Dna断裂点分析的方法

专利名称：：Dna断裂点分析的方法
技术领域：
：本发明涉及鉴定DNA断裂点的方法以及所述方法中所使用的制剂。更特别的，本发明提供了基于应用新型多重PCR扩增技术来鉴定基因易位断裂点的方法。本发明所述方法不仅可协助对断裂点位置的鉴定，还可进一步有助于分离所述断裂点在其中出现的DNA片段。这就提供了有价值的机会来对断裂点区域进行深入分析，例如对所覆盖的区域进行测序。本发明的方法可用于各种应用，包括，但不限于，提供常规手段来对患者体内与疾病发生相关基因断裂点的表征，并由此能够设计患者特异性的探针和引物从而对患者的疾病状态进行持续的监测。除了对由断裂点存在而表征的病症进行过程进行监测，本发明所述方法还能够对现存治疗药物和/或新治疗药物的有效性进行评估，就这个意义而言，对所述病症是否为赘生物进行判断，或对患者从减轻/缓解状态再度恶化的可能性进行预测。除了通过对所存在的断裂点进行表征来监测疾病的进程，在所述疾病是赘生物的范围内，还能够对所存在治疗药物和/或新治疗药物的有效性进行评估，对患者从缓解状态复发的可能性进行预测。
背景技术：
：本说明书对任意在先公开(或由此所得信息)或任何已知内容的参考都不是，亦不应被认为是承认或认可或任何形式的提示所述在先公开(或由此所得信息)或已知内容构成本发明对其做出贡献的领域的公知常识。本说明书中，发明人所涉及出版物的参考书目以字母顺序列示于本说明书末尾。由于非同源染色体之间部分的交换，染色体易位使得先前未连接的基因组片段连接到了一起。尽管某些易位并未与新的表现型相关联，但其他的易位有可能导致由于对蛋白表达的调制或新融合蛋白形成而产生的疾病。常见的有两种主要类型的染色体易位，即相互易位(也称为非罗伯逊易位)和罗伯逊易位。此外，易位可以是平衡的(材料均勻的交换而没有遗传信息的增加或减少)或不平衡的(在这种情况下，染色体材料的交换是不均勻的从而产生了增加或减少的基因)。相互(非罗伯逊易位)易位通常导致非同源染色体材料之间的交换，且在600个新生儿中大约能发现1例。这样的易位通常是无害的，并可通过出生前诊断得以发现。然而，平衡的相互易位携带者通常会以不平衡染色体易位的形式产生合子而表现出升高的风险，进而导致流产或具有残疾的儿童。罗伯逊易位涉及两条近端着丝粒染色体，其在着丝粒区域附近融合，伴随有短臂的丢失。所产生的核型仅具有45条染色体，因为有两条染色体融合到了一起。在涉及到全部近端着丝粒染色体的组合中都观察到了罗伯逊易位。最常见的易位涉及染色体13与14，且在1300人中存在1例。与其他的易位类似，罗伯逊易位的携带者通常是表型正常的，但却表现出不平衡合子的风险，其能够导致流产或异常后代。例如，涉及染色体21的罗伯逊易位携带者表现出较高的可能性产生患有唐氏综合征的儿童。可能由于易位的存在而导致的疾病包括(i)癌症-可由易位引起的若干形式的癌症；这主要在白血病中有所描述(例如，急性骨髓性白血病和慢性骨髓性白血病)。(ii)不育-这发生在当某个想要成为父母的人携带有平衡易位的时候，在这种情况下，所述想要成为父母的人是无临床症状的，但其受孕的胎儿却不能成活。(iii)唐氏综合征-在某些情况下，这是由第三条染色体21向染色体14进行的罗伯逊易位而导致的。染色体易位及其相关疾病的特定例子包括·t(2；5)(p23；q35)-间变性大细胞淋巴瘤(anaplasticlargecelllymphoma)·t(8;14)-伯基特氏淋巴瘤(c-myc)·t(9；22)(q34；qll)_费城染色体，CML,ALL·t(ll；14)-外套细胞淋巴瘤(Bcl-I)·t(ll；22)(q24；qll.2-12)-尤因氏肉瘤·t(14；18)(q32；q21)_滤泡性淋巴瘤(Bcl_2)·t(17；22)-隆凸性皮肤纤维肉瘤(dermatofibrosarcomaprotuberans)·t(15；17)-急性早幼粒细胞性白血病(pml和视黄酸受体基因)·t(l；12)(q21；pl3)_急性粒细胞白血病·t(9；12)(p24；ρ13)-CML,ALL(TEL-JAK2)·t(X；18)(pi1·2；qll.2)-滑膜肉瘤·t(l；11)(q42.1；q14.3)-精神分裂症·t(l；19)-急性前B细胞性白血病速记法t(A；B)(pi；q2)可用于表示在染色体A与染色体B之间的易位。第二组括号内的信息，在给出时，表示分别对于染色体A和B而言在其染色体内的精确位置-ρ表示染色体的短臂，q表示长臂，P和q的数字表示在显微镜下对染色体进行染色时的区域，带或亚带。如上所详细描述的，慢性骨髓性白血病是瘤形成病症的一个示例，其是由染色体易位引起的。然而，与许多瘤形成病症不同，如果被有效诊断和监测之后，其治疗前景十分良好。在几乎所有的慢性骨髓性白血病的病例中，均可看到特异性的易位。这样的易位涉及来自染色体9和22中长臂的小片段相互融合。改变的染色体22公知被称为费城染色体(简写为Phl)。当Phl染色体的断裂点被测序时，发现所述易位通过将来自C-ABL-原癌基因与其他BCR(断裂点串联区域)的序列连接到一起而创建了融合基因。BCR-ABL融合基因编码磷蛋白(P210)，其功能是失调蛋白酪氨酸激酶并且使细胞有变成瘤形成的预先倾向。该假设是通过发现P210的表达能够导致一系列造血细胞系在体外的转化以及转有人BCR-ABL基因的小鼠能够发展出多种血液学恶性肿瘤而得以支持的。对易位产生癌症进行详细研究的其他示例可见于伯基特氏淋巴瘤。在这种B细胞肿瘤的某些情况下，易位可见于涉及染色体8和三条其他染色体(2，14或22)中的一条。在这些情况下，并未产生融合蛋白。相反，染色体8上的c-myc原癌基因还在免疫球蛋白基因启动子的转录控制之下被引入。在B细胞中，免疫球蛋白启动子是具有强转录活性的，导致了c-myc的过量表达，其是根据表现出单基因性质的若干其他系统而获知的。因此，这样的易位导致了致癌性蛋白的异常高水平表达。正如那些在慢性骨髓性白血病中观察到的，诊断染色体易位的现有方法，是核型分析。对多种易位而言，然而，现在有可能通过PCR，使用跨越断裂点的引物来检测易位。在某些情况下，PCR技术还可用于对治疗的敏感情况进行检测以及对治疗进行监测。由于开发出了更有效的治疗方法，对确定治疗效果的监测变得对诸如慢性粒细胞白血病和急性早幼粒白血病的疾病愈发重要。对这2种疾病的监测而言，对于PCR的起始材料是RNA。易位断裂点位于各个基因的内含子中，其结果是，RNA拼接去除了由内含子转录的RNA序列，并产生了仅仅一种或极有限数量的终mRNA产物，尽管在患者人群中存在有大量的其他易位情况。然而，使用RNA作为起始材料通过PCR来检测和定量易位的主要缺陷在于RNA是一种难以操作的分子，因为其固有的易降解性。DNA是更稳定的分子。但是，在DNA内容中对断裂点的最初鉴定和表征却更加困难，因为染色体融合位点的串联区域通常能够跨越成千上万核苷酸的大型内含子。这样的尺度对于通过单一PCR反应来进行直接覆盖而言实在是太大了。因此，亟待开发对DNA样本进行常规断裂点分析的手段。在导致本发明得以形成的工作中，开发了一种新的多重扩增反应，其能够在DNA样本中对断裂点进行定位和分析。尽管断裂点的确切位点是未知的，本发明的方法依然能够在DNA样本中对存在的断裂点进行诊断，并且能够使用相对适中和简单的多重扩增反应对断裂点区域进行分离和分析。这种扩增反应设计的优点在于并不需要产生较长的PCR产物。而且，在扩增引物5’末端优选引入的引物杂交标签区域也使得快速生成了大量拷贝数的使用这些引物产生的扩增子，并因此协助扩增子的分离与分析。发明_既述在本说明书及其后的权利要求中，除非文中特别指明，词语“包含”，及其变化形式例如“含有”和“包括”，都应该被理解为意指包括了指定的整体或步骤或成组的整体或步骤，而不是对任意其他整体或步骤或成组的整体或步骤的排除。在本文中，术语“得自”应被理解为特定的整体或成组的整体来源于特定的种类，而并非必需直接从特定的来源获得。此外，正如在本说明书中所使用的，单数形式的“一个”，“和”以及“这个”都包括了复数的指示物，除非文中清楚的另有指明。除非特别指定，本说明书中的全部技术和科学术语都与本发明所属领域常规技术人员通常理解的意思相同。本主体说明书中包含的核苷酸序列信息是使用PatentInVersion3.1软件制备的，在文献参考目录之后列示。每条核苷酸序列都在序列表中使用数字指针<210>，之后是序列标识符(例如<210>1，<210>2等)来进行识别。序列(DNA等)的长度，类型和每种序列的来源有机体都分别通过数字指针域<211>，<212>和<213>所提供的信息来说明。至于说明书中所涉及的核苷酸序列都是通过序列标识符(例如SEQIDN0:1,SEQIDN0:2等)之后的指针SEQIDNO:来进行识别的。本说明书中所涉及到的序列标识符都与序列表中数字指针域<400>所提供的信息相关，其后是序列标识符(例如<400>1，<400>2等)。即本说明书中详细描述的SEQIDNO1与在序列表中标识为<400>1的序列相关。本发明在一方面涉及鉴定基因断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签也相同于步骤(iii)(a)中的其他反向引物标签，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；本发明因此优选地提供了鉴定染色体基因易位断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(ν)分析所述扩增的DNA。本发明因此提供了鉴定基因断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(b)24-400种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)24-400种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(ν)分析所述扩增的DNA。