抗her2-靶向治疗中脂质激酶和与所述脂质激酶相关的信号转导途径的参与的制作方法

专利名称：：抗her2-靶向治疗中脂质激酶和与所述脂质激酶相关的信号转导途径的参与的制作方法主几HER2國革巴向〉台行:中脂质激酶和与所述脂质激酶相关的信号转导途径的参与本发明涉及一种用于确定患有癌症的个体对HER2-靶向治疗是否处于呈现或获得应答降低的风险的方法，以及应用脂质激酶活性的抑制剂以增加HER2-靶向治疗的敏感性。曲妥珠单抗(赫赛汀@)是以人表皮生长因子受体2(HER2)为靶标的单克隆抗体，HER2是一种在所有侵犯性乳腺癌中过表达20-25%的受体酪氨酸激酶。在联合化疗的大约60%的患者中观察到了显著的初始应答。然而，大多数应答患者最后对基于曲妥珠单抗的治疗产生耐药(Slamon,等.NewEnglJMed344,783-792(2001);Vogel,等.JClinOncol20,719-726(2002);Cobleigh,等.JClinOncol17，2639-2648(1999))。受体酪氨酸激酶的表皮生长因子(EGF)家族由四种受体组成，ErbB1(HER1)、ErbB2(HER2/Neu)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。EGF-受体家族的成员包括包含在配体结合和受体二聚化的胞外区、单跨膜区和胞质酪氨酸激酶区。配体结合会诱导受体的二聚化，导致胞内区的自磷酸化，从而在信号转导分子的受体上产生对接位点。这些信号转导分子包括Grb-2，其可激活Ras和Ras-依赖型的丝裂原活化蛋白激酶信号级联，最后导致转录因子(如促进基因表达和有助于细胞增殖的c-fos、AP-l和Elk-l)的激活；PLC，其可导致细胞内Ca2—增加及PKC的激活；磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),其可导致局部产生PIP3[磷脂酰肌醇(3,4，5)-三磷酸]，随后向质膜补充AKT，在质膜被磷酸化和活化；以及JAK/STAT，其通过JAK/STAT途径的激活，导致核基因表达激活。结合配体后，由于内吞作用EGF受体迅速被内化。这一过程被认为是需要网格蛋白，且发生在包被网格蛋白的小窝中，从质膜处夹断形成小囊泡移动到初级内体中。从初级内体中，受体被再循环到细胞表面，或穿过次级内体移动到溶酶体中用于蛋白降解。曲妥珠单抗发挥其抗肿瘤活性的这种机制尚未完全清楚。有研究表明曲妥珠单抗能诱导抗体依赖型细胞毒作用(ADCC);抑制HER2胞外区酶切；以及通过下调HER2信号或者通过增加磷酸酶与张力蛋白同源物，使染色体TEN(PTEN)膜定位和磷酸酶活性缺失，导致减弱PI3K7AKT途径激活和抑制增殖，来抑制PI3K/AKT生存信号(Morris和Carey，Oncology20,1763-1771(2006))。细胞对曲妥珠单抗耐药的机制目前尚不明确。可能的机制包括在所述细胞如HER1和HER3中接替HER2作用的HER2-相关受体的激活，或者诸如胰岛素-样生长因子I受体的非-HER受体的激活；阻止结合曲妥珠单抗的HER2的突变；由细胞表面粘蛋白增加引起的结合曲妥珠单抗的阻滞；HER2的降解增加；细胞循环抑制剂p27KIP的下调；以及脂质磷酸酶PTEN的失活(Sergina，等.Nature445,437-441(2007);Morris和Carrey,Oncology20:1763-1771(2006))。尽管上述任何一种机制都可能与曲妥珠单抗耐药有关，但是它们不能解释所有观察到的HER2-耐药的肿瘤。HER2过表达的半数乳腺癌患者最初对基于曲妥珠单抗的治疗都是非易感的，而大多数患者在治疗期间对曲妥珠单抗产生耐药。对耐药机制的认识将会促进合理的药物联用的发展以防止耐药发生，并可以选择易应答(敏感)的患者。在本发明中，我们发现PI3K的突变或与PI3K相关的信号转导途径的激活与HER2耐药的发生有关。