癌的早期检测和预后的制作方法
技术领域：
：本发明涉及癌症诊断和治疗的领域。特别地，它涉及在结肠癌和初癌(pre-cancer)中特定基因的异常甲基化模式(形式，pattern)。
背景技术：
：DNA甲基化和它在癌发生中的作用制造所有活生物的细胞的信息包含在它们的DNA中。DNA是由四个碱基的独特序列组成，四个碱基为腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。在形成DNA双螺旋的两条链上，这些碱基A与T和G与C配对。这些碱基对的链存储制造分组成被称为基因的区域的具体分子的信息。在每一个细胞里面，具有控制什么基因被开启或表达的程序，从而确定每个细胞的独特功能。这些控制机制之一是通过将甲基加到胞嘧啶(C)上而提供。甲基标记的C可以写成mC。DNA甲基化在确定是否一些基因被表达或者不被表达中起到重要的作用。通过关闭不需要的基因，DNA甲基化是生物体正常发育和发挥功能的必不可少的控制机制。可选地，异常的DNA甲基化是引起随着老化和多种癌症的发生而观察到的变化的机制之一。癌症在过去与在DNA内由染色体突变引起的基因变化联系起来。突变一一遗传性的或获得性的——可以导致对于维持健康状态至关重要的基因表达的丧失。现在证据支持，相当大数量的癌症由不适宜的DNA甲基化，频繁接近的DNA突变所引起。在许多情况下，DNA的过度甲基化不正确地关闭至关重要的基因例如肿瘤抑制基因或者DNA修复基因，从而使得癌症能够发生和进展。这种控制基因表达的非突变过程被描述为外因遗传学(或表观遗传学，epigenetics)。DNA甲基化是通过称为甲基转移酶的酶来进行的DNA化学修饰，在其中甲基基团(m)被加到DNA的某些胞嘧啶(C)。这种非突变的(外遗传的)过程(mC)是基因表达调控中的关键因素，参见J.G.Herman,SeminarsinCancerBiology,9:359-67，1999。虽然基因甲基化的现象已经引起癌症研究者的注意有一段时间，但是它在人的癌症发展中的真正作用刚被认识到。在正常的细胞中，甲基化主要发生在具有很少CG碱基重复的DNA区域中，而CpG岛，具有长CG碱基重复的DNA区域，仍然保持非(未)甲基化。控制蛋白表达的基因启动子区域通常是富含CpG岛的。在启动子区域中这些正常的非甲基化CpG岛的异常甲基化导致在人癌症中某些肿瘤抑制基因表达的转录失活或者沉默。在肿瘤细胞中的过度甲基化的基因对于肿瘤来源的组织是非常特异的。所有类型癌症的分子特征可以用于改进癌症的检测、癌症风险的评估和对治疗的反应。启动子过度甲基化事件为这些目的提供了一些最有希望的标记。启动子基因过度甲基化有希望的肿瘤标记关于特定启动子基因的过度甲基化的信息可以有益于各种癌症的诊断、预后和治疗。特定基因启动子区域的甲基化可以在早期和经常在癌发生中出现，使得这些标记成为癌症诊断的理想靶标。甲基化模式是肿瘤特异的。阳性信号总是在基因的相同位置被发现。实时PCR为基础的方法是高度灵敏的、定量的和适合于临床使用。DNA是稳定的和发现在容易获得的流体(例如血清、痰、粪便、血液和尿)和石蜡包埋组织中是完整的。一系列有关的基因标记可以覆盖大多数人类癌症。诊断改善在癌症患者中的临床结果的关键是在癌症的最早阶段的诊断，在此期间癌症仍然是局部的和容易治疗的。上文提到的特征通过在分子基础上鉴定较高风险患者提供了更准确地筛查和监测计划的手段。它也为对患者进行更明确的随访(followup)提供了理由，所述患者具有与恶性病相关的分子特征，但是还没有与恶性病相关的所有病理或者临床特征。在目前，结肠直肠癌的早期检测是通过以下几种方法来进行的(l)"粪便潜血试验"(FOBT)，它具有非常低的灵敏度和特异性，(2)乙状结肠镜检查和/或结肠镜检查，它具有侵入性并且是昂贵的(以及供应有限)，(3)在双重对比钡餐灌肠后的X射线检査，其仅允许检查相当大的息肉，或者CT-结肠镜检查(也被称为虚拟结肠镜检查)，它仍然是实验性的，和(4)称为PreGen-Plus的基因突变分析试验(ExactSciences;LabCorp)，它是昂贵的且灵敏度有限。预测治疗反应[13]关于癌症如何通过分子事件发展的信息将使得临床医生能够更准确地预测这种癌症对特定的化疗剂可能怎样反应。这样，根据肿瘤的化学敏感性的知识可以理性地设计治疗方案(regimen)。研究已经显示，在神经胶质瘤患者中的MGMT启动子的过度甲基化表明对治疗的良好反应、更大的总生存率和进展需要更长时间。现在充分确立了，在人的癌症中正确基因功能的丧失可以通过遗传和外遗传机制来发生(1、2)。在人的肿瘤样品中突变基因的数量正在被阐明。最近，Sj5blom等(3)测序了在结肠直肠癌(CRC)和乳腺癌中的13,023个基因，发现每个肿瘤平均11个突变，这提示了相对少量的遗传事件可能足够促使肿瘤发生。相比之下，外遗传改变的整个图谱没有被充分描述。最详细说明的癌基因外遗传学改变涉及在与受影响基因的转录失活相关的启动子区域中，成簇的CpG二核苷酸或者CpG岛的DNA过度甲基化。这些启动子接近所有基因的几乎一半而定位(4)，并且认为这些启动子在正常的体细胞组织中基本上保持无甲基化。在任何特定的肿瘤中的这种外遗传损害的精确数量不是准确已知的，虽然不断增加数量的随机筛查方法正在鉴定不断增加数量的候选基因(5-12)，但是这些方法中没有一个方法有效覆盖全基因组。考虑到在基因组中存在大量潜在目标启动子，我们假定还有很多过度甲基化的基因等待发现(13)。在本领域中有对改善患者护理管理的针对癌症的新的诊断和预后标记以及治疗耙标的持续的需求。发明概述依照本发明的一方面，提供鉴定结肠直肠癌或者它的前体、或结肠直肠癌倾向的方法。在含有结肠直肠细胞或者来自结肠直肠细胞的核酸的试样中检测外遗传沉默。外遗传沉默是选自以下的至少一个基因BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GP雇B、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。当外遗传沉默被检测到时，试样被鉴定为含有细胞，所述细胞是瘤性的(增殖性的)、瘤的前体、或易于形成瘤，或者鉴定为含有来自细胞的核酸，所述细胞是瘤性的、瘤的前体、或易于形成瘤。依照本发明的另一个方面，提供了减少或者抑制细胞瘤性(增殖性)生13长的方法，所述细胞显示了与癌症相关的至少一种基因的外遗传沉默的转录。外遗传沉默的基因在细胞中被确定。所述基因选自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GP顧B、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、F0XQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。通过将细胞与一种或者多种试剂接触恢复外遗传沉默基因编码多肽在细胞中的表达，所述试剂选自CpG二核苷酸脱甲基剂、DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。不受调节的细胞生长因而被减少或者抑制。本发明的另一方面是减少或抑制细胞的瘤性生长，该细胞显示了与癌症相关的至少一种基因的外遗传沉默转录。外遗传沉默基因在细胞中被确定。所述基因选自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3禾nZNF655。编码多肽的多核苷酸被引入到细胞中。多肽被所述基因表达。多肽在细胞中被表达，因而恢复多肽在细胞中的表达。本发明的还另一方面是治疗癌症患者的方法。患者的癌细胞被确定具有选自以下的外遗传沉默的基因BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、F0XL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、祌经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、脂F182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。一种或者多种选自CpG二核苷酸脱甲基剂、DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂的试剂以足够量给予患者，以恢复在患者的癌细胞中外遗传沉默基因的表达。本发明的还另一方面是治疗癌症患者的方法。患者的癌细胞被确定具有选自在以下显示的外遗传沉默的基因BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、認F182、ICAM5、A腹CX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、IXR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEI、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPON1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。编码多肽的多核苷酸被给予患者。多肽由外遗传沉默的基因编码。多肽在患者的肿瘤中进行表达，从而恢复多肽在癌症中的表达。依照本发明的另一方面，提供了选择治疗癌症患者的治疗策略的方法。基因被鉴定，该基因在患者癌细胞中的表达通过CpG二核苷酸脱甲基剂、DNA甲基转移酶抑制剂或者组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂再激活。基因选自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、F0XL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。为癌症患者选择治疗剂，该治疗剂增加基因的表达，用于治疗所述癌症患者。本发明的另一个实施方式是评估试样中甲基化的试剂盒。试剂盒包括至少以下试剂(a)修饰甲基化的胞嘧啶残基、但不修饰非甲基化的胞嘧啶残基的试剂，或者(b)修饰非甲基化的胞嘧啶残基、但不修饰甲基化的胞嘧啶残基的试剂；和一对寡核苷酸引物，其在扩增条件下与大约lkb的所述基因转录起始位点内的基因区域特异性杂交，所述基因选自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GP画B、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、F0XE1、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655中显示的基因。附图简述和表格图1A-1E.在HCT116CRC细胞中鉴定人癌细胞的过度甲基化组(hypermethylome)的方法。(图1A)来自标示细胞系的RNA被分离、标记、杂交、扫描，以及荧光点强度通过减去背景来归一化和使用AgilentTechnologies44K人微阵列进行黄土转变(Loesstransformation)。在我们的研究中比较了亲本野生型HCT116细胞(WT)和DNA甲基转移酶1(DNMTW-)或者3b(DNMT3b-/0的同基因敲除对应物。DKO细胞对于DNMT1和DNMT3b是双重缺陷的。(图IB)在具有各种DNA甲基转移酶的遗传中断的HCT116细胞中，基因表达变化。三维散布图以对数单位指出了在HCT116细胞中的基因表达水平，所述细胞具有DNMTs1(X轴)、3b(Z轴)和两种DNMT(DKO;Y轴)的遗传中断。对于DKO细胞中具有大于4倍表达变化的那些基因，单个基因表达的变化为黑色，对三个实验的平均值(红色点)或者来自单个实验(蓝色点)。(图1C)HCT116细胞用300nM曲古柳菌素A(TSA)处理18小时或者用5pM的5-脱氧氮杂胞苷(DAC)处理96小时，如前所述处理。(图ID)对于用TSA(X轴)或者DAC(Y轴)处理的HCT116细胞的基因表达变化通过倍数变化来绘图。黄色点指出来自DKO细胞具有2倍和2倍以上变化的基因。当与在DKO细胞中看到的基因表达增加比较时(在DKO细胞中大于2倍现在变成了在DAC处理的细胞中大于1.3倍)，注意到敏感性的丧失。绿色点指出了随机选择的基因，其已被证实在野生型细胞中具有完整的启动子甲基化、在DKO细胞中和在AZA处理后的重新表达，而红色点指出了经鉴定为假阳性的选择基因(参见确认结果的图5(S2))。