本发明因此通过了鉴定基因易位断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的反义链的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(b)24-400种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(c)针对步骤⑴(a)中正向引物寡核苷酸标签的引物；以及(d)针对步骤(i)(b)中反向引物寡核苷酸标签的引物；(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)24-400种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(c)针对步骤(iii)(a)中正向引物寡核苷酸标签的引物；以及(d)针对步骤(iii)(b)中反向引物寡核苷酸标签的引物；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(ν)分析所述扩增的DNA。如这一优选实施方案所述，本发明提供了鉴定染色体BCR-ABL易位断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对BCR或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对ABL或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对BCR或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对ABL或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签也相同于步骤(iii)(a)中的其他反向引物标签，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(ν)分析所述扩增的DNA。本发明因此优选地提供了鉴定染色体BCR-ABL易位断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对BCR或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)24-400种反向引物，所述引物针对ABL或其片段的DNA区域，所述弓|物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(C)针对步骤⑴(a)中正向引物寡核苷酸标签的引物；以及(d)针对步骤⑴(b)中反向引物寡核苷酸标签的引物(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对BCR或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)24-400种反向引物，所述引物针对ABL或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(c)针对步骤(iii)(a)中正向引物寡核苷酸标签的引物；以及(d)针对步骤(iii)(b)中反向引物寡核苷酸标签的引物；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签也相同于步骤(iii)(a)中的其他反向引物标签，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(ν)分离并测序所述扩增的DNA。图1所示为在第一轮PCR中对断裂点区域进行扩增的策略示意图。针对基因A的正向引物和针对基因B的反向引物优选地以混合池而非单独进行使用。仅由能够紧密跨越断裂点的引物对才能产生有效扩增。标签及标签引物未示出。第二轮PCR的策略是相同的，尽管正向及反向引物在第一轮中都正好在其对应的引物内部。在慢性骨髓性白血病的情况下，基因A是BCR基因，而基因B则是ABL基因。引物结合位点是交错的，所以最大扩增子的长度不会超过Ikb。图2所示为分离慢性骨髓性白血病中BCR-ABL易位断裂点的实验方案示意图。图3所示为说明来自某患者研究扩增材料的电泳结果图。NFA是6种正向BCR引物的混合池，NFA13和NFA14是各含有12种反向ABL引物的混合池。NFA13/14是含有属于混合池13和14的24种ABL引物的混合池。图4所示为在4名患有慢性骨髓性白血病的患者中断裂点序列的示意图。左侧的数字是对于BCR和ABL基因的Genbank碱基数。图5所示为断裂点被分离与鉴定的27名患者中ABL和BCR基因的DNA断裂点位点。ABL基因中的蓝色区域代表外显子la，Ib和E2。BCR基因中的红色区域代表外显子13，14禾口15。'障件骨髓件白血病(CML)中BCR-ABL断裂点的分离使用本发明对来自29名CML患者的样本进行研究。在27名这样的患者中，所述断裂点序列被分离并获得了详细的测序信息。在一名患者中未能扩增其BCR/ABL断裂点。在剩余患者中扩增了一个疑似断裂点。序列信息表明BCR基因在5’末端而ABL基因在3’末端，然而，这一断裂点并未能使用特异于疑似区域而制备的引物得到确认。图6所示为在来自16名CML患者血液样本中对最小残留疾病(MRD)的基于DNA和基于RNA的定量比较。ND=未检测。Y轴表示白血病细胞数量与总细胞的比值。基于DNA的PCR使用的是根据被研究患者的断裂点知识合成的患者特异性引物，基于RNA的PCR使用的是采用反转录然后采用通用引物PCR的常规方法。黑色标志表示两种技术检测的MRD，红色标志表示仅由DNA-PCR检测的疾病，蓝色标志表示疾病未检出。基于DNA的PCR表现出比基于RNA的PCR高大约2个数量级的灵敏度。图7所示为对患有急性早幼粒细胞白血病的一名患者的样本分离PML-RARa断裂点示意图。发明详述本发明的一部分通过DNA分析，使用在其5’末端标记有适合用作引物杂交位点DNA区域的，针对断裂点侧翼基因的多重引物，连续进行两次PCR反应，对基因易位断裂点进行常规和方便地鉴定。多重引物的同时使用能够协助短PCR的实施，而非现在进行的长PCR。通过使用针对用于第一次反应中基因区域内部的引物，连续进行第二次PCR，可以能够鉴定和分离较小扩增产物而非进行基因组DNA的分析的方式，实现对跨越所述断裂点区域的DNA分子进行扩增。通过引入由引物靶向的独特标签区域，可快速的实现对初始扩增子的扩增，由此克服了与使用低浓度的针对断裂点侧翼基因的起始引物的相关不利。本发明的方法由此提供了一种使用DNA的简单但却准确地鉴定和分析基因断裂点的手段。至此，应该理解尽管本发明的方法是通过参考慢性骨髓性白血病来进行示例的，但这一方法也能够应用于通过DNA样本来将所搜寻到的基因断裂点进行鉴定的任意情况。因此，在一方面，本发明涉及鉴定基因断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签也相同于步骤(iii)(a)中的其他反向引物标签，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(ν)分析所述扩增的DNA。应该理解，在本发明的优选实施方案中，当一种引物被用于步骤(i)(a)中时，优选的有两种或更多种引物被用于步骤(i)(b)。相反的应用是在步骤(i)(b)中使用一种引物。类似地，在其他优选实施方案中，当一种引物被用于步骤(iii)(a)中时，优选的有两种或更多种引物被用于步骤(iii)(b)。相反的应用是在步骤(iii)(b)中使用一种引物。所提到的断裂点5’和3’的“侧翼基因”应该被理解为对断裂点每一侧的基因或基因片段的参考。就5’和3’的命名而言，其可用于文中的这些基因/基因片段，其应该被理解为所提到双链DNA有义链的5’一3’方向，由此目的DNA得以产出。因此，所提到的“断裂点5’侧翼基因”应被理解为所提到双链DNA有义链。至此，本文中对所提到的“基因”或“基因片段”，在这种意义上都不是特异性的，都是指双链DNA有义链。因此，所提到的针对断裂点5’侧翼基因反义链的正向引物是指所述正向引物具有所述断裂点5’有义链区域相同的DNA序列，因此其可结合并扩增对应于所述区域的反义链。所提到的“基因”应被理解为DNA分子，其能够编码蛋白产物，无论是完全蛋白或蛋白片段。就染色体DNA而言，其基因包括内含子和外显子区域。然而，就这个意义而言，感兴趣的DNA是cDNA，例如如果感兴趣DNA是载体DNA，其不会存在有内含子区域。不过，这样的DNA还可以包括5’或3’非翻译区。因此，在此所提到的“基因”应被理解为含有能够编码蛋白或蛋白片段的任意形式的DNA，包括，例如基因组DNA和cDNA。所提到的基因“断裂点”应被理解为这样的点，在这个点上一个基因片段能够有其他基因或其片段重组。即，发生了两个基因的重组，使得一个或两个基因在一个或两个所述基因内的一个点上变得连接起来，而不是在一个基因的开始或末尾与另一个基因的开始或末尾相连。即，至少一个目的基因被剪切并与另一个基因的全部或部分进行重组。两个非同源基因区域的重组可以任意方法进行，包括但不限于染色体基因易位或体外同源重组(例如可在将DNA片段插入载体或人工染色体或在其载体部分在染色体水平上整合于宿主细胞的情况下发生)。优选的，所述目的基因断裂点是染色体基因易位断裂点。如本文所详细描述的，公知染色体基因易位的发生，在某些情况下，会导致疾病状态的开始。因为在两个基因之间的基因易位并不一定会导致在每次易位事件发生时断裂点都会精确地出现在两个基因的相同核苷酸位点上，也不可能假定在一个患者中的断裂点位置，例如在一个CML患者体内的费城染色体断裂点，会与另一个患者的相同。本发明的方法可使得使用DNA对基因断裂点进行简单但却正确的确定。