因此本发明提供了一种用于确定患有癌症的个体对HER2-靶向治疗是否处于呈现或获得应答降低的风险的方法，所述方法包括测定所述个体的所述癌症细胞样品中的PI3K核苷酸序列或其部分序列，将所述序列与对照样品中PI3K的相应序列进行对比，在对比的基础上确5定所述风险。细胞样品涉及所述个体的相关样品，包括癌细胞或癌细胞残留，如核酸分子或氨基酸分子。相关细胞样品包括含有来自癌细胞的核酸分子或蛋白质的细胞或细胞残留。PD-激酶包括能在肌醇环的3'位将磷脂酰肌醇磷酸化、产生磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PI3，4,5-P3)的酶族，PI3,4，5-P3被认为是作为第二信使控制细胞活性和特性，包括增殖、生存、活动力和形态学。磷脂酰肌醇衍生物可通过与包括底物同源(PH)结构域的蛋白质相互作用来用作对接位点，从而调节定位，也常常调节PH-蛋白(PH-comprisingproteins)的活性。I类PI3-激酶族成员包括调节亚基p85与催化亚基pll0形成的异源二聚体。在一些原发性结肠和卵巢肿瘤中发现编码调节亚基p85a的基因的突变(Bader等.NatureReviewsCancer5:921-929(2005))。目前已知四种催化亚基，包括PIK3催化的a(PIK3CA)、PIK3CB、PIK3C2B和PIK3CG。其中，编码PIK3CA的基因与癌症有关。已经在结肠、乳腺、肝、大脑、胃、肺和卵巢肿瘤样品中鉴别出PIK3CA基因的体细胞突变(Karakas等.BritishJournalofCancer94:455-459(2006)),而基因的过表达与卵巢癌、宫颈癌、及头颈部鳞状细胞癌有关(Pedrero等.Int.J.Cancer114:242-248(2005))。在螺旋区和催化激酶区都高频率地识别出一些突变(Bader等.NatureReviewsCancer5:921-929(2005))。因此在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括确定PIK3CA的核苷酸序列，或其部分序列或衍生序列。所述其部分序列或衍生序列优选包括编码一或多个表4中列出的氨基酸残基的核酸序列。所述其部分序列或衍生序列进一步优选包括编码蛋白C-末端(C-terminalhalf)的核酸序列，蛋白包括螺旋区和激酶区，大约从氨基酸残基编号520开始(见图7)。在更进一步优选的实施方案中，所述其部分序列或衍生序列包括外显子9或外显子20中出现的核酸序列，分别编码部分螺旋区和部分催化区。对照样品中的PIK3CA序列是指PIK3CA的野生型核苷酸序列(见图7)。作为野生型序列的模型，对照样品的GenBank登录号为NM一006218。然而，对照样品也可以来自未受影响的个体，例如未受影响的近亲属。与对照样品中的PIK3CA核苷酸序列相比，改变的PIK3CA核苷酸序列指的是导致编码蛋白的氨基酸序列变更的任何改变的核苷酸序列。优选所述改变导致了与PIK3CA相关的信号转导途径的活性增强。在人类癌症中已经识别了PIK3CA的改变，这些改变能增强PIK3CA的活性，这些改变包括下列任一位点的氨基酸的改变38(精氨酸)、60(谷氨酰胺)、88(精氨酸)、104(脯氨酸)、106(甘氨酸)、108(精氨酸)、IIO(谷氨酸)、111(赖氨酸)、118(甘氨酸)、122(甘氨酸)、124(脯氨酸)、345(天冬酰胺)、350(天冬氨酸)、378(半胱氨酸)、405(丝氨酸)、418(谷氨酸)、420(半胱氨酸)、453(谷氨酸)、539(脯氨酸)、542(谷氨酸)、545(谷氨酸)、661(谷氨酰胺)、701(组氨酸)、733(赖氨酸)、901(半胱氨酸)、909(苯丙氨酸)、1008(丝氨酸)、1011(脯氨酸)、1021(酪氨酸)、1025(苏氨酸)、1035(谷氨酸)、1043(甲硫氨酸)、1044(天冬酰胺)、1046(丙氨酸)、1047(组氨酸)、1049(甘氨酸)或1065(组氨酸)，其中有关PIK3CA氨基酸序列的编号见图7中的描述(见表4)。