蓝色点指出了11种引导基因的位置——这11种引导基因在先前表现为过度甲基化的和在这个研究中使用的HCT116细胞中为完全沉默的(参见图4(SI)的描述)。包括11种引导基因中的5种的独特组的基因显示了在用DAC处理后大于2倍的增加、而用TSA处理后没有增加。这些基因形成了在文本中讨论的候选过度甲基化基因的顶部列。(图IE)通过树状图分析来鉴定全转录物组表达型的关联性。DNMT1和3b、DKO的个体单个遗传中断以及DAC处理和TSA处理各自形成三个不同类别的基因表达变化。16[24]图2A-2C.在不同的人CRC细胞系中表征人癌细胞过度甲基化组。(图2.A)用TSA(X轴)或者DAC(Y轴)处理的指示细胞的基因表达变化通过倍数变化来绘图，单个基因用黑色来显示。(图2B)DNA过度甲基化组的确认。由用DAC或者TSA处理细胞来限定的过度甲基化基因的特有峰(spike)由2个具有不同特征的层组成。上层基因鉴定为这样的区域，在该区域中，基因表达不随着TSA增加(<1.4倍)，并且在野生型细胞中没有显示出可检测的表达，但是用DAC处理后有大于2倍的增加。下层的基因被鉴定为一组基因，其表达变化与在上层中的相同、但是用DAC处理增加1.4倍至2倍之间。通过RT-PCR和MSP确认基因表达，表明在HCT116细胞中上层基因86%的确认频率，包括在DKO细胞中增加2倍以上的基因。在HCT116细胞中下层基因被确认在49%的频率，和在SW480上层中具有65%的频率。(图2C)在CRC细胞系中共有的候选过度甲基化基因。我们鉴定了在所有6个细胞系中具有落入上层或者下层类别标准的表达变化的总共5,906个基因。指出了在2、3、4、5或者6细胞系当中基因表达变化的重叠；这些的范围从2个细胞系中共有的1414个基因，到6个细胞系中共有的78个基因。图3A-3E.在人肿瘤样品中过度甲基化和基因突变频率的比较。(图3A)在人组织样品中验证的过度甲基化组基因的甲基化分析。来自验证的基因清单的二十种基因从HCT116上层(BOLL、DDX43、DKK3、FOXL2、HoxDl、JPH3、Nef、神经化的、PPPlR14a、RAB32、STK31、TLR2)、HCT116下层(SalL4、TP53AP1)或者SW480上层(ZFP42)中随机地选择，并且分析在CRC细胞系(白色柱)、正常结肠(红色柱)或者原发性肿瘤(绿色柱)中的甲基化。甲基化的百分比在Y轴上示出，和縮写的基因名称在X轴上。我们测试了至少6种不同的细胞系、来自非癌症患者的16到40个结肠样品和18到61个之间的原发性CRC样品的每种基因。(图3B)CAN基因的甲基化分析。56种基因鉴定为重叠了过度甲基化组和CAN基因列单，包括含有CpG岛的45种基因。来自这个列单的、在细胞系中具有甲基化的选择的基因(26种基因)，被在分析在正常结肠(图3B)和原发性CRC(图3C)中的甲基化。这些基因的甲基化频率以百分比显示。(图3D)重叠了CAN和过度甲基化组基因列单的13种基因的甲基化和突变之间的关系。(图3E)在人癌症中基因失活机制的模型。图4A-D.(Sl).在这个研究中使用的引导基因。(图4A)先前显示在HCT116细胞中被过度甲基化和完全沉默的U种引导基因的基因名称、AgilentTechnologies探针名称、Genbank登录号和参考。(图4B)蓝色点和基因名称指出在TSA(X轴)对DAC(Y轴)基因表达变化图中或者在(图4C)DKO(X轴)对单个敲除(Y轴)基因表达变化的图中的ll种引导基因的位置，以对数表示。用绿色圈出的11种引导基因中的5种在用AZA处理后显示了大于2倍的增加，但是用TSA处理后没有增加，这些同样的基因并且在DKO细胞中(绿色圆圈)中有大于3倍的增加。(图4D)在DKO和DAC图中引导基因的直接比较。由绿色圆圈示出的不同组的5种引导基因限定了如在本文中所讨论的候选过度甲基化基因的上层，5种引导基因在DKO细胞中显示出大于3倍的表达变化和在DAC处理的细胞中显示出大于2倍的表达变化。在用DAC处理后增加1.3倍的另外三种基因和未增加的3种基因允许基因表达的下层的标准建立起来，如在文中所述。[27]图5.(S2).在HCT116细胞中35种上层基因的基因表达和甲基化确证。HCT116候选过度甲基化基因的清单，其被选择用于表达(通过HCT116和DKO细胞的RT-PCR)和启动子甲基化(通过HCTU6和DK0细胞的MSP)状况的确证。基因描述在图的左边示出，基因名称在PCR结果后示出。水(RT-PCR和MSP)、在体外甲基化DNA(MSP的IVD)和肌动蛋白B(ACTB)用为每一单个基因的对照；显示了代表性的样品。绿色箭头鉴定验证了阵列结果的基因，红色箭头鉴定那些没有验证阵列结果的基因。图6.(S3.)35种HCT116候选下层基因的清单，其被选择用于确证表达(通过HCT116和DKO细胞的RT-PCR)和启动子甲基化(通过HCT116禾nDKO细胞的MSP)状况。在图的左边示出了基因名称，基因名称在PCR结果后面显示。水(RT-PCR和MSP)、体外甲基化DNA(MSP的IVD)和肌动蛋白B(ACTB)用作每一单个基因的对照；显示了代表性的样品。绿色箭头鉴定验证了阵列结果的基因，红色箭头鉴定那些没有验证阵列结果的基因，如文中所论述地。图7.(S4.)48种SW480候选上层基因的清单，其被选择用于确证表达(通过SW480禾PDAC处理的SW480细胞的RT-PCR)和启动子甲基化(通过SW480和DAC处理的SW480细胞的RT-PCR)状况。在图的左边指出了基因名称，基因名称在PCR结果后面显示。水(RT-PCR)、体外甲基化DNA(MSP的IVD)和肌动蛋白B(ACTB)用作每一单个基因的对照；显示了代表性的样品。绿色箭头鉴定验证了阵列结果的基因，红色箭头鉴定那些没有验证阵列结果的基因，如文中所论述地。图8.(表S1.)过度甲基化组大小的定量估计。细胞系和层在左边指出，和每层中鉴定的基因表达变化的数量也被示出。关于每层候选过度甲基化基因库的大小的计算通过每层鉴定的基因表达变化乘以0.86(HCT116的上层)、0.65(SW480、CaC02、HT29、COLO320和RKO的上层)或者0.49(HCT116、SW480、CaC02、HT29、COLO320和RKO下层)来进行。这些分数代表了实验所确定的确认频率，如在本文所描述的。HCT116过度甲基化组大小的估计源于如下532的86%=457上层基因加上1190的49%=583下层基因；457+583=1040。依照如下计算，SW480过度甲基化组估计在579个基因318上层的66%=207和759下层的49%=372;207+372=579。过度甲基化组基因清单和在乳腺癌或者结肠癌中突变的基因之间的重叠在右边显示。18[31]图9.(表l)关于在序列表中的序列的信息。基因编号基因流水号。基因名称在专利中使用的基因名称。基因ID:NCBI系统的基因ID。与基因ID相关的转录物ID:来自ENSEMBL注释系统的所有转录物IDs，与具有相同TSS[转录起始位置；注意，基因ID可以具有多个TSS，因而多转录物IDs通过它们的TSS来分组]的特定基因ID相关。SEQIDNO:l-125:基因组序列前后序列(从转录物TSS的5'1000bp，到转录物TSS3'的200bp);如在NCBIbuild36中发现的基因组DNA序列。SEQIDNO:126-250:亚硫酸氢盐转化形式的序列，假设所有CpG二核苷酸的全甲基化存在。图10-截止比(ratiocut-off)20的散射图BNIP3。图11-截止比20的散射图F0XE1。图12-截止比100的散射图SYNE1。图13-截止比300的散射图SOX17。图14-截止比20的散射图JAM3。图15-截止比150的散射图MMP2。说明这个标记在76个对照和卯个病例中进行了测试。图16-截止比150的散射图GPNMB。说明这个标记在76个对照和90个病例中进行了测试。发明详述我们描述了人类全转录物组微阵列筛査来鉴定在人类CRC中被启动子过度甲基化所沉默的基因。这种方法容易以高的证实效率在单个肿瘤中鉴定候选癌基因。通过比较一系列候选过度甲基化基因与最近在CRC(3)中鉴定的突变基因，我们建立了改变的肿瘤基因组和基因过度甲基化组之间关键的关系。我们的研究提供了理解表观和遗传的改变如何促使人肿瘤发生的平台。我们描述了基因表达方法，对于可获得代表性细胞培养系的任何人类癌症类型，该方法具有确定大部分癌基因启动子CpG岛DNA过度甲基化组的能力。对这些基因的研究将有助于理解促使肿瘤发生的分子通路、提供有用的新DNA过度甲基化生物标记来监测癌症风险评估、早期诊断和预后，并且允许在癌症预防和/或治疗策略期间更好地监测基因再表达(13,22)。通过由我们方法发现的过度甲基化组基因与由基因组广泛测序策略(genomewidesequencingstrategy)鉴定的突变基因的直接比较，我们证明了在任何特定的肿瘤中存在比遗传变化基因多许多的外遗传(表观)变化基因。这个事实的重要性在我们的发现中显现对于受两种机制影响的新发现的基因，在结肠癌中任何特定基因的过度甲基化的发生率显得比突变高得多。因此，在特定的癌类型中，由于未能筛査遗传和表观遗传异常，本领域技术人员可能明显地低估全范围的基因改变和相关的细胞通路异常。数据也指出，比单独遗传分析所预测的，评估基因功能丧失的两种机制对于通路中断在个体结肠肿瘤中显示出更多的共性(sharing)。我们的发现强调，依照在关键通路中的分子改变对肿瘤分类的最佳方法应该依赖于确定遗传和表观基因变化。因此，我们的发现应该促进在癌症中绘制异常基因变化的任何基因广泛策略，从而考虑应该检査突变基因的启动子DNA过度甲基化和DNA过度甲基化基因应该放在进行测序以发现突变的优先位置。使用这种技术，我们已经发现了一组基因，它们的转录在癌、癌前体和初癌中被外遗传沉默。这些基因包括BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化的(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。检测到这些基因的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个的外遗传沉默可以用作癌或者初癌或者发展癌的风险的指示。基因的外遗传沉默可以通过在本领域中任何已知的方法确定。一种方法是确定在正常细胞或者其它对照细胞中表达的基因在肿瘤细胞中较少表达或者不表达。然而这种方法本身不能够指出沉默是外遗传性的，因为沉默的机制可能是遗传的，例如通过体细胞突变。一种确定沉默是外遗传的方法是用试剂如DAC(5'-去氮杂胞苷)(5'-deazacytidine)或者用改变细胞DNA的组蛋白乙酰化状况的试剂来处理，或者影响在细胞中的外遗传机制的任何其它处理，并且观察沉默被逆转，也就是基因的表达被再激活或者恢复。另一种确定外遗传沉默的方法是确定在沉默基因中甲基化的CpG二核苷酸基序的存在。典型地，这些存在于转录起始位置的附近，例如在大约lkbp之内、大约在750bp之内或者大约在500bp之内。一旦基因被鉴定为在肿瘤细胞中外遗传沉默的靶标，减少表达的确定可以用作外遗传沉默的指示物。基因的表达可以使用本领域已知的任何方法来评估。典型地，表达可以在试样和对照样品中评估和比较，对照样品是正常的、非恶性的细胞。试样可以含有癌细胞或者初癌细胞或者来自它们的核酸。例如，样品可以含有结肠腺瘤细胞、结肠晚期腺瘤细胞或者结肠癌细胞。mRNA(核酸)或者蛋白可以被测量。可以使用应用与核酸探针杂交的方法测量具体的mRNAs。这些方法包括使用核酸探针阵列(微阵列技术)、原位杂交和使用Northern印迹。信使RNA也可以使用扩增技术如RT-PCR来评估。基因组技术中的进步现在允许同时分析数千个基因，虽然许多是根据特定探针-靶标杂交的相同概念。测序为基础的方法是可选的；这些方法开始时使用表达的序列标签(EST)，并且现在包括基于短标签的方法，例如基因表达系列分析(SAGE)和大规模平行特征测序(MPSS)。差别显示技术提供了分析基因表达的另外方法；这类技术基于由限制性消化产生的cDNA片段的随机扩增，以及在两种组织之间不同的带鉴定感兴趣的cDNA。特定的蛋白可以使用任何常规方法来评估，包括但不限于免疫测定和免疫细胞化学术。大部分这些方法将使用对特定的蛋白或者蛋白片段特异的抗体。本发明的标记的mRNA(cDNA)和蛋白的序列在本领域是已知的和可以公开得到的。