本发明因此优选地提供了鉴定染色体基因易位断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(ν)分析所述扩增的DNA。所提到的“DNA”应被理解为脱氧核糖核酸或其衍生物或类似物。在这点上，应该理解其包括了所有形式的DNA，包括cDNA和基因组DNA。本发明的核酸分子可以是任意来源的，包括自然发生的(例如得自某种生物样本)，重组产生的或合成制备的。所提到的“衍生物”应被理解为包括来自天然，合成或重组来源的所述DNA的片段，同源物或直系同源物。“功能性衍生物”应被理解为能够表现出任意一种或多种所述DNA功能活性的衍生物。所述DNA序列的衍生物包括具有融合于其他蛋白质性或非蛋白质性分子的DNA分子特定区域的片段。在本文中的“类似物”包括，但不限于，对核苷酸或核酸分子的修饰，例如对其化学组成或整个构造的修饰。这包括，例如，对与其他核苷酸或核酸分子相互作用的核苷酸或核酸分子的方式，例如在主链形成或互补碱基对杂交的水平进行修饰。对核苷酸或核酸分子的生物素化或其他形式标记是本文中“功能性衍生物”的示例。如本文所详细描述的，本发明的方法可被预期使用多重寡核苷酸引物来协助感兴趣DNA样本的多重扩增。在本发明的一个实施方案中，感兴趣的DNA样本是杂合基因，其包含位于易位断裂点5’的一个基因(基因A)的一部分和位于易位断裂点3’的另一个基因(基因B)的一部分。在一个特定的实施方案中，基因A是BCR，基因B是ABL。对基因易位断裂点存在和本质的鉴定是通过使用两种或更多种针对基因A的正向引物和两种或更多种针对基因B的反向引物来实现的。针对基因A的引物被设计为能够沿着基因A的区间进行杂交，针对基因B的引物也类似地被设计为能够沿着基因B的区间进行杂交。在第一轮PCR中，能够扩增杂合基因的引物是能够杂交于所述断裂点5’的基因A部分的上游引物和能够杂交于所述断裂点3’的基因B部分的下游引物。此外，因为较小的扩增子能比较大的扩增子更有效地扩增，这就会出现对能最接近于够所述断裂点进行杂交的引物对的杂交进行选择。相同的原理也在第二轮引物中发挥作用，因为在一个实施方案中，每次第二轮引物都对应于单独的第一轮引物，但却只能在所述断裂点之内杂交，还存在着对能够越过所述断裂点的第二轮引物对的扩增进行的进一步选择。在不对本发明进行任意方式的限制时，第二轮PCR扩增提供了对断裂点区域扩增的额外特异性。在第二轮PCR之后，在所述断裂点周围序列的成功扩增可以在电泳中显示为扩增材料的条带。由于并不确切知道断裂点位于何处，有可能出现一种或多种内部引物并未杂交于其靶区域序列的情况，因为这样的序列在易位事件中已被有效的剪切。然而，在一个实施方案中，选定用于第一轮扩增的正向和反向引物是分别针对扩增来自所述断裂点侧翼基因片段的5’和3’末端区域的。第二轮引物随后针对于所述断裂点侧翼基因片段的内部区域，艮口，所述区域比第一轮引物靶向的区域更接近断裂点。再一次地，应该理解因为断裂点的准确位置是未知的，一种或多种这些正向和/或反向引物有可能未能杂交于DNA样本，因为其靶区域序列已被剪切。就第二轮“内部引物”而言，应该理解，在所提及的引物类群中，至少一种引物，但优选是所有引物，都被设计为从一个点上扩增目的DNA，当对易位基因本身(而非反义链或扩增产物)的各方面情况进行考虑时，这个点是用于第一轮扩增正向引物最靠近3’端的3’端以及用于第一轮扩增反向引物最靠近5’端的5’端。通过使用渐进性趋进内部定位引物的两步扩增方法，可不需要进行长PCR或产生特长以及累赘的扩增产物来实现。所提到的“引物”或“寡核苷酸引物”应被理解为含有核苷酸序列，或其功能性衍生物或类似物的任意分子，其功能包括杂交于感兴趣核酸分子(所述感兴趣的核酸也可被称为“靶DNA”)的区域以及对所述区域5’DNA序列的扩增。应该理解引物可含有非核酸成分。例如，引物可含有非核酸标签，例如荧光或酶学标签或某些其他非核酸成分，其可协助将所述分子用作探针或能够协助其检测或固定化。所述引物还可含有额外的核酸成分，例如寡核苷酸标签，其会在下文中进行更详细地讨论。在其他实施例中，所述引物可以是蛋白核酸，其包含有表现出核酸侧链的多肽主链。优选地，所述寡核苷酸引物是DNA引物。所提到的“正向引物”应被理解为这样的引物，其可通过杂交于所述靶DNA的反义链在感兴趣的DNA样本中扩增靶DNA。所提到的“反向引物”应被理解为这样的引物，其可通过杂交于所述靶DNA的有义链在感兴趣的DNA样本和PCR中扩增靶DNA。对适用于本发明中引物的设计与合成是本领域公知的技术。在一个实施方案中，目的引物的长度为4-60核苷酸，在另一实施方案中长度为10-50，而在又一实施方案中长度为15-45，在又一实施方案中长度为20-40，在又一实施方案中长度为25-35。在又一实施方案中，引物长度为约26，27，28，29，30，31，32，33或34核苷酸。在不以任意方式对本发明进行限制时，在一个实施方案中引物可被设计为具有65-70°C的TM。这使得可使用较高退火温度进行PCR，其能够最小化非特异性退火与扩增。针对第二轮PCR的每种正向或反向引物都被设计成能够杂交于这样的序列，所述序列，或在正向引物的下游或在反向引物的上游，接近于其对应正向或反向第一轮引物的杂交序列。将所对应引物设计成杂交于紧密毗邻的序列可最小化易位断裂点涉及到杂交序列或在杂交序列之间发生的可能性。即使发生这样的情况，在易位断裂点周围的序列也依然可通过紧邻上游或下游，如该情况所描述的引物对进行扩增。在本文所述的示例性实施方案中，对引物进行了选择，使得其结合位点与相邻结合位点的分离间隔为约500碱基。完成之后可使得所扩增材料在长度上有所不同，直至约Ikb的最大长度。相对于“长PCR”的策略而言，这种策略需要更少的引物和更少的复合多重PCR反应。本发明策略的优越之处在于标准的短PCR反应更高效且所扩增的产物也可被立刻测序，而不再需要另一组PCR反应来将其打碎为适合测序的小扩增子。就用于本发明方法的引物数量而言，这可由本领域所属技术人员来确定。至于引物的总数，其变化需要考虑作为靶基因区域的大小以及引物及需要引物杂交的序列之间的距离。为了扩增不大于约Ikb的PCR片段，可将引物设计为以约500碱基的间隔进行杂交。至于CML，几乎所有的BCR易位都涉及两个区域中的一个，每个的长度大约为3kb。在这种情况下，可使用12种外侧正向引物和12种对应的内部引物。然而，ABL基因的长度大于约140kb，且高达280种外侧反向引物与200种内部反向引物可得以使用。在一个特定的实施方案中，可使用6种正向引物与24种反向引物的组合，而在又一实施方案中，可使用6种正向引物与140种反向引物的组合。所选用的引物数量是根据易位所涉及的基因决定的，因而会随着易位的不同而不同，并会涉及到对所需要进行PCR反应的数量与在PCR反应中产生非特异产物可能性之间竞争性问题的考虑。正如本领域所属技术人员所理解的，在每个单独PCR反应中大规模的引物数量降低了PCR反应的数量，但却增加了非特异性扩增反应的可能性。在一个实施方案中，使用至少3种引物进行本发明所述的方法，在另一实施方案中为至少四种引物。在又一实施方案中，使用6-10种引物，6-15种引物，6-20种引物，6-25种引物或6-30种引物实施所述发明。在又一实施方案中，可使用5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30种引物。本发明因此优选地提供了鉴定基因断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(b)24-400种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)24-400种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(ν)分析所述扩增的DNA。优选地，所述基因断裂点是基因易位断裂点且更优选地是染色体基因易位断裂点ο由于起始引物池含有多种单一引物，所以用于本发明方法的引物具有相对较低的个体浓度。这降低了诱导PCR抑制的风险。为了协助获得成功的扩增结果，必须能够产生用于检测与分离的足量扩增子。在本发明的一个方面，这可通过使用寡核苷酸对引物进行标签来协助进行，所述寡核苷酸可用作引物杂交位点。除了针对于基因A和B的引物，每种PCR反应由此还可含有作为引物杂交位点的，针对于所述标签的两种寡核苷酸的集合物。这些寡核苷酸序列可作为引物，并可对由针对基因A和B的引物进行初始杂交和延伸而产生的扩增子进行有效地二次扩增。在一个实施方案中，针对标签的引物具有65°C-70°C的Tm从而能够最小化非特异性的扩增。因此，这些引物旨在克服由低浓度针对A和B引物所引起的潜在问题。而且，在某些条件下，有可能并不需要使用一种或两种标签引物。例如，当针对BCR基因仅有6条正向引物时，每种引物可以足以进行相对有效扩增的浓度存在。此外，应该理解，当存在于最终PCR轮次中时，寡核苷酸标签提供了额外的用途，因为所述标签引物可用来测序。因此，尽管标签可适用于引物杂交的位点，但也应该理解所述目的标签还可用于其他目的，例如在Southern凝胶分析中作为探针结合位点或能够分离所述引物或其延伸的扩增子。至此，所述标签可含有非核酸成分，例如蛋白分子或生物素，其能够进行分离，例如通过亲和层析，抗生物素蛋白链菌素结合或可视化。为了确保这些标签不会干扰弓I物的延伸，所述引物在其5，末端可连接有寡核苷酸标签。所提到的“寡核苷酸标签”由此应被理解为连接于本发明所述正向和反向引物5’端的少于50核苷酸的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述标签的长度为25-30碱基。应该理解所提到的与正向和反向引物相关定义的一致性，本说明书中所描述的寡核苷酸标签还可含有非核酸成分，例如分离或可视化标签，例如，生物素，酶学标签，荧光标签等。这可使得能够通过非分子方法对标签引物或扩增子进行快速简单的分离或可视化。