因此，出现这些改变中的一个或多个，就表明关于HER2-靶向治疗耐药的风险增加。在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括在如图7所述编码PIK3CA的核酸的1624、1633、1634、3075、3127、3140或3147任一位点，或在编码PIK3CA的基因核酸分子中相应的位点，或在所示核苷酸序列的任何部分或衍生序列中相应的位点，确定PIK3CA的核苷酸序列，其中编码的氨基酸在位点542(谷氨酸)、545(谷氨酸)、1025(苏氨酸)、1043(甲硫氨酸)、1047(组氨酸)或1049(甘氨酸)处，从所示氨基酸改变为另一个氨基酸，表明对HER2-靶向治疗耐药的风险增加。在进一步优选的实施方案中，本发明的方法包括在如图7所述编码PIK3CA的核酸的1624、1633、1634或3140任一位点，或在编码PIK3CA的基因核酸分子中相应的位点，或在所示核苷酸序列的任何部分或衍生序列中相应的位点，确定PIK3CA的核苷酸序列，其中编码的氨基酸在位点542(谷氨酸)、545(谷氨酸)和1047(组氨酸)处，从所示氨基酸改变为另一个氨基酸，表明对HER2-靶向治疗耐药的风险增加。可以通过本领域已知的任何方法确定PIK3CA的核苷酸序列，包括但不限于编码PIK3CA的基因区的序列分析，mRNA产物或mRNA产物衍生物如cDNA产物的序列分析，通过本领域已知的任何方法，包括但不限于双脱氧测序、基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱，以及杂交测序，包括与寡核苷酸特异性序列杂交和与寡核苷酸芯片(oligonucleotidearray)杂交。还可以通过使用突变分析法确定PIK3CA的核苷酸序列，如单链构象多态性、DNA异源双链体分析、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳。可以通过对包括PIK3CA基因或其mRNA产物的相关核酸分子的直接序列分析，或在PIK3CA基因或其mRNA产物的全部或任何部分扩增之后通过相关核酸的间接序列，进行序列分析。可选的直接或间接方法包括杂交保护分析、等位基因特异性扩增、连接酶介导检测、引物延伸和限定性片段长度分析。在一个可选的实施方案中，PIK3CA中的突变的出现表明对HER2-耙向治疗耐药的风险增加，这种突变可以通过对编码蛋白的分析来确定，例如，蛋白序列测定、二维凝胶电泳、多维蛋白鉴别技术、ELISA、液相色谱-质谱(LC-MS)、基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)、或者应用与PIK3CA非突变的正常型或PIK3CA突变变异型有相互作用的抗体。另一方面，本发明提供了一种用于确定患有癌症的个体对HER2-靶向治疗是否处于呈现或获得应答降低的风险的方法，所述方法包括测定所述个体的所述癌症细胞样品中与PI3K相关的信号转导途径的活性状态，以及基于所述状态确定所述风险。根据本发明一个优选的方法，将所述活性状态与对照样品中所述信号转导途径的活性状态进行对比，在所述对比的基础上确定所述风险。术语信号转导是指一种过程，通过该过程细胞将细胞外的信号转换成应答，包括从一种物理的或化学的形式转换成另一种形式的信号延迟。信号转导途径通常由从细胞的一个区室，如细胞膜向另一个区室，如细胞核传导的一系列信号组成。信号转导途径可以包含不同的信号，例如诸如细胞钙浓度和环磷腺苷浓度的特异性第二信使，通过离子通道进出细胞的特异性离子，如磷酸化或去磷酸化的蛋白修饰，蛋白定位，蛋白酶切，蛋白降解，通过例如结合辅因子诸如鸟苷三磷酸的蛋白激活，诸如脂质酶切、脂质磷酸化和脂质去磷酸化的脂质修饰，以及转录激活。