甲基化敏感的限制性内切核酸酶可以用于检测甲基化的CpG二核苷酸基序。这种核酸内切酶可以相对于非甲基化识别位点而优先剪切甲基化识别位点，或者相对于甲基化识别位点而优先剪切非甲基化的识别位点。前者的例子是AceIII、Banl、BstNI、MspI和XmaI。后者的例子是AceII、Aval、BssHII、BstUI、Hpall和NotI。可选地，可以使用选择性地修饰甲基化的或者非甲基化形式的CpG二核苷酸基序的化学试剂。修饰产物可以直接检测或者在产生容易辨别的产物的进一步反应之后进行检测。检测改变的大小和/或电荷的方法可以用于检测修饰的产物，方法包括但不限于电泳、色谱和质谱。这种选择性修饰的化学试剂例子包括肼和亚硫酸氢盐离子。肼修饰的DNA可以使用哌啶处理来剪切它。亚硫酸氢盐离子处理的DNA可以用碱来处理。其它依赖特定序列的方法也可以使用，包括但不限于杂交、扩增、测序和连接酶链反应。如果期望，可以使用这些技术的组合。电泳的原理是通过它们的大小和电荷来分离核酸。存在用于检测甲基化的许多测定方法，并且大部分依赖于确定特定核酸产物的有无。在实验室中为了此目的经常使用凝胶电泳。本领域技术人员可以使用MALDI质谱结合甲基化检测分析来观察核酸产物的大小。质谱的原理是对核酸进行离子化和依照它们的质荷比来分离它们。类似于电泳，本领域技术人员可以使用质谱来检测在实验中产生的特定核酸以确定甲基4fc。参见Tost,J.等，AnalysisandaccuratequantificationofCpGmethylationbyMALDImassspectrometry.NucAcidRes,2003,31,9。一种形式的色谱，高效液相色谱用于根据被分析物质与色谱柱之间的各种化学相互作用来分离混合物的成分。DNA首先用亚硫酸氢钠来处理，其将未甲基化的胞嘧啶转化成为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶残基保持不受影响。本领域技术人员可以经过PCR扩增含有潜在甲基化位置的区域和通过变性高效液相色谱(DHPLC)来分离产物。DHPLC具有区别甲基化的(含有胞嘧啶)和没有甲基化的(含有尿嘧啶)DNA序列的分辨能力。参见Deng,D,等，SimultaneousdetectionofCpGmethylationandsinglenucleotidepolymorphismbydenaturinghighperformanceliquidchromatography.2002NucAcidRes,30,3。[50]杂交是根据两条互补核酸链的退火形成双链分子来检测特定核酸序列的技术。杂交使用的一个例子是用于确定DNA甲基化状况的微阵列分析。在亚硫酸氢钠处理DNA之后——其将未甲基化的胞嘧啶转变成为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶残基保持不受影响，与潜在甲基化位点互补的寡核苷酸可以与亚硫酸氢盐处理的DNA杂交。寡核苷酸被设计成与含有尿嘧啶的序列或者含有胞嘧啶的序列互补，其分别代表了未甲基化的和甲基化的DNA。以计算机为基础的微阵列技术可以确定哪个寡核苷酸与DNA序列杂交，并且本领域技术人员可以推断DNA的甲基化状况。确定在亚硫酸氢钠处理后结果的另外的方法将会是对DNA测序，以直接观察任何亚硫酸盐的修饰。焦磷酸测序(Pyrosequecing)技术是通过合成测序的实时方法。它基于焦磷酸盐(PPi)的间接生物光度计分析(bioluminometricassay)，焦磷酸盐(PPi)是当DNA链延伸时从每个脱氧核苷酸(dNTP)中释放。这种方法在核酸外切酶缺陷的KlenowDNA聚合酶存在的情况下呈现带有dNTP的DNA模板-引物复合体。四种核苷酸以预先确定的顺序依次加到反应混合物中。如果核苷酸与模板碱基互补并因而被加入，那么PPi被释放。PPi和其它试剂用作在荧光素酶反应中的底物，荧光素酶反应产生通过光度计或者电荷耦合装置检测的可见光。产生的光与加到DNA引物的核苷酸数量成比例，并且产生以热解图的形式存在的指示核苷酸数量和类型的峰。焦磷酸测序可以利用在DNA的亚硫酸氢钠转化后产生的序列差异。各种扩增技术可以在产生可辨别产物的反应中使用。这些技术的一些利用PCR。其它合适的扩增方法包括连接酶链反应(LCR)(Barringer等，1990)、转录扩增(Kwoh等.1989;WO88/10315)、目标多核苷酸序列的选择性扩增(美国专利6,410,276)、共有序列引发的聚合酶链反应(美国专利4,437,975)、随机引发的聚合酶链反应(WO90/06995)、核酸序列依赖性扩增(NASBA)(美国专利5,409,818;5,554,517;6,063,603)、切口置换扩增(nickdisplacementamplification)(WO2004/067726)。反映原始基因组DNA中CpG二核苷酸处的甲基化状况的序列变化提供了PCR引物设计的两种方法。在第一种方法中，引物自身不"覆盖"任何潜在的DNA甲基化位点或者不与任何潜在的DNA甲基化位点杂交；在不同甲基化的位点处的序列变化位于两引物之间。这种引物被用在亚硫酸氢盐基因组测序、COBRA、Ms-SNuPE中。在第二种方法中，引物设计为特异地与甲基化的或者未甲基化形式的转化序列退火。如果与靶标具有足够的互补性区域，例如12、15、18或20个核苷酸，那么引物也可以含有另外的不干扰杂交、但对于其它操作有用的核苷酸残基。这种其它残基的例子可以是限制性内切核酸酶剪切、配体结合或者因子结合或连接体或重复序列的位点。寡核苷酸引物可以是或者可以不是这种对修饰的甲基化残基特异的。22200880010320.8区别修饰和未修饰的DNA的一种方式是杂交寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物特异地结合到DNA的一种形式或者另一种形式。在杂交后，可以进行扩增反应和测定扩增产物。扩增产物的存在表明与引物杂交的样品。引物的特异性表明DNA是否已经被修饰或未被修饰，其转而表明DNA是否已经被甲基化或未甲基化。例如，亚硫酸氢盐离子修饰非甲基化的胞嘧啶碱基，将它们变为尿嘧啶碱基。在杂交条件下，尿嘧啶碱基与腺嘌呤碱基杂交。因此，包含替代鸟嘌呤碱基的腺嘌呤碱基的寡核苷酸引物会与亚硫酸氢盐修饰的DNA杂交，而含有鸟嘌呤碱基的寡核苷酸引物会与DNA中未修饰的(甲基化的)胞嘧啶残基杂交。使用DNA聚合酶和第二引物的扩增产生能够容易被观察到的扩增产物。这种方法被称为MSP(甲基化特异性PCR;专利5,786,146;6,017,704;6,200,756)。扩增产物可以任选地杂交特异的寡核苷酸探针，而特异的寡核苷酸探针对某些产物也可以是特异的。可选地，可以使用将与来自修饰和未修饰DNA的扩增产物杂交的寡核苷酸探针。区别修饰和未修饰的DNA的另一种方式是使用对于某些产物也可以是特异的寡核苷酸探针。这类探针可以直接与修饰的DNA或者修饰的DNA的扩增产物杂交。可以使用本领域已知的任何检测系统来标记寡核苷酸探针。这些包括但不限于荧光部分、放射性同位素标记的部分、生物发光部分、发冷光的部分、化学发光的部分、酶、底物、受体或者配体。鉴定甲基化的CpG二核苷酸的还有另外一种方式是利用McCP2蛋白的MBD结构域选择性地结合到甲基化DNA序列的能力(Cross等，1994;Shiraishi等，1999)。限制性内切核酸酶消化的基因组DNA被加载在表达的His标记的甲基CPG结合结构域上，CPG结合结构域被固定到固体基质和用于制备型柱层析来分离高度甲基化的DNA序列。实时化学术使得能在反应的早期阶段期间检测PCR扩增，和使得DNA和RNA的定量更容易和更准确。实时PCR的少数变化是已知的。它们包括TaqManTM系统和MolecularBeacon(分子信标)TM系统，它们具有分开的用荧光团和荧光淬灭剂标记的探针。在ScorpionTM系统中，发夹结构形式的标记的探针被连接到引物。用许多技术已经成功进行了DNA甲基化分析，其包括MALDI-TOFF、MassARRAY、MethyLight、乙基化等位基因的定量分析(QAMA)、酶区域甲基化测定(ERMA)、HeavyMethyl、QBSUPT、MS-SNuPE、MethylQuant、定量PCR测序和寡核苷酸为基础的微阵列系统。其沉默被测试和/或检测的基因数量可以变化一、二、三、四、五或者更多种基因可以被测试和/或检测。在一些情况下，选择至少两种基因。在另外的实施方式中，选择至少三种基因。[60]可以进行诊断性测试或者结合治疗方案进行测试。测试可以用于监测治疗方案的效力，无论是化学治疗剂或者生物试剂如多核苷酸。测试也可以用于确定什么样的治疗或者预防方案应用到患者上。而且，测试也可以用于把患者分成几组用于测试试剂和确定它们在各组患者上的效力。用于诊断、预后或者个体化医学用途的测试样品可以从以下获得外科手术样品如活组织检查或者细针抽出液，石蜡包埋结肠、直肠、小肠、胃、食管、骨髓、乳腺、卵巢、前列腺、肾、肺、脑等器官组织，体液如血液、血清、淋巴、脑脊液、唾液、痰、支气管灌洗液、导管流体粪便、尿液、淋巴结或精液。这些来源不是意欲穷尽性的，而是示例性的。从这些样品或者流体中获得的测试样品包括分离的肿瘤细胞和/或从死亡或者损伤肿瘤细胞中释放的游离核酸。核酸包括RNA、基因组DNA、线粒体DNA、单或双链和蛋白结合的核酸。从这种样品细胞获得的纯化或未纯化形式的任何核酸样品可以用作起始核酸(一种或多种)。脱甲基剂可以与细胞在体外或者体内接触，目的是恢复细胞的正常基因表达。合适的脱甲基剂包括但不限于5-氮杂-2'-脱氧胞苷、5-氮杂-胞苷、泽布拉恩(Zebularine)、普鲁卡因和L-乙硫氨酸。这个反应可以用于诊断、用于确定倾向和用于确定合适的治疗方案。如果脱甲基剂用于治疗结肠癌、头颈癌、食管癌、胃癌、胰腺癌或肝癌，可以测试基因的表达或者甲基化，所述基因选自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3禾口ZNF655。恢复外遗传性沉默的基因表达的可选方式是将非甲基化的多核苷酸引入细胞，这样它将在细胞中表达。各种基因治疗载体和媒介物在本领域中是已知的和任何一种可使用的适合于特定的情况。某些载体适合于短期表达，而某些载体适合于长时间表达。某些载体对于某些器官是有关营养的并且这些载体可以在特定情况下适当使用。载体可以是病毒的或者非病毒的。多核苷酸可以但不是必要的包含在载体例如病毒载体中，并且其可以配制在例如基质中，如脂质体、微泡。通过将多核苷酸给予对象使得其接触细胞并被细胞吸收，多核苷酸可以被引入细胞，并且编码的多肽被表达。优选地，特定多核苷酸将是患者已经被对其测试和被发现携带沉默形式的多核苷酸。用于治疗结肠癌、头颈癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌的多核苷酸将典型地编码选自以下的基因BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、F0XL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、F0XE1、F0XQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SAIX4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。通过将脱甲基剂给予对象，将通常显示出甲基化沉默基因表达的细胞与与脱甲基剂体内接触。如果方便，可以使用例如导管插入术方法给予脱甲基剂，给予的地方在对象中显示不受调节生长的细胞的位置或者附近，或者给予进入到血流到细胞位置的血管中。类似地，如果待被处理的器官或者其部分可以通过分路方法被分离，试剂可以通过分路给予，因而实质上将试剂提供到含有细胞的位置。试剂也可以全身给予或者通过本领域已知的其它途径给予。除了多肽编码序列外，多核苷酸可以包括可操作地连接的转录调控元件、翻译调控元件等，和多核苷酸可以是裸露DNA分子的形式，其可以包含在载体中或者其可以配制在基质如脂质体或微泡中，这帮助多核苷酸进入特定的细胞中。术语"可操作地连接的(operativdylinked)"指的是两个或者多个相互放置的分子，这样它们作为单一的单元起作用和实现可归因于一个或者两个分子或者其组合的功能。编码期望多肽的多核苷酸序列可以可操作地连接到调控元件，在这种情况下，调控元件以类似于这样的方式在多核苷酸上赋予它的调控作用，在该方式中，调控元件会影响在细胞中其与之正常联系的多核苷酸序列。