所谓寡核苷酸标签“可操作地连接于”引物应该被理解为由于那些区域的连接使得所述标签引物的功能性目的，如上文所详述，能够得以实现。就这些区域连接的手段，以及进一步的，目的寡核苷酸引物结合于其靶DNA区域的手段而言，都对应于各种不同的相互作用。在这点上，所提到的“相互作用，，应被理解为任意形式的相互作用，例如在互补核苷酸碱基对之间的杂交或某些其他形式的相互作用，例如在具有任意其他核酸或非核酸分子，例如靶分子的引物分子或标签分子的任意核酸或非核酸部分形成的键，可视化手段，分离手段等。这种类型的相互作用可通过键的形成，例如，但不限于，共价键，氢键，范得华力或任意其他相互作用机理而发生。优选的，就在引物与靶DNA区域之间所发生的相互作用而言，所述相互作用是在互补核苷酸碱基对之间的杂交。为了协助这样的相互作用，优选的可在一定时间将靶DNA处理成部分或完全的单链并处于足以与所述引物发生杂交的条件内。在不以任意一种理论或操作方式对本发明进行限制的条件下，自身就可作为引物杂交位点的所包含的寡核苷酸标签可协助由本发明正向与反向引物所产生扩增子的方便和特异性扩增。因此，这在一定程度上克服了使用相对较低起始浓度正向和反向引物本身所具有的扩增限制。当正向和反向引物的起始浓度足够高时，并不必需使用标签。因此，在一个优选实施方案中，感兴趣的DNA样本可同时接触于本发明所述正向和反向引物，以及针对于正向和反向引物寡核苷酸标签的引物，从而在所有这些引物中进行步骤(ii)的扩增反应。然而，应该理解，尽管优选的扩增是基于两种基因引物，但也可同时使用标签引物，所述方法可进行修改从而在完成基于基因引物的扩增之后进行基于标签引物的扩增。所述标签的DNA序列可以相同或不同。就第一轮扩增而言，如果目的是扩增初始扩增产物，则所述标签可以是相同的。然而，如果研究人员希望选择性的富集含有所述侧翼基因之一序列的扩增子，则针对感兴趣基因(例如，基因A)引物标签区域的引物应该不同于针对其他基因(例如，基因B)引物标签区域的引物。在又一个实施例中，就第二轮或随后轮次的扩增而言，要求用于测序的标签不能相同，从而防止对两条链同时测序。本发明因此提供了鉴定基因易位断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段反义链的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(b)24-400种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(c)针对步骤⑴(a)中正向引物寡核苷酸标签的引物；以及(d)针对步骤(i)(b)中反向引物寡核苷酸标签的引物；(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)24-400种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(c)针对步骤(iii)(a)中正向引物寡核苷酸标签的引物；以及(d)针对步骤(iii)(b)中反向引物寡核苷酸标签的引物；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(ν)分析所述扩增的DNA。优选的，所述基因易位断裂点是染色体基因易位断裂点。应该理解本发明的寡核苷酸引物和标签不应被局限于本文所示例的特定结构(线性，单链分子)，而应该扩展至能够实现本文所详细描述功能目的的任意适合结构构型。例如，可希望所有或部分的寡核苷酸是双链的，含有环状区域(例如发夹弯曲)或采用开环构型的形式，即，所述核苷酸引物基本上是环形的但其末端区域并未连接。可使用任意适合的方法来协助进行核酸引物与靶DNA的相互作用。这些方法都是本领域所属技术人员公知的。实现将引物针对于扩增的方法也是本领域所属技术人员公知的。在优选方法中，所述方法是聚合酶链式反应，NASBA或链替换扩增。最优选的，所述扩增是聚合酶链式反应。至此，在本发明的一个实施方案中，在第一轮PCR中，20分钟的杂交提供了良好的扩增。所提到的“样本”应被理解为生物学或非生物学样本。非生物学样本的示例包括，例如，合成制备核酸类群中的核酸产物。所提到的“生物学样本”应被理解为得自动物，植物或微生物(包括微生物培养物)的任意生物学材料样本，例如，但不限于，细胞材料，血液，粘膜，粪便，尿液，组织活检标本，引入动物机体又随后排出的液体(例如，从肺灌洗之后从肺中提取的盐溶液或从灌肠洗涤回收的溶液)，植物材料或植物繁殖材料，例如种子或花朵或微生物菌落。对按照本发明方法所检测生物学样本的检测可直接进行或需要在检测之前进行某些形式的处理。例如，活检样本可能需要在检测之前进行勻浆或可能需要进行切片从而进行原位检测。此外，就所述生物学样本并非是液体形式而言，(如果这样的形式是检测所要求的话)其可能需要加入试剂，例如缓冲液，来动员样本。就存在于生物学样本中的靶DNA而言，所述生物学样本可直接检测或在检测之前对存在于所述生物学样本中的全部或某些核酸材料进行分离。在检测之前对靶核酸分子进行预处理，例如灭活具有活性的病毒或跑胶都在本发明的范围之内。应该理解在检测之前所述生物学样本可以是新鲜收集或保存的(例如通过冷冻)或可在检测之前进行处理(例如经过培养)。所提到的将样本“接触”于所述引物应被理解为协助所述引物与样本混合从而使得相互作用(例如，杂交)可以发生。达到这一目的的手段是本领域所属技术人员所公知的。选择何种类型的样本才能最适于本发明所公开方法的检测是依赖于所述病症的性质，例如所监测疾病的性质。例如，在一个优选实施方案中，瘤形成病症是分析的对象。如果所述瘤形成病症是淋巴细胞性白血病，血液样本，淋巴液样本或骨髓抽吸物将可提供适合的检测样本。当研究人员是否需要监测瘤形成细胞的原始来源或者是否需要监测来自起源点的瘤形成存在转移或其他形式的散布时都必需要进行详细考虑。在这点上，都希望从任意一个哺乳动物中收集和检测各种不同的样本。选择适当的样本进行任意给定的检测方案也是本领域所属技术人员所公知的。在这个意义上，用于本说明书中的术语“哺乳动物”包括人类，灵长类，家畜动物(例如，马，牛，绵羊，猪，驴)，实验动物(例如，小鼠，大鼠，兔子，豚鼠)，伴侣动物(例如，狗，猫)和圈养的野生动物(例如，袋鼠，鹿，狐狸)。优选地，所述哺乳动物是人类或实验室实验动物。更优选地，所述哺乳动物是人类。如上文所详述，在一个实施方案中，本发明的方法是进行连续的二步扩增，使用的是多种第二轮引物，每种引物都针对于由相对应第一轮引物所靶定的3’(对正向引物而言)或5’(对反向引物而言)基因区域。本领域所属技术人员应该理解在某些情况下并没有必要进行第二轮扩增。如果进行如下所述的选择性或富集性步骤，则进行第二轮扩增的必要性是显而易见的。这样的情况会发生在当断裂点周围的序列可有效扩增且几乎没有非特异性扩增，即可在第一轮扩增产物的电泳上观察到清晰定义的扩增产物条带时，或如果随后的选择步骤非常有效时。然而，一般地，都希望能够使用连续的两步扩增过程从而最小化非特异性扩增并产生能够跨越所述断裂点区域的相对较短的扩增产物。一般地，都期望扩增产物能够小于1.5kb，小于lkb，小于0.8kb或小于0.5kb。应该理解根据易位基因的大小，本发明的方法可适应的引入第三或第四轮扩增步骤，从而进一步最小化非特异性扩增。因为存在于多重反应中的引物数量以及参与易位的某个基因通常都含有多个重复序列，例如Alu的事实，也是个问题。而且，期望进行更多轮次扩增的需要亦不太现实。即使对本发明的方法进行了设计，从而使得扩增步骤能够连续地对针对之前扩增的扩增产物进行扩增，这也不应该被理解为在这方面对本领域所属技术人员引入任意额外步骤，例如富集/选择步骤的限制。例如，在第一轮扩增之后，研究人员可寻找从而选择所希望的扩增子，并由此对其单独材料进行第二轮扩增。研究人员可利用进行选择或富集的方法包括(i)根据连接于所述引物的唯一寡核苷酸标签的选择步骤。因此，因为所述标签本身也是扩增的并因此形成了部分的扩增子，其可被用作探针位点，从而能够分离作为正向与反向引物扩增结果的扩增子并由此应该跨越所述断裂点。或者，一个标签的生物素化提供了鉴定和分离扩增子的方式，所述扩增子是由正向或反向引物的延伸产生的。例如，通过使用生物素化的探针冲洗扩增产物，所述引物可作为探针来鉴定感兴趣的扩增子，而生物素化作用也提供了分离这些扩增子的基础。通过确保本发明中每种引物组都包含唯一的标签，有可能选出，特别明显的，仅有的感兴趣的特异性扩增子。特别的，本领域所属技术人员应该尝试排除由正向引物扩增但随后未由反向引物扩增所得的扩增子，从而提示所述目的扩增子有可能并未延伸跨过所述断裂点。作为引物天然交联杂交，或是对所述断裂点两侧非侧翼的扩增子进行扩增的结果，通过选出最有可能跨越所述断裂点的扩增子，随后轮次的扩增将具有更特异性的靶向以及越少可能产生不希望的扩增子。(ii)研究人员应该尝试对所述产物进行跑胶，并切割出相关的仅有的某些条带或区域，并对其实施进一步的扩增步骤。当某一条带在第二轮扩增之后在凝胶上还存在时，如果测序没有问题的话，可尝试将所述产物从凝胶中切除并清洗，然后使用单独的引物和/或较小的引物池进行一系列的PCR反应。例如，研究人员可使用单独的正向BCR引物和仅含有12种反向ABL引物的池。(iii)研究人员还可将所扩增的产物暴露于一轮或多轮次的瓶颈PCR，从而提供针对于非特异行扩增产物的阴性选择。在不以任意一种理论或操作方式对本发明进行限制的条件下，在常规PCR中，可将引物与反应条件设计为使得引物杂交以及正向和反向引物的延伸都处在或接近最大效率的情况下发生，从而使得扩增子的数量在每个循环中几乎能够翻倍，进而导致对数扩增。然而，可预计瓶颈PCR，要使用到正向和反向引物组合，其中在其不能有效杂交和延伸的情况下，可对某一组合的引物进行设计或使用。因此，尽管有效引物组合能够正常扩增，无效的组合却不能。其结果是，当感兴趣的序列被扩增时，扩增子链的数量明显少于在其在常规PCR反应中的数量。只有当在某一末端整合有无效引物标签区域的扩增子能够生成时，有效扩增才能开始。