信号转导途径的激活结果根据例如细胞类型、细胞既往史和在所述细胞中有活性的其他信号转导途径而有所不同。信号转导途径的激活可以导致细胞增殖、细胞激活、细胞分化、细胞改型和细胞死亡，或其他效果。与PI3K相关的信号转导途径的活性状态可以通过对所述活性的指标进行定量来确定。所述可定量的指标包括编码PBK的基因的扩增，PI3K的表达水平，PI3K的活性和至少一种下游指示基因的表达水平，其表达水平依赖与PI3K相关的信号转导途径的活性。对照样品用于进行对比，以确定相对于所述对照样品而言，与PIK3CA相关的转导途径是否受到影响。所述对照样品可以包括对照细胞样品。更清楚的说，如果患病个体患的是乳腺癌，那么对照细胞样品包括乳腺细胞或其残留。如果患病个体患的是前列腺癌，那么对照细胞样品包括前列腺细胞或其残留。所述对照样品可以同来自所述个体的所述样品一起分析。优选地，来自对照样品的相关数据保存在存储设备中，与所述个体中与PIK3CA相关的途径的活性状态进行对比。存储设备可以是保存数据的任何设备，包括但不限于实验室笔记本，有可读存储介质的电脑，以及包括来自患者的相关数据的数据库，所述患者是确定了与PIK3CA相关的途径的活性状态并接受了HER2-乾向治疗的患者。如果所述对照样品从显示无应答或弱应答的患者中获得，或从对HER2-乾向治疗耐药的患者中获得，且如果患病个体中所述途径的活性状态与对照样品中所述途径的活性状态相似，那么患有癌症的个体处于呈现或获得应答降低的风险。如果所述对照样品从健康患者中获得，或从对HER2-靶向治疗显示良好应答的人中获得，所述个体和所述对照样品之间的途径的活性状态具有相似性，则表明关于HER2-靶向治疗呈现或获得应答降低的风险低。对本领域技术人员来说，风险也可以根据所述个体的所述途径活性状态与对照样品相比的差异进行分类，这是很清楚的。为了确定与PIK3CA相关的途径的活性状态是否与对照样品中所述途径的活性状态相似，确定了阈值水平。如果所述对照样品从健康患者中获得，或从对HER2-靶向治疗显示良好应答的人中获得，那么分数高于预定阈值的样品就被分到关于HER2-靶向治疗呈现或获得应答降低具有低风险的类别中，而分数低于所述阈值的样品就被分到具有高风险的类别中。与PIK3CA相关的转导途径是指受PIK3CA激活或抑制的影响的一或多个信号转导途径。所述信号转导途径的抑制或激活可以导致基因产物活性的差异、基因产物定位的差异、基因产物表达水平的差异10和基因产物修饰的差异。与PIK3CA相关的途径的活性状态可以通过本领域已知的任何方式确定，包括但不限于确定PIK3CA基因的扩增状态，确定来自PIK3CA基因或所述途径中其他基因的基因产物的表达水平，以及确定来自PIK3CA基因的基因产物的活性。在本发明的这一方面，优选的细胞样品表示采集样品时被表达的所有基因的定量的拷贝。为了保存定量的拷贝，样品可以通过技术人员已知的多种方式处理。优选地，它们是在获取细胞或组织时新鲜制备的，或从在-7(TC保存备用的外科活组织中制备。可选地，组织或外科活组织保存在保证RNA品质的保护条件下。这些保存条件优选的示例是釆用例如福尔马林，RNA酶抑制剂，如RNAsin(Pharmingen)、RNasecure(Ambion)或RNalater(Ambion)固定。在一个可选的实施方案中，细胞样品可以通过针穿刺活检制备，该程序是将细针插入组织中抽取细胞。针穿刺活检经处理并保存在保证RNA品质的保护条件下。这些保存条件的示例是釆用例如福尔马林，RNA酶抑制剂，诸如RNAsin(Pharmingen)、RNasecure(Ambion)或RNalater(Ambion)固定。确定与PIK3CA相关的途径活性状态的优选方法包括确定编码PIK3CA的基因的扩增。