编码待被给予哺乳动物或者人或待与细胞接触的期望多肽的多核苷酸可以含有启动子序列——启动子序列可以提供多核苷酸的组成型，或者如果期望，诱导型或者组织特异性或者发育阶段特异性表达、多聚腺苷酸(polyA)识别序列和核糖体识别位点或者内部核糖体进入位点或者其它调控元件如增强子，其可以是组织特异的。载体也可以含有在原核或者真核宿主系统或两者中复制所需要的元件，如所期望的。这种载体一一包括质粒载体和病毒载体如噬菌体、杆状病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、牛痘病毒、塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus)和腺病相关病毒载体——是众所周知的和可以从商业来源购买(Promega,MadisonWL;Stratagene,LaJollaCA.;GIBCO/BRL,GaithersburgMD.)或者可以由本领域技术人员来构建(参见例如Meth.Enzymol,，Vol.185,Goeddel，ed.(AcademicPress,Inc.,1990);Jolly,Cane.Gene.Ther.1:51-64,1994;Flotte,J.Bioenerg.Biomemb.25:37-42,1993;Kirshenbaum等.，J.Clin.Invest.92:381-387,1993;它们中的每一个在此引入作为参考)。[67]四环素(tet)诱导型启动子可以用于促使编码期望多肽的多核苷酸的表达。当将四环素或者四环素类似物给予含有可操作地连接到tet诱导型启动子的多核苷酸的对象时，编码多肽的表达被诱导。多核苷酸可选地可以被可操作地连接到组织特异性调控元件，例如肝细胞特异性调控元件如a胎蛋白启动子(Kanai等.,CancerRes.57:461-465，1997;He等.，J.Exp.Clin.CancerRes.19:183-187,2000)或者白蛋白启动子(Power等.，Biochem,Biophys.Res.Comm.203:1447-1456，1994;Kuriyama等.，Int.J.Cancer71:470-475,1997);肌细胞特异性调控元件如肌红蛋白启动子(Devlin等.，J.Biol.Chem.264:13896-13901,1989;Yan等.，J.Biol.Chem.276:17361-17366，2001);前列腺细胞特异性调控元件如PSA启动子(Schuur等.,J.Biol.Chem.271:7043-7051,1996;Latham等.，CancerRes.60:334-341，2000);胰腺细胞特异性调控元件如弹性蛋白酶启动子(Ornitz等.，Nature313:600-602,1985;Swift等.，GenesDevel.3:687-696,1989);白细胞特异性调控元件如增白细胞蛋白(leukosialin)(CD43)启动子(Shelley等.，Biochem.J.270:569-576,1990;Kudo和Fukuda,J.Biol.Chem.270:13298-13302，1995)等，这样多肽的表达限制于个体中的特定细胞或者限制于在培养中，例如在器官培养中的混合细胞群中的特定细胞。包括组织特异性调控元件在内的调控元件在本领域中是众所周知的(参见例如InvivoGen;SanDiegoCalif.)，许多组织特异性调控元件是商业可获得的。病毒表达载体可以用于将多核苷酸引入细胞中，特别是受试者的细胞中。病毒载体提供了它们能够以相对高的效率感染宿主细胞和能够感染特定细胞类型的优势。例如，编码期望多肽的多核苷酸可以被克隆进入杆状病毒载体，其随后可以用于感染昆虫宿主细胞，由此提供了产生大量的编码多肽的方法。病毒载体已被开发用在特定宿主系统，特别是哺乳动物系统中，病毒载体包括例如逆转录病毒载体、其它慢病毒载，如那些基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、肝炎病毒载体、牛痘病毒载体等(参见Miller和Rosman,BioTechniques7:980-990,1992;Anderson等.，Nature392:25-30Suppl.,1998;Verma和Somia,Nature389:239-242,1997;Wilson,NewEngl.J.Med.334:1185-1187(1996)，它们中的每一篇在此引入作为参考)。多核苷酸——其可以任选地包含在载体中——可以通过在本领域中已知的各种方法中的任一种被引入细胞(Sambrook等.，supra，1989;Ausubel等.，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Baltimore,Md.(1987禾口supplementsthrough1995)，它们中的每一篇在此引入作为参考)。这些方法包括例如转染、脂转染、显微注射、电穿孔和用病毒载体进行的感染；和可以包括应用脂质体、微乳液等，脂质体、微乳液等可以帮助将多核苷酸引入细胞和可以保护多核苷酸在引入细胞之前免于降解。特别有用的方法包括使多核苷酸并入微泡，微泡可以注射入循环中。可以放置超声源，这样超声被传送给肿瘤，其中由于超声，含有多核苷酸的循环微泡在肿瘤位置被破裂，因此在癌症的位置提供多核苷酸。特定方法的选择将依赖于例如多核苷酸被引入的细胞以及细胞是否在培养中或在体内原位位置。通过用病毒载体感染而将多核苷酸引入细胞可以有效地将核酸分子引入细胞。而且，病毒是非常特异的，并可以根据在一种或者几种特定细胞类型中的感染和繁殖的能力，来选择病毒作为载体。因此，它们天然的特异性可以用于将包含在载体中的核酸分子靶向特定的细胞类型。基于HIV的载体可以用于感染T细胞、基于腺病毒的载体可以用于例如感染呼吸道上皮细胞、基于疱疹病毒的载体可以用于感染神经细胞等。其它载体，如腺相关病毒可以具有更大的宿主细胞范围，因而可以用感染各种细胞类型，虽然病毒或者非病毒载体也可以用特定的受体或者配体修饰，以通过受体介导的事件来改变靶标特异性。本发明的多核苷酸或者含有多核苷酸的载体可以包含在细胞，例如宿主细胞中——宿主细胞使得含有多核苷酸的载体得以繁殖，或者辅助细胞中——辅助细胞使得含有多核苷酸的病毒载体得到包装。多核苷酸可以短暂地包含在细胞中，或者可以由于例如整合进入细胞基因组中而被稳定维持。由基因(BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、A函CX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345或ZNF655)编码的多肽可以直接给予到在受试者中显示出不受调节的生长的细胞部位。如果期望的话，多肽可以使用本文公开的方法产生、分离和配制，并且多肽可以与细胞接触，这样多肽可以穿过靶细胞的细胞膜。多肽可以作为融合蛋白的一部分提供，融合蛋白包括有利于转运通过细胞膜的肽或者多肽成分。例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)TAT蛋白转导结构域或者核定位结构域可以融合到感兴趣的标记。给予的多肽可以配制在基质中，基质帮助多肽进入细胞。虽然在这里提到了特定多核苷酸和多肽序列作为已知基因和蛋白的代表，但是本领域技术人员会理解，在数据库中的序列代表了在特定个体中存在的序列。来自其它个体的任何等位基因序列也可以使用。这些典型地与公开的序列变化1-10残基、l-5个残基或者l-3个残基。而且，等位基因序列与数据库序列典型地具有至少95、96、97、98或者99%的同一性，同一性如使用运算法则如BLAST同源性工具进行测量。27[73]试剂如脱甲基剂、多核苷酸或多肽典型地配制在适合给予受试者的组合物中。因此，本发明提供了含有试剂的组合物，该试剂可用于恢复细胞受调节的生长，该细胞由于一种或者多种基因的甲基化沉默转录而显示出不受调节的生长。试剂作为治疗患有与这种不受调节生长相关的病理状况的受试者的药物是有用的。这种药物通常包括载体。可接受的载体在本领域中是众所周知的和包括例如水溶液诸如水或者生理缓冲盐水或者其它溶剂或者媒介物如乙二醇、丙三醇，油如橄榄油或者可注射的有机酯。可接受的载体可以含有生理上可接受的化合物，化合物起例如稳定或者增加结合物的吸收的作用。这种生理上可接受的化合物包括例如糖类如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂、低分子量蛋白或者其它稳定剂或者赋形剂。本领域技术人员会知道或者能够容易地确定可接受载体，包括生理上可接受的化合物。载体的性质依赖于治疗剂的物化性质和组合物的给药途径。治疗剂或者药物的给予可以通过口服途径或肠胃外途径例如静脉内、肌内、皮下、经皮、鼻内、支气管内、阴道、直肠、瘤内途径或者在本领域中已知的其它方法进行。药物组合物也可以含有一种或者多种另外的治疗剂。治疗剂可以包含在封装材料里面，例如包含在水包油乳液、微乳液、胶束、混合胶束、脂质体、微球体、微泡或者其它聚合物基质中(参见例如Gregoriadis，LiposomeTechnology,Vol,1(CRCPress,BocaRaton,Fla.1984);Fraley,等.，TrendsBiochem.Sci.,6:77(1981)，它们中的每一个在此引入作为参考)。例如由磷脂或其它脂类组成的脂质体是无毒的、生理上可接受的可代谢载体，其制备和施用相对简单。"隐形(Stealth)"脂质体(参见例如美国专利5,882,679;5,395,619;和5,225,212，它们中的每一篇在此引入作为参考)是这种封装材料的例子，其对于制备在本发明方法中有用的组合物特别有用，另外其它"掩蔽(masked)"脂质体可以类似地使用，这种脂质体延长治疗剂停留在循环中的时间。例如阳离子脂质体也可以用特定的受体或者配体进行修饰(Morishita等.，J.Clin.Invest,91:2580-2585(1993)，其在此引入作为参考)。另夕卜，多核苷酸剂可以使用例如腺病毒多聚赖氨酸DNA复合物引入细胞中(参见例如Michael等.，J.Biol.Chem.268:6866-6869(1993),其在此引入作为参考)。含有治疗剂的组合物的给药途径将部分依赖于分子的化学结构。多肽和多核苷酸例如口服输送不是有效的，因为它们在消化道中可被降解。然而，例如可以使用化学修饰多肽的方法，使它们更不易被内源性蛋白酶降解，或者使它们更容易通过消化道吸收(参见例如Blondelle等.，supra,1995;Ecker和Crook,supra,1995)。在实施本发明的方法中给予的试剂总量可以作为单剂量——或者作为大丸剂或推注剂(弹丸，bolus)或者通过在相对短的时间段中输注——给予受试者，或其可以使用分次治疗方案进行给予，在分次治疗方案中多剂量在长时间段中给予。本领域技术人员会知道，在受试者中治疗病理症状的组合物的量依赖于多种因素，包括受试者的年龄和总体健康以及给药途径和给予的治疗次数。考虑到这些因素，本领域技术人员会根据需要调整具体的剂量。一般而言，最初使用I期和II期临床试验来确定组合物的配方和给药的途径及频率。组合物可以配制用于口服制剂，例如片剂或者溶液或者悬浮液的形式；或者组合物可以包含与适合于肠内或者非肠道应用的有机或者无机载体或者赋形剂的混合物，和可以例如与常用、无毒、药学上可接受的载体化合，用于制备片剂、丸剂、胶囊、栓剂、溶液、乳剂、悬浮剂或者其它适合应用的形式。除了在以上所公开的那些载体外，载体可以包括葡萄糖、乳糖、甘露糖、阿拉伯胶、明胶、甘露醇、淀粉糊、三硅酸镁、滑石、玉米淀粉、角蛋白、胶体二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素，中链长度甘油三酯、葡聚糖和适合用于制造固体、半固体或液体形式的制备物的其它载体。另外，辅助剂、稳定剂、增稠剂或者着色剂和香料也可以应用，例如稳定干燥试剂如丙酮糖(triulose)(参见例如美国专利5,314,695)。虽然通过使用标记的组合可以获得诊断和预后的准确性和灵敏性，例如5或者6种标记、或者9或10种标记、或者14或15种标记的组合，但是实际考虑可能决定使用更小的组合。特定癌症的标记的任何组合可以被使用，所述组合包含2、3、4或5种标记。考虑到本文提供的单个标记的具体公开，可以容易地想到2、3、4或5种标记的组合。