在这点上，针对标签区域的引物会影响正常的扩增产率。就从无效引物组合所产生的转录物而言，“瓶颈”由此被有效地创造了出来。当无效引物是针对于普通重复序列，例如alu序列时，更严重的瓶颈就被有用的创造出来了。如果这样的结合位点紧邻并置或如果无效引物可作为正向引物和反向引物，则会产生不希望产物的扩增。然而，由于两种引物都是无效的，那么扩增在一开始是极其低效的并存在有严重的瓶颈。只有当在某一末端及其另外的互补端含有无效引物标签区域的扩增子链能够生成时，有效扩增才能开始。在任意给定数量的循环之后，这些扩增子的数量，无论如何，都相当程度的低于在对感兴趣序列扩增中产生的数量。在扩增反应结束时的不希望产物数量也相应的有所降低。在随后的循环中，在有效引物对于预先合成扩增子的杂交与延伸之后，能够正确杂交于感兴趣序列的无效引物的杂交与延伸产生了标签引物能够有效杂交和延伸的模板。因为这样的分子与其互补物提供了各自针对于有效引物(标签引物和有效组合中的一种)的上游和下游结合位点，所以对由这样摸板所产生的扩增循环是有效且呈指数的。其结果是，在初始的延迟或“瓶颈”之后，扩增的总速率在后期循环中快速增加，从而使得每个循环的扩增子数量近乎成倍增加。然而，净结果是，由于在前者的每个末端以及对后者的仅一个末端具有瓶颈，存在有与感兴趣序列的扩增子相比而言针对不希望扩增子进行扩增的阴性选择因此，如果对开始靶序列的相同数量以及由常规PCR所产生的扩增加以考虑，瓶颈PCR的使用可使得感兴趣序列的扩增子数量增加较少，而不希望序列的扩增子数量增加更少。尽管希望和不希望产物的扩增都会发生，但依然存在感兴趣序列比不感兴趣序列的相对富集。因为降低无效引物组合的效率能够以更少的扩增花费来产生增加的富集，所以在绝对扩增与富集之间存在着相反的关系。一旦扩增轮次完成，就可对跨越断裂点区域的扩增子进行分析。在优选实施方案中，可通过切取含有所述扩增子的凝胶片段来分离目的扩增子并测序从而对断裂点进行表征。就从凝胶中切取条带进行分析而言，有必要对其中所包含的DNA进行进一步扩增，从而提供足够的材料用于测序。此前所述的寡核苷酸标签提供了适当的引物杂交位点从而协助了对所分离扩增子的进一步扩增。如上文所详细描述的，本发明的方法提供了对任意断裂点区域进行鉴定和表征的简单且常规的手段，例如针对某基因插入染色体或载体所在位点的特性，准确性以及稳定性(这对基因治疗而言至关重要)，但特别的是作为许多疾病特征的染色体基因易位断裂点。这些易位与疾病的示例包括，但不限于·t(2；5)(p23；q35)-间变性大细胞淋巴瘤·t(8；14)-伯基特氏淋巴瘤(c-myc)·t(9；22)(q34；qll)_费城染色体，CML,ALL(BCR_ABL重组)·t(ll；14)-外套细胞淋巴瘤(Bcl-I)·t(ll；22)(q24；qll.2-12)-尤因氏肉瘤·t(14；18)(q32；q21)_滤泡性淋巴瘤(Bcl_2)·t(17；22)-隆凸性皮肤纤维肉瘤·t(15；17)-急性早幼粒细胞性白血病(pml和视黄酸受体基因)·t(l；12)(q21；pl3)_急性粒细胞白血病·t(9；12)(p24；ρ13)-CML,ALL(TEL-JAK2)·t(X；18)(pi1·2；qll.2)-滑膜肉瘤·t(l；11)(q42.1；ql4.3)_精神分裂症·t(l;19)_急性前B细胞性白血病(PBX-1和E2A基因)。优选的，所述染色体基因易位是BCR-ABL易位或PML-RARalpha易位。如这一优选实施方案所述，其提供了鉴定染色体BCR-ABL易位断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对BCR或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对ABL或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对BCR或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对ABL或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签也相同于步骤(iii)(a)中的其他反向引物标签，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(ν)分析所述扩增的DNA。优选的，所述扩增步骤是使用1-30种正向引物和24-400种反向引物进行的。就本文所述的示例性实施方案而言，对引物进行了选择，使得其结合位点与相邻结合位点的分离间隔为约500碱基。完成之后可使得所扩增材料在长度上有所不同，直至约Ikb的最大长度。这种策略与现有技术中的“长PCR”策略不同，其需要更少的引物和更少的复合多重PCR反应。本发明策略的一个优越之处在于标准的短PCR反应更高效且所扩增的产物也可被立刻测序，而不再需要另一组PCR反应来将其打碎为适合测序的小扩增子。本发明因此优选地提供了鉴定染色体BCR-ABL易位断裂点的方法，所述方法包括⑴使DNA样本接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对BCR或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)24-400种反向引物，所述引物针对ABL或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(c)针对步骤⑴(a)中正向引物寡核苷酸标签的引物；以及(d)针对步骤⑴(b)中反向引物寡核苷酸标签的引物(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)1-30种正向引物，所述引物针对BCR或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)24-400种反向引物，所述引物针对ABL或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(c)针对步骤(iii)(a)中正向引物寡核苷酸标签的引物；以及(d)针对步骤(iii)(b)中反向引物寡核苷酸标签的引物；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签也相同于步骤(iii)(a)中的其他反向引物标签，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(ν)分离并测序所述扩增的DNA。更优选的，所述DNA序列是得自血液的样本。本发明的方法可具有广泛的应用，包括，但不限于(i)能够设计和生成患者特异性的探针从而用于对诊断患有由染色体基因易位所表征疾病状态的患者进行持续的监测。采用这一手段针对慢性粒细胞白血病所获得的结果如图6所示。(ii)旨在对将基因或其他DNA区域整合入染色体，载体，质粒，人工染色体等的体外和体内转染系统进行分析与监测。当应该发生重组的一般性位点公开之后，本发明可用于确定所述整合(即，断裂点)的具体点和特性。其还可用于监测由于能够生成特异性引物而产生遗传重组的持续稳定性。因此，在另一方面本发明提供了在哺乳动物中监测疾病状况的方法，所述疾病状况是由基因断裂点进行表征的，所述方法包括从得自所述哺乳动物的生物学样本中对所存在的断裂点进行筛选，所述断裂点可根据前文所定义的方法来进行鉴定。筛选目的断裂点的方法是本领域所属技术人员所公知的，并包括适合的基于探针的筛选技术，例如基于PCR的方法。通过根据本发明的方法对断裂点区域进行鉴定，研究人员可设计适当的引物组合来特异性地扩增目的断裂点。在一个实施方案中，所述基因断裂点是染色体基因易位断裂点，例如·t(2；5)(p23；q35).t(8;14)·t(9;22)(q34;qll)‘t(ll；14)·t(ll;22)(q24;qll.2-12)·t(14;18)(q32;q21)·t(17；22)‘t(15；17)·t(l;12)(q21;pl3)·t(9;12)(p24;pl3)‘t(X；18)(pll.2；qll.2)·t(l;11)(q42.1;ql4.3)·t(l；19)ο在另一个实施方案中，所述病症是·间变性大细胞淋巴瘤伯基特氏淋巴瘤·CML，ALL·外套细胞淋巴瘤尤因氏肉瘤·滤泡性淋巴瘤·隆凸性皮肤纤维肉瘤急性早幼粒细胞性白血病·急性粒细胞白血病滑膜肉瘤精神分裂症·急性前B细胞性白血病本发明的又一方面涉及DNA引物组合，可所述引物组合进行设计从而扩增和/或检测基因断裂点，所述断裂点是按照本发明所定义方法进行鉴定的。现在参照以下非限制性实施例和附图对本发明进行描述。