PIK3CA的基因扩增可以在几种癌症中检出，包括胃癌(Byun等.2003.IntJCancer104:318-27)、卵巢癌(Campbell等.2004.CancerRes.64:7678-7681)和口腔鳞状细胞癌(Kozaki等.2006.CancerSci.97:1351-8)，且PIK3CA的基因扩增与PIK3CA转录表达增加有关。PIK3CA基因的扩增状态包括荧光原位杂交，显色原位杂交，Southern印迹，全基因组DNA微阵列芯片杂交，以及定量聚合酶链反应(qPCR)。在另一个优选的实施方案中，通过测定来自PIK3CA基因的基因产物的表达水平，确定所述与PIK3CA相关的途径的活性状态。扩增和转录激活可以导致PIK3CA的过表达，导致与PIK3CA相关的途径活性增强。来自PIK3CA基因的蛋白产物的表达水平可以通过本领域已知的任何方式确定，包括但不限于二维凝胶电泳、酶链免疫吸附测定(ELISA)和Western印迹。确定PIK3CA基因的核酸表达水平的方法对于技术人员是已知的，包括但不限于Northem印迹、定量PCR和微阵列分析。Northern印迹包括采用凝胶电泳分离核酸表达产物后，与和所述核酸表达产物具有特异性相互作用的标记探针杂交，对来自PIK3CA基因的核酸表达产物进行定量。对与所述核酸表达产物具有特异性相互作用的标记探针的定量是一种确定表达水平的方法。通过比梦两个分离的样品的表达水平，其表达水平已知没有差异，比较它们的核酸表达产物的总量的差异，可以对确定的表达水平进行标准化。定量-PCR(qPCR)提供了定量来自PIK3CA基因的核酸产物的表达水平的可选方法。逆转录之后，通过实时PCR(rtPCR)，进行qPCR，反应过程中监测产物的量，或者通过终点测量，以此确定终产物的量。技术人员已知，可以通过使用核酸插入剂，如溴化乙锭或SYBR⑧绿色I染料(该染料能与所有生成的双链产物相互作用导致扩增过程中荧光增强)，或者通过使用特异性地与生成的有关基因的双链产物相互反应的标记探针进行rtPCR。通过树状信号放大、杂交信号放大和分子信标提供了可以应用的可选的检测方法。技术人员已知的扩增方法都可以应用到qPCR中，包括但不限于PCR、滚环扩增、基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增和线性RNA扩增。微阵列分析包括固定在表面的所选生物分子的应用。微阵列通常包括核酸分子、所述探针，它们能够与核酸表达产物，如来自PIK3CA基因的核酸表达产物杂交。探针暴露在标记的样品核酸中，杂交后，测定探针补体样品中的核酸表达产物的丰度。微阵列中的探针可以包括DNA序列、RNA序列或DNA与RNA的共聚序列。探针也可以包括DNA和/或RNA类似物，如核苷酸类似物或肽核酸分子(PNA)，或者其组合。探针序列可以包括基因组DNA片段。这些序列还可以是合成的核苷酸序列，诸如合成的寡核苷酸序列。在进一步优选的实施方案中，确定与PIK3CA相关的信号转导途径的活性状态包括确定PIK3CA激酶的活性。PIK3CA的过表达和突变可以导致PIK3CA的激酶活性增强，对HER-2乾向治疗产生耐药。用于确定PIK3CA激酶活性的适当的检测方法，如那些基于将嫌脂酰肌醇(4，5)-二磷酸转化成磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸的检测方法是本领域已知的，还包括PI3激酶ELISA(EchelonBiosciencesInc)、TruLight磷酸肌醇3-激酶检测法(Merck/Calbiochem)，及PI3-激酶HTRF⑧检测法(Upstate/Millipore)。在依据本发明进一步优选的方法中，确定与PIK3CA相关的信号转导途径的活性状态包括确定PIK3CA的核苷酸序列。PIK3CA的核苷酸序列与对照样品中PIK3CA的核苷酸序列相比有所改变，其中优选导致与PIK3CA相关的信号转导途径的活性增强的所述改变。