差别甲基化GpG岛的甲基化水平可以提供关于疾病或者癌症的各种信息。它可以用于在个体中诊断初癌或者癌症。初癌或者癌症前体是癌症的非常早的阶段，它在结肠的最里(腔层)层中发现。它有时称为浅表癌(superficialcancer)。可选地，它可以用于预测在个体中疾病或者癌症的过程，或者预测在个体中对疾病或者癌症的易感性，或者对个体中疾病或者癌症的进展进行分级。它可以帮助预测整体存活的可能性或预测疾病或癌症再次发生的可能性，并确定个体所经历的疗程的有效性。当检测时，与参考水平相比的甲基化水平增加或者减少和增加/减少的改变提供了有用的预后和诊断价值。预后的方法可以用于鉴定可能发展为癌的腺瘤患者。这种预测可以根据在腺瘤中相对于正常的组织在表1(图9)中所鉴定的至少一种基因的外遗传沉默来进行。这些患者可以被提供另外合适的治疗或者预防选择，包括内镜息肉切除术或者切除术，和当指出时，包括外科手术、化疗、放疗、生物反应调节剂或其它疗法。这些患者也可以接受进一步诊断或者监测程序的建议，诊断或者监测程序包括但不限于增加频率的结肠镜检查、乙状结肠镜检查、虚拟结肠镜检查、视频囊内镜检查、PET-CT、分子成像或其它成像技术。治疗癌症患者的治疗策略可以根据外遗传沉默基因的再激活进行选择。首先鉴定选自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TXR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、F0XE1、F0XQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655的基因，所述基因在患者癌细胞中的表达通过去甲基化试剂再激活或者外遗传沉默。随后选择增加基因表达的治疗。这种治疗可以包括给予再激活剂或者多核苷酸。可选地可以给予多肽。依照本发明的试剂盒是用于测定甲基化的试剂的集合体。它们典型地在含有所有成分的包装中，任选地包括说明书。包装可以分开，以便各成分不混合，直到希望混合时。成分可以处于不同的物理状态。例如，一些成分可以是冻干的，而一些在水溶液中。一些成分可以是冷冻的。在试剂盒内，单个的成分可以分开包装。试剂盒可以含有如上描述的用于差异性修饰甲基化和非甲基化胞嘧啶残基的试剂。理想地，试剂盒将含有寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物与基因/标记的转录起始位置的lkb内的区域特异性杂交，所述基因/标记为BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXEl、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。典型地，试剂盒将包含单个基因或者标记的正向和反向引物。如果具有足够的互补区域，例如12、15、18或20个核苷酸，那么引物也可以包含另外的核苷酸残基，这些核苷酸残基不干扰杂交，但是对其它操作可能是有用的。这种其它残基的例子可以是限制性内切核酸酶剪切的位点，用于配体结合或者用于因子结合或者连接体或者重复序列的位点。寡核苷酸引物可以或者可以不对修饰的甲基化残基是特异的。试剂盒可任选地含有寡核苷酸探针。探针可以对含有修饰的甲基画残基的序列或者对含有非甲基化残基的序列是特异的。试剂盒可以任选地含有修饰甲基化胞嘧啶残基的试剂。试剂盒也可以含有用于进行扩增的成分，例如DNA聚合酶和脱氧核糖核苷酸。检测工具也可以在试剂盒中提供，包括在引物或者探针上的可检测的标记。试剂盒也可以含有用于检测本发明的一种标记(表l;图9)的基因表达的试剂。这些试剂可以包括例如探针、引物或者抗体。在酶或者配体的情况下，底物或者结合伴侣可以用于评估标记的存在。在这个实施方式的一方面，基因与肼接触，肼修饰胞嘧啶残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基，随后肼处理的基因序列与试剂如哌啶接触，该试剂在肼修饰的胞嘧啶残基处剪切核酸分子，由此产生包含片段的产物。通过使用例如电泳、色谱或者质谱的方法依照分子量分离片段，并比较该分离形式与类似处理的相应非甲基化基因序列的分离形式，缺口在含有甲基化胞嘧啶残基的测试基因中的位置上是明显的。因此，缺口的存在指示了在测试细胞的耙基因的CpG二核苷酸中胞嘧啶残基的甲基化。亚硫酸氢盐离子例如亚硫酸氢钠将非甲基化的胞嘧啶残基转化为亚硫酸氢盐修饰的胞嘧啶残基。亚硫酸氢盐离子处理的基因序列可以被暴露于碱性条件，碱性条件将亚硫酸氢盐修饰的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶残基。亚硫酸氢钠容易与胞嘧啶的5,6-双键反应(但是与甲基化的胞嘧啶反应很差)形成磺酸化的胞嘧啶反应中间产物，中间产物易于脱氨基，产生磺酸化的尿嘧啶。磺酸盐基团可以通过暴露于碱性条件来除去，引起尿嘧啶的形成。DNA可以例如通过PCR扩增，并进行测序来确定在样品的DNA中CpG位置是否被甲基化。尿嘧啶被Taq聚合酶识别为胸腺嘧啶，而当PCR时，生成的产物仅在起始模板DNA中5-甲基胞嘧啶存在的地方含有胞嘧啶。本领域技术人员可以比较在测试细胞的亚硫酸氢盐离子处理的基因序列中尿嘧啶残基的量或者分布与类似处理的相应非甲基化基因序列中的尿嘧啶残基的量或者分布。在测试细胞的基因中尿嘧啶残基的量或者分布的减少表明在测试细胞基因的CpG二核苷酸中胞嘧啶残基的甲基化。尿嘧啶残基的量或者分布也可以通过如下步骤检测将亚硫酸氢盐离子处理的目标基因序列与寡核苷酸接触、随后暴露于碱性条件并检测寡核苷酸的选择性的杂交(或者其不存在)，所述寡核苷酸选择性地与目标基因的核苷酸序列杂交，该目标基因或者含有尿嘧啶残基或者缺少尿嘧啶残基，但不是两者。测试化合物可以被测试它们治疗癌症的潜力。用于测试的癌细胞可以选自前列腺癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌。确定选自那些在表l(图9)中列出的基因的表达，如果表达在细胞中被化合物增加，或者如果基因的甲基化在细胞中被化合物减少，本领域技术人员可以鉴定该化合物具有作为治疗癌症的潜力。可选地，这些测试可以用于确定食管癌、头颈癌、胃癌、小肠癌、胰腺癌、肝癌患者对化疗剂的反应。患者可以用化疗剂进行治疗。如果选自BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、SOX17、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、31ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、F0XE1、F0XQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3禾PZNF655的基因的表达在癌细胞中被化合物增加，或者如果基因的甲基化在癌细胞中被化合物减少，该化合物可以被选择用于治疗患者。以上公开总体描述了本发明。所有在本文公开的参考文献通过引用明确并入。更完整的理解可以通过参考以下具体的例子来获得，其在本文提供仅仅为了举例说明的目的，而不是意欲限制本发明的范围。实施例实施例l材料和方法细胞培养和处理。HCT116细胞和等基因遗传敲除衍生物如在以前描述(14)地来维持。对于药物处理，对数期CRC细胞在McCoys5A培养基(Invitrogen)中培养96小时，McCoys5A培养基含有10%BCS和lx青霉素/链霉素与5的5氮杂-脱氧胞苷(DAC)(Sigma;储液lmM，在PBS中)，每24小时更换培养基和DAC。用300nM曲古柳菌素A(Sigma;储液溶解在乙醇中的1.5mM)处理细胞18小时。对照细胞平行进行模拟处理，加入没有药物的等体积PBS或者乙醇。微阵列分析。依照制造商的指导——包括DNA酶消化步骤，使用Triazol(Invitrogen)和RNeasy试剂盒(Qiagen)从对数期细胞收获总RNA。使用NanoDr叩ND-100，接着用2100Bioanalyzer(AgilentTechnologies)进行质量评价，对RNA定量。个体样品的RNA浓度大于200ng/ul、28s/18s比率大于2.2,和RNA完整值为10(10为最高分)。使用低RNA输入荧光线性扩增试剂盒(LowRNAInputFluorescentLinearAmplificationKit)(AgilentTechnologies)，依照制造商的指导，进行样品扩增和标记过程。标记的cRNA用RNeasy小型试剂盒(Qiagen)纯化和定量。在扩增之前，RNA示踪对照(RNAspike-incontrol)(AgilentTechnologies)加入到RNA样品中。标记有Cy3或Cy5的0.75微克样品与对照靶标(AgilentTechnologies)混合，依照Agilent微阵列方案聚集在寡微阵列(OligoMicroarray)上、杂交和处理。用AgilentG2565BA微阵列扫描仪，使用AgilentTechnologies推荐的设置进行扫描。数据分析。所有阵列进行制造商所推荐的质量检查。视觉检查图像的假象，检测信号的分布和红和绿两个通道的背景强度以鉴定异常的阵列。没有观察到不规则，并且保留和使用所有阵列。使用R统计计算平台(23)和来自Bioconductor生物信息软件项目(24)的程序包进行所有的计算。红信号与绿信号的对数比在减去背景和LoEss归一化后进行计算，如在Bioconductor(25、26)的半度软件包(limmapackage)中所执行地。单个阵列换算到有相同的四分位数(inter-quartile)范围(第75个百分位数-第25个百分位数)。对于染色交换重复(dye-swapreplicate)微阵列，对数倍数变换进行平均，以产生每种条件的单一的一组表达值。甲基化和基因表达分析。依照制造商的指导，用TRIzol试剂(Invitrogen)分离RNA。对于反转录-PCR(RT-PCR)，1吗的总RNA通过使用Ready-To-GoTMYou-PrimeFirst-StrandBeads(AmershamBiosciences)进行反转录，力口入随丰几六聚体(每个反应0.2吗)。对于RT-引物设计，我们使用Primer3(http:〃frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)。对于MSP分析，依照标准的酚-氯仿提取方法提取DNA。使用EZDNA甲基化试剂盒(ZymoResearch)进行基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。使用MSPPrimer(http:ASvww.mspprimer.org)，设计对未甲基化和甲基化启动子序列特异的引物序列。MSP如以前描述(20)进行。所有PCR产物(50|al总体积的15^1用于RT-PCR和25^1总体积的7.5|_d用于MSP)直接加样在含有GelStarNucleicAcidGelStain(CambrexBioScience)的2%琼脂糖凝胶上，并在紫外线照射下可视化。根据要求，用于MSP、亚硫酸氢盐测序和RT-PCR的引物序列和条件可从作者得到。人肿瘤分析。来自原发性CRC的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织从DepartmentofPathologyoftheUniversityHospitalMaastricht的档案库获得。获得了马斯特里赫特大学(MaastrichtUniversity)、马斯特里赫特大学医院(UniversityHospitalMaastricht)和美国约翰霍普金斯大学医院(JohnsHopkinsUniversityHospital)的医学伦理委员会的批准。使用PuregeneDNA分离试剂盒(GentraSystems)分离DNA。实施例2对于过度甲基化依赖基因表达变化的综合鉴定，我们的第一步通过在基因组宽表达阵列为基础的方法中比较野生型HCT116CRC细胞与携带两种主要人类DNA甲基转移酶的单独和组合的基因删除的等基因伴侣细胞来进行(图1A，14)。重要地是，在""Z)iVMn6"A)双敲除(DKO)HCT116细胞中——其实际上完全丧失了全部的5-甲基胞嘧啶，所有以前单个检查的过度甲基化基因——在野生型细胞中缺少基本表达——经受了伴随基因重新表达的启动子脱甲基化(14-17)。