实施例1从患者1的gDNA中分离BCR/ABL断裂点产物·采用QiagenFlexogene试剂盒提取基因组DNA·第一轮PCR(50ng基因组DNA)-所有反应都进行两次正向引物池-FA(含有7种正向BCR引物BCRF1-BCRF7，每种都有相同的5’标签序列⑷，总共50ng(每种7.14ng))反向引物池_R3/4(含有24种寡核苷酸反向ABL引物的池，每种都有相同的5’标签序列(C)，总共50ng(每种2.08ng))正向与反向标签序列引物(A，C)-每种25ngPCR条件IxPCR缓冲液，5mMMgCl2,0.75uldUTP(每种300uM)，0.4ulPlatinumTaq(2U)循环条件95/4分钟(970C/1分钟，65°C/20分钟，72°C/1分钟)x5(96°C/30秒，65°C/20分钟，72°C/1分钟)x5(92°C/30秒，65°C/20分钟，72°C/1分钟)χ10·第二轮PCR(在灭菌水中将第一轮反应稀释为1/200)正向引物池-NFA(含有7种正向内部BCR引物BFN1-BFN7，每种都有相同的5’标签序列(B)，总共50ng(每种7.14ng))反向引物池-RN3/4(含有24种寡核苷酸反向内部ABL引物的池，每种都有相同的5，标签序列(0)，总共50叫(每种2.08叫))正向与反向标签(B，D)-每种25ngPCR条件IxPCR缓冲液，5mMMgCl2,0.75uldUTP(300uM)，0.4ulPtTaq(2U)循环条件95/4分钟(94°C/30秒，65°C/10分钟，72°C/1分钟)χ10(94°C/30秒，65°C/5分钟，72°C/1分钟)xl5·PCR产物(7ul)在1.5%(ν/ν)琼脂糖凝胶上在120V进行解析对来自患者1的BCR/ABL断裂点进行鉴定·PCR产物在1.5%(ν/ν)琼脂糖凝胶上在120V进行解析将条带剪切并通过Flexigene试剂盒纯化·通过PCR对条带再次扩增(纯化产物的1/1000稀释)正向引物-TagB(25ng)反向引物-TagD(25ng)PCR条件IxPCR缓冲液，5mMMgCl2，0.75uldUTP(300uM)，0.4ulPtTaq(2U)循环条件95/4分钟(94°C/30秒，65°C/30秒，72°C/30秒)x35·使用TagB引物对PCR产物进行测序(Flinders测序机构)通过PCR对断裂点进行确认·对跨越断裂点的gDNA进行PCR患者1gDNA与IOx正常gDNA(若干引物组合)正向引物-BCR(患者特异性的)(25ng)反向引物_ABL(患者特异性的)(25ng)PCR条件IxPCR缓冲液，5mMMgCl2,0.75uldUTP(300uM)，0.4ulPtTaq(2U)循环条件95/4分钟(97°C/1分钟，65°C/30秒，72°C/30秒)x5(96"C/30秒，65°C/30秒，72°C/30秒)x5(92°C/30秒，65°C30秒，72°C/30秒)x25·PCR产物在3%(ν/ν)琼脂糖凝胶上在120V进行解析将条带剪切并通过QiagenminElute试剂盒纯化采用5’BCR特异性引物对产物测序从而确证BCR/ABL断裂点(Flinders测序机构)。几乎所有的易位都涉及3kb区域的BCR基因和140kb区域的ABL基因。6种正向弓丨物被用于覆盖BCR基因的区域，282种引物被用于覆盖ABL基因的区域。建立了6种PCR，每种都含有BCR引物中的一种，所有的ABL引物，以及常规的标签引物。如果需要的话，可采用一种巢式内部BCR引物和282种巢式内部ABL引物来进行第二轮PCR。或者，可进行1-3轮的瓶颈PCR，从而去除非特异性扩增产物并暴露出所扩增的易位序列。ABL基因中富含Alu序列，而BCR基因也含有一类这样的序列。ABL引物由此经历了随后所涉及的，针对每一种ABL引物的一个选择程序-使用标准准则进行设计-对每一种BCR引物进行配对，并通过针对BCR模板进行电子PCR扩增来进行检测。将不符合这一准则的引物淘汰。-将由12或24种ABL引物组成的池进行合并，将所述池与每种BCR引物配对，并使用由之前的PCR扩增产生的BCR模板来进行实验性的PCR进行检测。可通过检测每一种单独的ABL引物来确定哪一种能够导致扩增，来对能够产生扩增以及不能满足这一检测的任意池进行进一步分析。当鉴定之后，这样的引物被淘汰。用于实施例1中的BCR和ABL引物如实施例2所示。实施例2用于在慢性粒细胞白血病中分离BCR-ABL易位断裂点的引物BCR引物第一轮BCRF1-FT0cttctccctgacatccgtggBCRF2-FT0(_5)acacagcatacgctatgcacatgtgBCRF3-FT0gaggttgttcagatgaccacggBCRF4-FT1(-10)cagctactggagctgtcagaacagBCRF5-FT0tgggcctccctgcatccBCRF6-FT0tccccctgcaccccacg第二轮BCRFI-FTltgacatccgtggagctgcagatgcBCRF2-FT1acatgtgtccacacacaccccaccBCRF3-FT1accacgggacacctttgaccctggBCRF4-FT1(_4)ctggagctgtcagaacagtgaaggBCRF5-FT1tccctgcatccctgcatctcctccBCRF6-FT1cccacgacttctccagcactgagc相对于第一轮而言，第二轮引物是内部的，并可与内部ABL引物在第二轮一起使用或进行瓶颈PCR从而消除非特异性扩增材料并协助分离易位断裂点。可以使用正向与反向引物的各种组合。在一个实施方案中，所使用的实验方案是设计了6种PCR，每种都含有不同的BCR引物和全部的282种ABL引物。用于第一轮PCR的282种反向ABL引物及位于每一种引物5’末端的标签序列标签AgcaacactgtgacgtactggaggRlgtctatctaaaattcacaaggaatgcR2aggcaaagtaaaatccaagcacccR3cactcctgcactccagcctggR4caaccaccaaagtgcttttcctggR5atatggcatctgtaaatattaccaccR6tgcctcggcctcccaaagtgcR7agccaccacacccagccaggR8aataactgttttctccccccaaaacR9tgttttacaaaaatggggccataccRlOacttaagcaattctttcataaaaagggRl1ctttcaattgttgtaccaactctccRl2acctcctgcatctctccttttgcRl3aaataaagttttgagaaccataagtggR14caccatcacagctcactgcagcRl5aacctctttgagaagcggatagccR16aaagaaagtacatacctccaattttgcR17gacacattcctatgggtttaattccR18tgtaaaatatggtttcagaagggaggR19gcaggtggataacgaggtcaggR20ccagccaagaatttcaaagattagcR21gaagggagatgacaaagggaacgR22gcagaagaactgcttgaacctggR23gtggtcccagctactcgagaggR24ccctcagcaaaactaactgaaaaggR25tagaaaccaagatatctagaattcccR26ccacgcccggcggaataaatgcR27acaaaaaaagaggcaaaaactgagagR28ctgggcgcagtggctcatgccR29tggctgtgaggctgagaactgcR30ctgggcgacagagtgagactccR31aagtctggctgggcgcagtggR32aatggacaaaagaggtgaactggcR33gatagagtgaaaacgcacaatggcR34aattaaacagctaggtcaatatgaggR35ggtctccactatcaagggacaagR36aagcagctgttagtcatttccaggR37aggcatcctcagattatggctccR38cctggtaaacactgagaccctgcR39aacactcaagctgtcaagagacacR40attcaggccaggcgcagtggcR41taaatcgtaaaactgccacaaagcR42cagaggagtaggagaaggaaaaggR43ggtagctatctaccaagtagaatccR44atcagattggaaaaagtcccaaagcR45ctcctgaaaagcacctactcagcR46ctccttaaacctgaggtactgggR47ttttctcctaatagaccaccattccR48ctgctgtattaccatcactcatgtcR49ctggccaacatagtgaaaccacgR50atttgaataggggttaaagtatcattgR51cacttcagtggaagttggcatgcR52gtttttcttcgaagtgataaacatacgR53gctccttagtctatgtacctgtggR54tactctggcatggtaactggtgcR55acaaaggactaggtctgtggagcR56ccaagtttaccaaattaccaaagttaccR57tgagccgatatcacgccactgcR58tcccaataaaggttttggcccaggR59ctgggtagcaaattagggaacaggR60ctggccagaaaagacagttttatccR61ggttcccaggaagggataacaccR62tcactccaggaggttccatttccR63aggcttggaaataagcagcagtggR64attcatacaatggaatactactcagcR65taagtgatcctcccacctcaaccR66tataagaggaagactggggctggR67tcatacttatgcaggttataggaggR68caagatcacgccactgcactccR69aaaataaatagctggtgctcaagatcR70caccagcctcattcaacagatggR71caatgcagcctcaacctcctggR72gttaggtcaggtgctcatgtctgR73aagtttcaaaaggacatgtacaaaatgR74tcctgaagaggctgcagcttccR75ctggtgcacattcccaagtgtgcR76catgttggccatgttcttctgaggR77ctcagcctcccgagtagctggR78aaagacatttaagaggagatgaggcR79tgctgggattacaggcgtgagcR80tgtgacttccatccgcagctccR81gacacttttgtggagctttcatggR82catgtgagggggcacgtcttgcR83tcttctctatgagaaaagtggttgcR84tggcaaaatgctatcgagctgccR85tatgaacacagccggcctcaggR86gaggttgcagtgagctgagatcgR87gtcaagcacccagtccgataccR88atctgggcttggtggcgcacgR89gttaagcgggtcccacatcagcR90cagccagtttcagtagaaagatgcR91gacccaagcataaggggactagcR92cccaaaaagtttacaagagaaattttcR93cgcctgtagtcccagctactegR94cgcgtgatgcggaaaagaa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ctcatcaagc几乎所有的易位都涉及3kb区域的BCR基因和140kb区域的ABL基因。