优选在如图7所述编码PIK3CA的核酸的1624、1633、1634或3140位点上的改变，或者在编码PIK3CA的基因核酸分子相应位点的改变，或在所示核苷酸序列的任何部分或衍生序列中相应位点的改变，其中编码的氨基酸在位点542(谷氨酸)、545(谷氨酸)和1047(组氨酸)处，从所示氨基酸到另一个氨基酸的改变，表明对HER2-靶向治疗耐药的风险增加。在另一个优选的实施方案中，确定与PIK3CA相关的信号转导途径的活性状态包括确定至少一个PIK3CA指示基因的表达水平。PIK3CA指示基因是其表达水平由与PIK3CA相关的途径控制的基因。PIK3CA指示基因可以通过对比基因的表达水平进行鉴别，这13些基因在细胞中以与PIK3CA相关的途径的不同活性来表达，如本申请中所述方法之一估计的一样。依赖于与PIK3CA相关的途径的激活，可以上调或下调所述指示基因的表达水平。例如可以通过釆用PIK3CA抑制剂与细胞接触以抑制PIK3CA活性，或者通过PIK3CA的外源性表达或激活细胞中的PIK3CA突变型以激活PIK3CA活性，来获得与PIK3CA相关的途径的活性差异。已知的PIK3CA抑制剂包括渥曼青霉素、LY294002、PX-866、ZSTK474,以及反义RNA分子的表达、siRNA分子或抗PIK3CA亚基之一的抗体。优选地，通过将细胞中表达野生型PIK3CA的基因表达水平与细胞中表达改变PIK3CA的所述基因表达水平进行比较，识别所述至少一种PIK3CA-抑制剂基因，其中所述改变PIK3CA包括导致激活所述蛋白的改变。可以应用监督分析来识别PIK3CA-抑制剂基因，其表达水平能指示与PIK3CA相关的途径的活性。可以通过将对HER2-乾向治疗有应答的患者样品与对HER2-靶向治疗耐药或获得耐药的患者样品中的PIK3CA-抑制剂基因的表达水平进行比较，验证所述PIK3CA-抑制剂基因。为同时检测多种核酸基因表达产物，可以采用qPCR法，如逆转录酶多重连接探针扩增法(rtMLPA)，该法在单管测试中可以精确定量多达45个有关转录物(Eldering等，NucleicAcidsRes2003;31:e153)，如果技术人员已知的话，还可以应用微阵列分析。另一方面，本发明用于确定患有癌症的个体对HER2-靶向治疗是否处于呈现或获得应答降低的风险的方法中，所述治疗是指选自基因治疗、化疗、化合物-介导治疗、siRNA-介导治疗、蛋白治疗和抗体-介导治疗的治疗。优选地，所述HER2-靶向治疗选自酪氨酸激酶抑制剂，诸如拉帕替尼二甲苯磺酸酯(Tykerb,GSK)、Tak165(武田制药公司)、吉非替尼(Iressa⑧，英国阿斯利康公司)、埃罗替尼(OSI-774,特罗凯)、CP-724714(辉瑞)和CI1033(PD183805;辉瑞)；反义技术，核酶和下调HER2表达水平的siRNA;抗体，诸如曲妥珠单抗(Herceptin)、帕妥珠单抗(Omnitarg⑧)；以及疫苗，诸如重组体dHER2疫苗(GSK)和Neuvenge⑧(APC8024，Dendreon)。在一个优选的实施方案中，所述HER2-耙向治疗包括抗体-介导的HER2-乾向治疗。结合ErbB2(HER2/Neu)胞外区的抗体能阻断HER2过表达的功能。目前，已知两种抗体在HER2的胞外区能结合不同的表位。重组体人源HER2单克隆抗体帕妥珠单抗(Genentech,加利福尼亚州旧金山)空间上阻断HER2与EGFR和HER3的二聚体，而结合曲妥珠单抗可以通过促进受体细胞内吞作用来阻断HER2的激活(Nahta等.2006.NatClinPractOncol.3:269-280)。在一个更优选的实施方案中，所述抗体介导的治疗包括曲妥珠单抗。曲妥珠单抗(Herceptin)是第一个批准用于治疗HER2-阳性转移性乳腺癌的人源抗体。曲妥珠单抗与紫杉醇联用，可以治疗肿瘤过表达HER2蛋白的转移性乳腺癌患者。然而，曲妥珠单抗耐药是一个普遍问题，最终导致治疗失败。