通过依照在44KAgilentTechnologies阵列平台上的改变的信号强度将基因分级，当与等基因野生型亲代细胞或者等基因细胞系比较时，我们观察到了在DKO细胞中基因表达增加的独特峰，在等基因野生型亲代细胞或者等基因细胞系中DNMT的1或3b已经被个别地删除，其包含在DNA甲基化中最小的变化(图IB)。[94]根据我们以前的方法，我们使用药理学策略测试了我们的方法，但是现在被明显地改良以提供全转录物组覆盖(19),以鉴定在任何癌细胞系中沉默的过度甲基化基因。对于致密的过度甲基化的和转录无活性的基因，DNA脱甲基剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(DAC)具有充分确立的诱导基因重新表达的能力(18)。另一方面，对于这些相同的基因，I和II类HDAC抑制剂曲古柳菌素A(TSA)将不单独诱导重新表达(19)。在用DAC或者TSA处理HCT116细胞后(图1C)，我们鉴定到这样的区域，在其中基因表达没有随着TSA增加(<1.4倍)和在模拟处理的细胞中没有显示可检测的表达。在这个区域内，我们观察到了DAC诱导的基因表达的特征峰，其与在DKO细胞中所看见的基因表达增加相重叠(比较在图1D中黄色点与在图1B中的蓝色点)。由于DAC整合入分裂细胞的DNA，而我们的处理仅仅进行了96小时，与DKO细胞相比，在药理学方法中检测基因增加的灵敏性被降低。这个基因峰的鉴定完全依赖于对没有对HDAC抑制作出反应的唯一的基因进行分析，被簇分析加强，簇分析显示了在DKO和DAC处理细胞的基因之间的亲密关系，在TSA单独处理后，DKO和DAC处理的细胞具有单独分组的基因表达变化(图1E)。这些数据确认了覆盖很少基因组的先前研究，在其中，带有致密CpG岛的被TSA再表达的基因没有包含可检测的甲基化(19)。基因表达增加的类似峰可以在5种另外的人CRC细胞系(SW480、CaC02、RKO、HT29和COL0320)中看见，确认了这种方法在癌细胞系中普遍起作用(图2A)。实施例3为了说明我们新阵列方法鉴定CpG岛过度甲基化基因的灵敏性，我们首先检查了在HCT116细胞中11种已知被过度甲基化、完全沉默和在DAC处理后重新表达的基因(图4(S1A))(14-17)。所有测试的基因保持在TSA未反应区内(图4(S1B和C))，在DAC处理和DKO细胞中，表达变化的方向充分关联(图4(S1D))。重要地是，对于DAC增加，5种指导基因(45%)增加2倍或者2倍以上，以及另外3种基因或者总共73%的基因增加1.3倍或者1.3倍以上。根据在DKO与DAC诱导基因增加之间所观察到的灵敏性差异和指导基因在阵列平台中的行为，在TSA阴性区域内，我们指定了基因的上层(2倍增加或者以上)和下层(1.4倍至2倍之间的增加)来鉴定过度甲基化癌基因(图2B)。我们也从这些区域中根据它们在未处理的细胞中没有基本表达来挑选基因。事实上，在HCT116细胞中，总共532个基因的上层反应区中35个随机挑选的基因中的30个基因(86%)，和来自318个上层基因的48个这样的SW480细胞基因的31个基因(65%)证明被CpG过度甲基化——如通过MSP(20)所测量的，和在来源的细胞系中被沉默——如通过RT-PCR测量的(图5、7(S2、S4)。我们也检测了在DAC处理的HCT116细胞的下层中过度甲基化基因的发现效率。在这个区域中的鉴定的1190个基因中，35个随机挑选的含有CpG岛的基因中的17个(49%)被过度甲基化，具有一致的基因沉默(图6(S3))。这说明了与以前鉴定新的癌过度甲基化基因的筛査相比(7、21),我们的方法是特别有效的。以这种证实的过度甲基化的水平，我们计算在HCT116细胞中过度甲基化组由估计的1040个基因组成和对于SW480细胞由估计的579个基因组成(对于计算的详细描述，参见图8(表Sl))。过度甲基化组估计为从在CaC02中的532个基因到RKO细胞中的1389个基因的范围(图8(表S1))。在6个细胞系的所有层中鉴定到总共5906个独特的基因，每个细胞系产生平均大约1000个过度甲基化组基因。实施例4在细胞培养为基础的方法中根本的问题为是否它们鉴定了在原发性肿瘤中作为失活靶标的基因。为了解决这个问题，来自证实的基因清单的含有CpG岛的20个基因被从HCTU6上层(17个基因)、HCT116下层(2个基因)或SW480上层(l个基因)中随机选择，和分析在一组CRC细胞系中的甲基化。所有测试的基因在2个或多个细胞系中被过度甲基化(图3A)。随后我们检测了在一组20个到61个原发性结肠癌和20个到40个正常出现的结肠组织样品中的这20个基因的状况，正常出现的结肠组织样品从无癌的个体中获得。在正常结肠组织样品中，大部分基因(65%)完全没有被甲基化或者很少甲基化，但在绝大多数原发性肿瘤中(86%)被甲基化(图3A)。分析的20个基因中，13个基因(65%)满足在细胞系中具有高频率甲基化的"肿瘤特异性甲基化"的标准，在正常结肠中低的或者未检测到的甲基化和在肿瘤样品中频繁的甲基化。我们策略的效率揭示在细胞系中对于鉴定过度甲基化基因至少二分之一(l/2)的发现率，和对于鉴定癌症特异性过度甲基化基因至少三分之一(l/3)的发现率。实施例5虽然清楚的是，遗传和外遗传机制对人类肿瘤发生的起始和进展都是重要的，但是对这些改变的每个的相对贡献了解不多。对少数癌基因甲基化和突变频率之间的比较还没有令人信服地证明任一途径的普遍性。重要地是，还没有进行全基因组分析来质疑这个问题。在最近的癌基因全基因组测序中，Sj6blom等(3)观察到突变一般而言具有低的发生率，鉴定的90%的基因包含小于10%的突变频率。此外，典型的结肠或者乳腺癌每个单个肿瘤仅含有平均11个突变,单个肿瘤之间具有很少的重叠。这些低频率提出了这样的问题是否可选的机制可能在另外的肿瘤中导致这些基因的失活。显然，我们现在在个体肿瘤中鉴定到数量大得多的候选过度甲基化基因(图2C)，这表示这种外遗传改变可能为许多肿瘤抑制基因的突变提供了可选的失活途径。35[100]当我们搜索候选过度甲基化基因和189种突变癌(CAN)基因之间的匹配时，筛査肿瘤的遗传和外遗传变化的重要性被显著加强。我们首先质疑我们5906个过度甲基化组基因清单与在乳腺和CRC肿瘤中鉴定的CAN基因清单。这鉴定了这56种共有基因，其中45种含有CpG岛。这些45种基因中的26种(58%)——类似于如上所述鉴定的所有候选基因的证实率——证明在6个细胞系的至少1个中被过度甲基化，并被选择用于进一步研究。重要地是，正好一半的基因(13种基因)在正常结肠中未被甲基化，但是在原发性CRC肿瘤中被甲基化(图3B、C)，给出了鉴定肿瘤特异性甲基化的50%的频率。对于事实上每种检查的基因，过度甲基化的发生率显著高于突变的发生率(图3D)。因此，不同于突变的基因，大多数基因的过度甲基化在许多肿瘤之间是共有的性质。在先前未表征的基因中这些外遗传沉默和突变的发现巩固了它们作为肿瘤抑制基因的可能作用。(图3E)。实施例6—收集的BNIP3、F0XE1、SYNE1、S0X17、JAM3、MMP2和GPNMB的另外组织数据材料和方法賴f资织據W游游尿存^对应于77个正常组织和94个癌样品，总共171个结肠石蜡包埋的组织样品使用实时MSP进行处理。表2给出了用于组织确认的样品组的概述。表2-临床样品组的详细资料<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>石微微辦，磨微福尔马林固定的石蜡包埋样品首先在750pl的二甲苯中去除石蜡2小时。然后，在以13000rpm离心15分钟之前，加入250pl的70%的乙醇。除去上清液，并在室温下空气干燥样品20分钟。使用经典的酚/氯仿提取方法提取DNA，并在50^il的LoTe(3mMTRIS，0.2mMEDTA，pH8.0)中重悬浮。随后，使用PicogreendsDNA定量试剂盒(MolecularProbes,Invi加gen)，依照制造商的推荐对DNA定量。随试剂盒提供的XDNA用于制备标准曲线(从1到800ng/ml)。使用FluoStarGalaxy平板读取器(BMGLabtechnologies,德国)收集数据。ZW」參欲使用EZ-96DNA甲基化试剂盒(ZymoResearch)，依照制造商的方案，1吗的DNA在移液自动机(Tecan)上以96孔形式进行亚硫酸氢盐修饰。基本上，等份的45^与5^的M-稀释缓冲液(M-DilutionBuffer)混合，并在37°C以1100rpm摇动温育15分钟。接着加入100Hl的稀释的CT转化试剂，样品在70'C、在黑暗中以1100rpm摇动温育3小时。在转化后，通过在冰上温育10分钟进行和加入400^的M-结合缓冲液对样品脱盐。样品加样到收集盘中的Zymo-Spinl柱上，并离心后，用200^1的M-洗涤缓冲液(M-WashBuffer)洗涤。200pl的M-去磺化缓冲液(M-DesulphonationBuffer)放置在柱上并在室温温育15分钟。在柱子离心后，它们用200m1的M-洗涤缓冲液洗漆2次。最后，DNA在125)ilTris-HClmMpH8.0中从柱上洗脱和储存在-8(TC，直到进一步的处理。藩jf谱在7900HT快速实时PCR系统上(AppliedBiosystems)应用实时MSP。5pl修饰的DNA加到PCR混合物(总体积10pl)中，PCR混合物含有缓冲液(16.6mM(NH4)2S04、67mMTris(pH8.8)、6.7mMMgC12、10mMp-巯基乙醇)、dNTPs(5mM)、正向引物(6ng)、反向引物(18ng)、分子信标(0.16pM)和JumpstartDNATaq聚合酶(0.4单位；SigmaAldrich)。用于每个基因的引物序列和分子信标序列总结在表3中。使用如下循环程序5分钟95°C，接着45个30秒95°C、30秒57。C和30秒72。C的循环。包括标准曲线(2><106—2()拷贝)以通过内插它们的Ct值到标准曲线来确定未知样品的拷贝数。表3-引物序列和信标序列BNIP3正向引物5'-TACGCGTAGGTTTTAAGTCGC-3'(SEQIDNO:251)反向引物5'-TCCCGAACTAAACGAAACCCCG-3'(SEQIDNO:252)信标5'-FAM-CGACATGCCTACGACCGCGTCGCCCATTAGCATGTCG-3'-DABCYL(SEQIDNO:253)FOXE1正向引物5'-TTTGTTCGTTTTTCGATTGTTC-3，(SEQIDNO:254)反向引物5'-TAACGCTATAAAACTCCTACCGC-3'(SEQIDNO:255)信标5'-FAM-CGTCTCGTCGGGGTTCGGGCGTATTTTTTTAGGTAGGCGAGACG-3'-DABCYL(SEQIDNO:256)JAM3正向引物5'-GGGATTATAAGTCGCGTCGC-3'(SEQIDNO:257)37<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>测量值表示为甲基化比率，定义为与ACTB比较每个基因的荧光强度值的比率，乘以IOOO，以便容易作表。如在图10-16中所指出，在调查的对照和病例组之间，观察到清楚的比率差异。参考文献1.PonderB.A.Cancergenetics.淑置411，336-41(2001).2.Herman,J.G.&Baylin，S.B.Genesilencingincancerinassociationwithpromoterhypermethylation,iVE"g/JAfed349，2042-54(2003).3.Sj5blomT.etal.Theconsensuscodingsequencesofhumanbreastandcolorectalcancers.5Wem:e314,268-74(2006).4.Antequera,R&Bird，A.Numberofcpgislandsandgenesinhumanandmouse.^90,11995-11999(1993).5.Costello，J.F.etal.AberrantCpG-islandmethylationhasnon-randomandtumour-type-specificpatterns,AtoGe赠.24,132-138(2000),6.Suzuki,H.etal.Agenomicscreenforgenesupregulatedbydemethylationandhistonedeacetylaseinhibitioninhumancolorectalcancer,AtoG^赠31，141-9(2002),7.Gius，D.etal.Distincteffectsongeneexpressionofchemicalandgeneticmanipulationofthecancerepigenomerevealedbyamultimodalityapproach.Ce〃6，361-71(2004).8.Paz，M,F.etal.GeneticunmaskingofepigeneticallysilencedtumorsuppressorgenesincoloncancercellsdeficientinDNAmethyltransferases.Afo/Ge"ef12,2209-19(2003).9.Weber，M,etal.Chromosome-wideandpromoter-specificanalysesidentifysitesofdifferentialDNAmethylationinnormalandtransformedhumancells.iVaf37,853-62(2005).10.Hu，M.etal.Distinctepigeneticchangesinthestromalcellsofbreastcancers.Ge""37,899-905(2005).11.Toyota,M.etal.IdentificationofdifferentiallymethylatedsequencesincolorectalcancerbymethylatedCpGislandamplification.CVmcer7^y59，2307-12(1999).12.Keshet,I.etal.Evidenceforaninstructivemechanismofdenovomethylationincancercells.淑G匿f38,149-53(2006).13.Ushijima，T.Detectionandinterpretationofalteredmethylationpatternsincancercells,A^7evCawcer5,223-31(2005).14.Rhee,I.etal.DNMT1andDNMT3bcooperatetosilencegenesinhumancancercells.胸赃416,552-6(2002),15.Toyota,M.etal.EpigeneticinactivationofCHFRinhumantumors./VocA^"a7j&/"5^100,7818-23(2003).16.Suzuki，H.etal，EpigeneticinactivationofSFRPgenesallowsconstitutiveWNTsignalingincolorectalcancer,7Va/Gew"36，417-22(2004).17.Akiyama,Y.etal.GATA-4andGATA-5transcriptionfactorgenesandpotentialdownstreamantitumortargetgenesareepigeneticallysilencedincolorectalandgastriccancer.Mo/Ce〃5zW23,8429-39(2003).18.ChristmanJ.K,5-Azacytidineand5-aza-2'-deoxycytidineasinhibitorsofDNAmethylation:mechanisticstudiesandtheirimplicationsforcancertherapy.(9腳g匿21,5483-95(2002).19.Cameron,E,E.，Bachman,K.E.,Myohanen，S.,Herm叫J.G,&Baylin,S.B.Synergyofdemethylationandhistonedeacetylaseinhibitioninthere-expressionofgenessilencedincancer.AtoGW/ef21，103-7(1999).20.Herman,J.G,Graff,J.R.，Myohanen,S.，Nelkin,B.D.&Baylin，S.B.Methylation-specificPCR:anovelPCRassayformethylationstatusofCpGislands,A^W^c^/5W"S」93，9821-6(1996).21.YamashitaK,UpadhyayS,OsadaM，HoqueMO,XiaoY,MoriM,SatoF,MeltzerSJ,SidranskyD.Pharmacologicunmaskingofepigeneticallysilencedtumorsuppressorgenesinesophagealsquamouscellcarcinoma.CW/2485-95(2002).22.Egger,G,,Liang，G，Aparicio,A.&Jones,P.A.Epigeneticsinhumandiseaseandprospectsforepigenetictherapy.Atowre429,457-63(2004).23.Ihaka,R.&Gentleman,R.C.R:Alanguagefordataanalysisandgraphics,c/oww"/Cb呼w加细"/awdCrap/z/c"/5toto/to5,299-314(1996).24.Gentleman,R.C.etal.Bioconductor:opensoftwaredevelopmentforcomputationalbiologyandbioinformatics.G^wo附e5z》/5,R80(2004).25.Smyth,G.K.&Speed,T.NormalizationofcDNAmicroarraydata.M"/2oA31，265-73(2003).26.Smyth,G.K.，Yang,Y.H.&Speed,T.StatisticalissuesincDNAmicroarraydataanalysis,M"/70AMo/历o/224，111-36(2003)。权利要求1.鉴定结肠直肠癌或它的前体、或结肠直肠癌的倾向的方法，包括在含有结肠直肠细胞或者来自结肠直肠细胞的核酸的试样中，检测至少一种基因的外遗传沉默，所述至少一种基因选自FOXE1、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxD1、Jph3、神经化(NEURL)、PPP1R14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPON1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655；鉴定所述试样含有细胞，所述细胞是瘤性的、瘤的前体、或易于形成瘤，或者鉴定所述试样含有来自细胞的核酸，所述细胞是瘤性的、瘤的前体、或易于形成瘤。2.权利要求l所述的方法，其中所述试样含有腺瘤细胞。3.权利要求l所述的方法，其中所述试样含有来自腺瘤细胞的核酸。4.权利要求1所述的方法，其中所述试样含有癌细胞或者来自癌细胞的核酸。5.权利要求l所述的方法，其中所述至少一种基因是选自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。6.权利要求l所述的方法，还包括步骤在所述含有结肠直肠细胞或者来自结肠直肠细胞的核酸的试样中，检测至少一种基因中的突变，所述至少一种基因选自FOXEl、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、A画CX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHU、ZFP42、AS(X2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、F0XQ1、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655。7.权利要求l所述的方法，其中所述试样来自新鲜或冷冻组织样品。8.权利要求l所述的方法，其中所述试样来自活检样品。9.权利要求l所述的方法，其中所述试样来自手术样品。10.权利要求l所述的方法，其中所述试样来自细胞学样品。11.权利要求1所述的方法，其中所述试样从体液中分离，所述体液选自全血、骨髓、脑脊髓液、腹腔液、胸膜液、淋巴液、血清、粘液、血浆、尿液、乳糜、粪便、精液、痰、乳头抽吸液、唾液、拭样、结肠清洗样品和刷样。12.权利要求8所述的方法，其中向所述患者推荐外科手术去除瘤性组织。13.权利要求8所述的方法，其中向所述患者推荐辅助化疗。14.权利要求8所述的方法，其中向所述患者推荐辅助放射治疗。15.权利要求ll所述的方法，其中向所述患者推荐结肠镜检査或者乙状结肠镜检查。16.权利要求8所述的方法，其中向所述患者推荐增加频率的结肠镜检査。17.权利要求ll所述的方法，其中向所述患者推荐所述结肠的成像研究。18.权利要求l所述的方法，其中检测至少两种基因的外遗传沉默。19.权利要求l所述的方法，其中通过检测在所述基因中CpG二核苷酸基序的甲基化来检测外遗传沉默。20.权利要求l所述的方法，其中通过检测在所述基因启动子中CpG二核苷酸基序的甲基化来检测外遗传沉默。21.权利要求1所述的方法，其中通过检测所述基因减少的表达来检测外遗传沉默。22.权利要求21所述的方法，其中通过检测所述基因减少的mRNA来检测外遗传沉默。23.权利要求21所述的方法，其中通过与对照样品比较来测定所述基因减少的表达。24.权利要求22所述的方法，其中通过与核苷酸探针杂交来检测所述基因减少的mRNA。25.权利要求21所述的方法，其中通过核苷酸测序来检测减少的表达。26.权利要求21所述的方法，其中通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)来检测减少的表达。27.权利要求26所述的方法，其中所述RT-PCR是以非定量的方式进行。28.权利要求26所述的方法，其中所述RT-PCR是以实时和定量的方式进行。29.权利要求21所述的方法，其中通过检测所述基因编码的减少的蛋白质来检测外遗传沉默。30.权利要求19所述的方法，其中甲基化通过将所述基因的至少一部分与甲基化敏感的限制性内切核酸酶接触来检测，所述内切核酸酶相对于非甲基化的识别位点优选地剪切甲基化的识别位点，由此所述基因的所述部分的剪切表明所述基因的所述部分的甲基化。31.权利要求19所述的方法，其中甲基化通过将所述基因的至少一部分与甲基化敏感的限制性内切核酸酶接触来检测，所述内切核酸酶相对于甲基化的识别位点优选地剪切非甲基化的识别位点，由此所述基因的所述部分的剪切表明所述基因的所述部分的非甲基化，条件是所述基因包括所述甲基化敏感的限制性内切核酸酶识别位点。32.权利要求19所述的方法，其中甲基化通过如下检测将所述测试细胞的基因的至少一部分与化学试剂接触，所述化学试剂相对于甲基化胞嘧啶残基选择性地修饰非甲基化的胞嘧啶残基，或相对于非甲基化胞嘧啶残基选择性地修饰甲基化的胞嘧啶残基；和检测由于所述接触所产生的产物。33.权利要求32所述的方法，其中所述检测步骤包括与至少一种探针杂交，所述探针与包括修饰的非甲基化的CpG二核苷酸基序的序列杂交，但是不与包括非修饰的甲基化CpG二核苷酸的序列杂交。34.权利要求32所述的方法，其中所述检测步骤包括与至少一种探针杂交，所述探针与包括非修饰的甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，但是不与包括修饰的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交。35.权利要求32所述的方法，其中所述检测步骤包括用至少一种引物扩增，由此形成扩增产物，所述引物与包括修饰的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，但是不与包括非修饰的甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交。36.