6种正向弓丨物被用于覆盖BCR基因的区域，282种引物被用于覆盖ABL基因的区域。建立了6种PCR，每种都含有BCR引物中的一种，所有的ABL引物，以及常规的标签引物。如果需要的话，可釆用一种巢式内部BCR引物和282种巢式内部ABL引物来进行第二轮PCR。或者，可进行1-3轮次的瓶颈PCR，从而去除非特异性扩增产物并显示出所扩增的易位序列。ABL基因中富含Alu序列，而BCR基因也含有一类这样的序列。ABL引物由此经历了随后所涉及的，针对每一种ABL引物的一个选择程序-使用标准准则进行设计-对每一种BCR引物进行配对，并通过针对BCR模板进行电子PCR扩增来进行检测。将不符合这一准则的引物淘汰。-将由12或24种ABL引物组成的池进行合并，将所述池与每种BCR引物配对，并使用由之前的PCR扩增产生的BCR模板来进行实验性的PCR进行检测。可通过检测每一种单独的ABL引物来确定哪一种能够导致扩增，来对能够产生扩增以及不能满足这一检测的任意池进行进一步分析。当鉴定之后，这样的引物被淘汰。用于实施例1中的BCR和ABL引物如实施例2所示。本领域所属技术人员应该理解在此所述的本发明可在具体描述之外进行变化与修饰。还应理解本发明包括了所有这些变化与修饰。本发明还包括单独或组合的，在本说明书中所涉及或意指的所有步骤，特征，组合物及化合物，以及任意两种或多种步骤或特征的任意或所有组合。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>[1028]<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>υ标识符I序列S￡QIDNQ:M2|aawtccccttctc^magg..................|SEQipNO:343__gatalto魄eaacctagaalgc___SBQroNO:344__dctoaactaatoigcaat^iia^_____SgQIDNO:345__cacctgfcaatecagcactttgg_____SEQIDΝΟ346__csjtwacfegocacaaagcttgtegg___SEQIDΝΟ347__gtocaga邮gotagcaagc....................SEQED勵348__acagaem^cftaiicg^gtacg_SEQ!D赃349__aoictctclHs^tagecltt^;______SHQIDΝ0350__gagctt&geuilagKBcasttcc__SEQIPNOr3SI_ctyi^ttcmaaaca^tcaigg..................SEQIDNO:352tcaagmmgg^g^cigt^gc_—_SEQΠ)NO:3S3__SEQBPNO:354,tagcc^gcat^tggcacg__SEQIDND:3S5__atcatgcWteaMt^aaa邮___SEQIDNQ:356__ttERC^l^哪cagt^acc..................................................................................SEQIPMO:357__鄉想餅烛c____^SEQIDNO:35&ttge_aataatcattt娜耽_SEQIONO'359娜taac^ttec紀tgggatgg__SEQIDNO:36Qaggetaigttcccttctcttoc.........................SBQIDMa細__smt^ccmcwcm&muuc_____SEQID__cta&cctfeg^caam^gcg_______SEQIONQ:363__tctoctcctc^eteg^lcag_________SBQIDNQ:3^__gt^aataffl脚tgeagcaa膝___SEQIPNQ:365__ta&aacaaamfigcttataaaagc__S￡QIPNQ:366__ccactciaccttEattccttgcc_SEQIPNO:367__agaoca&satatgcaagcaaagg_..._____SEQIDNQ:368__ggaciOTigc卿t声脚_____SEQIDNO;369__aaggaacaaactgRgtcacatac__SEQIDNO:37D”atgtaictgjgg^ctacaggtgc___SEQIDNO:371__ggcicatggclgtaatcccagc____SEQIDNO:372__atMae^ttttcacacaaaaaflatEc____SEQIDNO:373“tgfcgcgacaeaKcaagactcc_SEQIDKO:374aaa^tccctmagtgatcaac哪_SEQIDNO:375caaaciaignttacctcatcagc...............................SEQID赚376__aEtgatctttcctclttaacctoc......................SEQIDHOi377ccagctitlcag^a^cc^gg_SEQID>10:378ctteaaciittat&acactgtctlgc__mstmm-m_SHjIDNO;380__tccaaa&catgcctacattotacc...................SBQJDNO;381acat^acatacatgcagt^ctigc_..SiQIBH0382馆cs寧RccagccaoGsfec_................................Si<jIDNQ:383gcctfitaatcccagcsclcte..............................SEQIDNO;384gnea麵cccacfcttgt^_____SEQIDNQ;383atacc锨___SEQIDNO細tatcttactp^tatfi^ataat^oc__________SEQIDNO:387____SEQPHO:388__cctit^lcaca玲·^cttcc_.____SEQII>N0;3I9__to咖__SEQK>NO:39Q腿tee_SBQIDNO·__accactacgctccagcc^g__________________________________________________________________________SBQIPNO:392__gatoc^g^ea錤鹏麵_^EQID勵393tgtaa^tc^ctacttggg^gg<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>"F列标识符I序列SEQIDN0;498^cgi^tgattetcttlctgc’..........................“““SBQIPΝΟΛ99atccaaCTCCte^pccfcc_SgQID搬郷cac^tBfictgg^cttaatig_______SSQIDHQ:50iatag@_atatgccacto舰______SEQIDNQ:502__fecgl&agccaccgc&octgg______SEQIDKO:5Q3__ctccau^cac麯amtatamgc___SBQIPNO:594a&acis&agtctcgttc^tcgc_SEQIDNO:3Q5tcccagjnaiagccatK^cc_____SHQIDH0t5D6tattttgagagtcteactct^g_____SEQIDNO:5Q7__gtetcaaactcctgaoctcagg_SEQIDNO:SOS__棚腳麵脚ctacs________SEQIDNO;5Q9__gtetoaEgmt^acttacteg_____SEQID>10:510m^&atcttaaatgcat^gtc__SEQn>H0;5n_^scactotcaaa零feacMi______SEQIDNO:5|2_____SEQIDM0:S13cafflaa^tgaaatfeaal^ttaa&cc_SEQIDNO;514ga^aca醒Itycacia^tteg__“SEQIDN0;51SocagcagrnggnaggctgagsSEQIDHQ;516gwccaagtatcatgg^aUgg_‘_BEQIDHQ:Si7__cag^aeg&ctgct^&ttoc__—__SEQΠ)NQ:Si8accaggegcg^ggctcacjB_SEQIDHQ:519carggct^teatoccaEctagc_SEQIDNO^O__atgtaaat^pae^stcactttagg___SEQΠ>NQ:52lcccacaatecagagaactcttacc___SEQIDN0;532tRanagatgcascc^agtgtcc____SEQIDNO:523t^tttt^tcctgccttmtec_____SEQll>NQ:524_ficmcctBBBtciceaitctgg_SEQIDNQ:525__gcagccgcttgaaa^aaaacagc___SBQIDNO:526__^tcacgttacamgKEggtgg.........................SEQlDΝΟ527__taggctgaaaaacteaaatttgttgc___SEQIDNQ;528__ctcclttggficiccttlaatcc_____SBQID勵529__gcc咖cctcccaaag^c_____SEQIDN0^530__aatga^aagagamggcagg_S￡QIDNQ;53I__gWitggegmcac^EgttRg______SEQIDNO:532__CgCMtcttggcac^cacto_SEQIDNO:533__agttctcclccamgmcmg_SEQJDHQ:534__CKtgcccgRRClcagltctac__SEQn>MO;53S__ocaaaacaataaaatcncaatt^Rg_SEQIDHO;536__ctgaactjfficcttaEa^aatccg_________SEQIDHO:537__amctgtatcaggteWi^c<___SEQIDNO538__^ct^occcttcactgtttce___SEQIPNQ:53^__caaaaatt^gccaggcatggtM_STOIDNO540__gcagtgagcagt嫩gaicc__._SEQIONO:541__aaagactytgaaciaactWlc__SEQIDNOt542__^aagaattacaciatIattBgieo_SEQIDNO;543__...............................SEQIDNO;544gtaagagcigacgigtattgtgc__SEQIDHO:54S__cecggtgaagcc^cacmtcc........SEQBDNO:346__c^cgccmacwctcc___SEQIDHO:S47__cggcgcetagp聊atcg_SEQIDMQ:548^maaaBaaacgaacafgfteaoc___SEQIDNO:549~gagaccgagtcttgclgtgtcg^'"“<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>权利要求鉴定基因断裂点的方法，所述方法包括(i)使DNA样本接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(ii)扩增步骤(i)的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的其他反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(v)分析所述扩增的DNA。2.鉴定基因易位断裂点的方法，所述方法包括(i)使DNA样本接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的反义链的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(a)的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同；(c)针对步骤⑴(a)中正向引物寡核苷酸标签的引物；以及(d)针对步骤(i)(b)中反向引物寡核苷酸标签的引物；(ii)扩增步骤⑴中的DNA样本；(iii)任选地使步骤(ii)中产生的扩增子接触(a)一种或多种正向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点5’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种正向引物的3’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；以及(b)一种或多种反向引物，所述引物针对位于相对所述基因断裂点3’的侧翼基因或其片段的DNA区域，所述引物针对位于步骤(i)中一种或多种反向引物的5’端的DNA区域，且所述引物任选地在其5’末端可操作地连接于寡核苷酸标签；(c)针对步骤(iii)(a)中正向引物寡核苷酸标签的引物；以及(d)针对步骤(iii)(b)中反向引物寡核苷酸标签的引物；其中所述正向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的正向引物标签相同，且所述反向引物的寡核苷酸标签相对于步骤(iii)(a)中的反向引物标签相同，但所述正向引物寡核苷酸标签相对于反向引物标签不同，且步骤(iii)中的正向与反向引物标签相对于步骤(i)中的正向与反向引物标签不同；(iv)扩增步骤(iii)中的DNA样本；(v)分析所述扩增的DNA。3.权利要求1或2所述的方法，其中至少一组所述正向与反向引物连接于寡核苷酸标签。4.权利要求1或2或3所述的方法，其中在步骤(i)(a)中使用了一种引物而在步骤⑴(b)中使用了两种或更多种引物。5.权利要求1或2或3所述的方法，其中在步骤(i)(b)中使用了一种引物而在步骤⑴(a)中使用了两种或更多种引物。6.权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中进行了步骤(iii)，且在步骤(iii)(a)中使用了一种引物而在步骤(iii)(b)中使用了两种或更多种引物。7.权利要求1-5中任一权利要求所述的方法，其中进行了步骤(iii)，且在步骤(iii)(b)中使用了一种引物而在步骤(iii)(a)中使用了两种或更多种引物。8.权利要求1-7中任一权利要求所述的方法，其中所述基因断裂点是基因易位断裂点或同源重组点。9.权利要求8的方法，其中所述基因易位断裂点是染色体基因易位断裂点。10.权利要求9的方法，其中所述基因易位断裂点选自(i)BCR-ABL易位(ii)PML-PARa易位(iii)t(2；5)(p23；q35)易位(iv)t(8；14)易位(v)t(9；22)(q34；qll)易位(vi)t(ll；14)易位(vii)t(ll；22)(q24；qll.2-12)易位(viii)t(14；18)(q32；q21)易位(ix)t(17；22)易位(x)t(15；17)易位(xi)t(l；12)(q21；pl3)易位(xii)t(9；12)(p24；p13)易位(xiii)t(X；18)(pll.2；qll.2)易位(xiv)t(l；11)(q42.1；ql4.3)易位(xv)t(l；19)易位。11.权利要求1或2或3的方法，其中在步骤(i)(a)中使用了1-30种引物而在步骤⑴(b)中使用了24-400种引物。12.权利要求11的方法，其中进行了步骤(iii)，且在步骤(iii)(a)中使用了1-30种引物而在步骤(iii)(b)中使用了24-400种引物。13.权利要求1-5或8-11中任一权利要求所述的方法，其中仅进行了步骤(i)，(ii)和⑷。14.权利要求13的方法，其中还进行了步骤(iii)和(iv)。15.权利要求13的方法，其中所述在步骤(ii)中扩增的DNA被用于进一步的扩增，选择或富集。16.权利要求15的方法，其中所述扩增是瓶颈PCR。17.权利要求14的方法，其中所述在步骤(iv)中扩增的DNA被用于进一步的扩增，选择或富集。18.权利要求17的方法，其中所述扩增是瓶颈PCR。19.权利要求1或2的方法，其中所述基因断裂点是染色体BCR-ABL易位且(a)步骤(i)(a)中的正向引物对应于SEQIDNOs:10_15；且(b)步骤(i)(b)中的反向引物对应于SEQIDNOs:23-304且连接于由SEQIDNO22所限定的寡核苷酸标签且其中如果进行步骤(iii)，那么(a)步骤(iii)(a)中的正向引物对应于SEQIDNOs:16_21；且(b)步骤(iii)(b)中的反向引物对应于SEQIDNOs:306-587且连接于由SEQIDNO305所限定的寡核苷酸标签。20.权利要求1或2的方法，其中所述基因断裂点是染色体PML-RARalpha易位且(a)步骤(i)(a)中的正向引物对应于SEQIDNOs:588_593；且(b)步骤(i)(b)中的反向引物对应于SEQIDNOs:601-634且连接于由SEQIDNO22所限定的寡核苷酸标签且其中在步骤(ii)之后是采用对应于SEQIDNOs:594_599的引物进行瓶颈PCR。21.监测哺乳动物疾病状态的方法，所述疾病状态是由基因断裂点来表征的，所述方法包括在得自所述哺乳动物的生物学样本中筛选所述断裂点的存在，所述断裂点可根据权利要求1-20中任一权利要求所述的方法进行鉴定。22.权利要求21的方法，其中所述疾病是间变性大细胞淋巴瘤伯基特氏淋巴瘤CML,ALL外套细胞淋巴瘤眷尤因氏肉瘤滤泡性淋巴瘤眷隆凸性皮肤纤维肉瘤急性早幼粒细胞性白血病急性粒细胞白血病滑膜肉瘤眷精神分裂症急性前B细胞性白血病。23.DNA引物组合，所述引物组合被设计为用于扩增和/或否则(otherwise)检测基因断裂点，所述断裂点可根据权利要求1-20中任一权利要求所述的方法进行鉴定。全文摘要本发明涉及鉴定DNA断裂点的方法以及所述方法中所使用的制剂。更特别的，本发明提供了基于应用新型多重PCR扩增技术来鉴定基因易位断裂点的方法。本发明所述方法不仅可协助对断裂点位置的鉴定，还可进一步有助于分离所述断裂点在其中出现的DNA片段。这就提供了有价值的机会来对断裂点区域进行深入分析，例如对所覆盖的区域进行测序。本发明的方法可用于各种应用，包括，但不限于，提供常规手段来对患者体内与疾病发生相关基因断裂点的表征，并由此能够设计患者特异性的探针和引物从而对患者的疾病状态进行持续的监测。除了通过对所存在的断裂点进行表征来监测疾病的进程，在所述疾病是赘生物的范围内，还能够对所存在治疗药物和/或新治疗药物的有效性进行评估，对患者从缓解状态复发的可能性进行预测。文档编号C12Q1/68GK101835900SQ200880018488公开日2010年9月15日申请日期2008年5月30日优先权日2007年6月1日发明者A·A·莫利申请人:莫诺匡特私人有限公司