权利要求32所述的方法，其中所述检测步骤包括用至少一种引物扩增，由此形成扩增产物，所述引物与包括非修饰的甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，但是不与包括修饰的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交。37.权利要求32所述的方法，其中所述产物通过选自电泳、杂交、扩增、引物延伸、测序、连接酶链反应、色谱、质谱和其组合的方法来检测。38.权利要求37所述的方法，其中所述方法是绝对检测方法。39.权利要求37所述的方法，其中所述方法是实时检测方法。40.权利要求37所述的方法，其中所述方法对至少两种基因进行和比较所述至少两种基因产生的产物。41.权利要求32所述的方法，其中所述化学试剂是肼。42.权利要求41所述的方法，还包括用哌啶剪切所述肼接触的至少一部分的所述基因。43.权利要求32所述的方法，其中所述化学试剂包括亚硫酸氢盐离子。44.权利要求43所述的方法，还包括用碱处理所述亚硫酸氢盐离子接触的至少一部分的所述基因。45.减少或者抑制细胞瘤性生长的方法，所述细胞显示了与癌症相关的至少一种基因的外遗传沉默转录，所述方法包括确定细胞具有外遗传沉默的基因，所述基因选自F0XE1、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TXR2、UCHU、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655;通过将所述细胞与一种或者多种试剂接触，恢复在所述细胞中由所述外遗传沉默基因编码的多肽的表达，所述试剂选自CpG二核苷酸脱甲基剂、DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂，由此减少或抑制所述细胞不受调节的生长。46.权利要求45所述的方法，其中所述基因选自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。47.权利要求45所述的方法，其中所述接触在体外进行。48.权利要求45所述的方法，其中通过将所述试剂给予含有所述细胞的哺乳动物对象在体内进行所述接触。49.权利要求45所述的方法，其中所述试剂是脱甲基剂，并且所述试剂选自5-氮杂-2，-脱氧胞苷、5-氮杂-胞苷、泽布拉恩、普鲁卡因和L-乙硫氨酸。50.减少或者抑制细胞瘤性生长的方法，所述细胞显示了至少一种与癌症相关的基因的外遗传沉默转录，所述方法包括确定细胞具有外遗传沉默的基因，所述基因选自F0XE1、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTBl、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCX1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655;将编码多肽的多核苷酸引入所述细胞，其中所述多肽由所述基因编码，其中所述多肽在所述细胞中表达，由此恢复所述多肽在所述细胞中的表达。51.权利要求50所述的方法，其中所述基因选自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。52.治疗癌症患者的方法，所述方法包括确定在所述患者中的癌细胞有外遗传沉默的基因，所述基因选自FOXEl、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHU、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SP0N1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655;以足够量将一种或者多种选自CpG二核苷酸脱甲基剂、DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂的试剂给予所述患者，以恢复所述外遗传沉默基因在所述患者癌细胞中的表达。53.权利要求52所述的方法，其中所述试剂是脱甲基剂，和所述试剂选自5-氮杂-2，-脱氧胞苷、5-氮杂-胞苷、泽布拉恩、普鲁卡因和L-乙硫氨酸。54.权利要求52所述的方法，其中所述基因选自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。55.治疗癌症患者的方法，所述方法包括确定在所述患者中的癌细胞具有外遗传沉默的基因，所述基因选自F0XE1、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCUA、TFPI-2、TLR2、UCHU、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655所示的基因；给予所述患者编码多肽的多核苷酸，其中所述多肽由所述外遗传沉默的基因编码，其中所述多肽在所述患者的肿瘤中表达，由此恢复所述多肽在所述癌中的表达。56.权利要求55所述的方法，其中所述外遗传沉默的基因选自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。57.选自治疗癌症患者的治疗策略的方法，包括鉴定基因，所述基因在所述患者的癌细胞中的表达被选自CpG二核苷酸脱甲基剂、DNA甲基转移酶抑制剂和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂的一种或者多种试剂再激活，其中所述基因选自FOXEl、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GP画B、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、A腹CX2、CBR1、DDX43、DMRTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCUA、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、C丽3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPON1、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655;禾口选择增加所述基因表达以治疗所述癌症患者的治疗剂。58.权利要求57所述的方法，其中所述基因选自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、脂F182、ICAM5。59.权利要求57所述的方法，还包括为所述癌症患者开处所述治疗剂的步骤。60.权利要求57所述的方法，还包括给予所述癌症患者所述治疗剂的步骤。61.权利要求57所述的方法，其中所述治疗剂包括编码所述基因的多核苷酸。62.权利要求57所述的方法，其中所述脱甲基剂是5-氮杂-2'-脱氧胞苷。63.权利要求57所述的方法，其中所述治疗剂是5-氮杂-2'-脱氧胞苷。64.权利要求57所述的方法，其中所述癌细胞从手术样品获得。65.权利要求57所述的方法，其中所述癌细胞从活检样品获得。66.权利要求57所述的方法，其中所述癌细胞从细胞学样品获得。67.权利要求57所述的方法，其中所述癌细胞从粪便、粘液、血清、血液或尿获得。68.评定在试样中的甲基化的试剂盒，在包装中包括试剂，其(a)修饰甲基化的胞嘧啶残基，但是不修饰非甲基化的胞嘧啶残基，或(b)修饰非甲基化的胞嘧啶残基，但是不修饰甲基化的胞嘧啶残基；和一对寡核苷酸引物，其在扩增条件下与基因的区域特异性杂交，所述基因选自F0XE1、SOX17、SYNE1、BOLL、CABYR、EFEMP1、FBLN2、FOXL2、GNB4、GSTM3、HoxDl、Jph3、神经化(NEURL)、PPPlR14a、TP53AP1、RAB32、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5、ARMCX2、CBR1、DDX43、函RTB1、FBLN2、HIST2H2AA、ICAM1、LY6K、NEF3、POMC、STK31、SYCP3、TCL1A、TFPI-2、TLR2、UCHL1、ZFP42、ASCL2、ATP8A2、CTAG2、EPHA4、FANCF、FOXQl、HUS1B、JAM3、LEF1、MOV10L1、NPPB、PWWP1、RASSF5、REC8L1、SALL4、BEX1、BNIP3、CCK、CDX1、CNN3、CXX1、IRX4、MC5R、RSNL2、SMARCA3、SPONl、SYT6、TRPC3、TSPYL6、ZNF345、DKK3和ZNF655所示的基因，其中所述区域在大约lkb的所述基因的转录起始位点内。69.权利要求68所述的试剂盒，其中所述基因选自SYNE1、APC2、GPNMB、MMP2、EVL、STARD8、PTPRD、CD109、LGR6、RET、CHD5、RNF182、ICAM5。70.权利要求68所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸引物对中的至少一个引物与包括修饰的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，但是不与包括未修饰的甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，或者其中所述寡核苷酸引物对中的至少一个引物与包括未修饰的甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，但是不与包括修饰的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交。71.权利要求68所述的试剂盒，还包括(a)第一寡核苷酸探针，其与包括修饰的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，但是不与包括未修饰的甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，(b)第二寡核苷酸探针，其与包括未修饰的甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，但是不与包括修饰的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，或(c)所述的第一和第二寡核苷酸探针两者。72.权利要求68所述的试剂盒，还包括(a)第一寡核苷酸探针，其与包括修饰的非甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，但是不与包括未修饰的甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，(b)第二寡核苷酸探针，其与包括未修饰的甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，但是不与包括修饰的甲基化CpG二核苷酸基序的序列杂交，或(c)所述第一和第二寡核苷酸探针两者。73.权利要求68所述的试剂盒，还包括寡核苷酸探针。74.权利要求68所述的试剂盒，还包括用于扩增DNA的DNA聚合酶。全文摘要我们已经开发了全转录物组方法来鉴定在结肠直肠癌(CRC)中受到启动子CpG岛过度甲基化和转录沉默影响的基因。通过在一组原发性人类CRC样品中筛查细胞系和确认肿瘤特异性过度甲基化，我们估计在个体肿瘤中所有已知基因的几乎5％可能被启动子甲基化。当直接与基因突变比较时，我们在个体肿瘤中发现数量大得多的基因被过度甲基化，和在包含遗传或者外遗传变化的个体基因内高得得多的过度甲基化频率。因此，为了列举人类癌症基因组中的全变化谱，和有助于对肿瘤进行最有效的分组从而鉴定癌症生物标记并调整治疗方法，应该进行遗传和外遗传两种筛查。我们鉴定的基因可以用于诊断性地检测癌症、初癌和发展癌的可能性等等。文档编号C12P19/34GK101688239SQ200880010320公开日2010年3月31日申请日期2008年2月12日优先权日2007年2月12日发明者K·E·舒贝尔,S·B·拜林,W·V·克里金格申请人:约翰·霍普金斯大学;昂卡姆塞罗姆科学公司