鉴别患者对曲妥珠单抗耐药或可能耐药对适当治疗这些患者非常重要。另一方面，本发明提供了PIK3CA抑制剂、或优选地PIK3CA突变型抑制剂在制备治疗HER2-耐药癌症患者的药物中的应用。PIK3CA或者与PIK3CA相关的途径的激活，可导致对HER2-乾向治疗耐药。因此，抑制PIK3CA活性可以恢复关于HER2-靶向治疗的敏感性。已知PIK3CA的抑制剂包括渥曼青霉素、LY294002、PX-866、ZSTK474、反义RNA分子、siRNA分子或抗PI3激酶亚基之一的抗体，诸如P85或P110亚基。已知表达HER2的、以及从HER2-靶向治疗获益或可能获益的恶性细胞包括前列腺细胞、膀胱细胞、输尿管细胞、乳腺细胞、骨细胞、结肠细胞、胃食管细胞、肾细胞、肝细胞、卵巢细胞、胰脏细胞、鳞状肺细胞和肺腺癌细胞。对于患有骨肉瘤、及肺癌、胰腺癌、唾液腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌和膀胱癌的患者，正在进行包含HER2-乾向治疗的临床试验。在一个优选的实施方案中，所述癌症患者是乳腺癌患者。HER2-阳性乳腺癌比其他类型的乳腺癌更具有侵袭性，而且对激素治疗应答较少。使HER2-阳性乳腺癌细胞对HER2-靶向治疗产生敏感或重新敏感，将改善这类癌症的结局。图1为识别PTEN作为曲妥珠单抗疗效调节剂的shRNA条形码筛选。图2为细胞培养物中PTEN下调和激活对曲妥珠单抗耐药的PI3K信号。图3为曲妥珠单抗治疗HER2-阳性患者的Kaplan-Meier生存曲线。图4为PTEN免疫组织化学的分析图。图5为PIK3CA序列分析图。图6为离体队列研究曲妥珠单抗治疗HER2-阳性患者的Kaplan-Meier生存曲线。图7为GenBank登录号NM—006218的野生型PIK3CA的核苷酸和蛋白序列。具体实施例方式实施例l方法细胞培养、转染和逆转录病毒感染人乳腺癌细胞株BT-474和SKBR-3购自美国模式菌种收集中心(ATCC，马纳萨斯)，并在补充了8%热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的Dulbecco，sModifiedEagle培养基(DMEM)中培养。对BT-474和SKBR-3进行亚克隆，异位性表达鼠亲嗜性受体。通过Phoenix包装细胞转染，得到亲嗜性逆转录病毒上清液。釆用磷酸钙沉淀技术进行转染。将病毒上清液用0.45]im滤膜过滤，在8jig/ml聚凝胺(Sigma)中进行感染。用2pg/ml嘌呤霉素在BT-474和SKBR-3细胞中进行药物筛选。从NKI/AVL医院药房获得曲妥珠单抗，溶解于MQ中，将20mg/ml储备液保存在-2(TC。shRNA条形码筛选用前述代表完整NKiRNAi基因库的逆转录病毒感染BT-474细胞(Berns等.2004.Nature428:431-437)。用喋呤霉素(2.0|ig/ml)筛选感染的细胞，以低密度放置在两个种群中。一个种群未经处理，而另一个种群在IOiLig/ml曲妥珠单抗中培养。在筛选期间，细胞经胰蛋白酶作用并重新排列(replated)，以去除小细胞团。4周后收集处理的和未处理的种群中的培养物。用DNAzol(LifeTechnologies)分离基因组DNA。通过PCR,釆用含有T7RNA聚合酶启动子的引物pRS-T7-fw,5，GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3，和pRS隱8-rev，5，-TAAAGCGCATGCTCCAGACT-3;从基因组DNA扩增shRNA插入片段。用纯化的PCR产物进行线性RNA扩增，用青色素-3(Cy3)或青色素-5(Cy5)荧光组(Kreatech)标记纯化的RNA探针。来自未处理和曲妥珠单抗处理的细胞的RNA探针与前述寡核苷酸芯片结合并杂交(Bems等,2004.Nature428:431-437)。用Imagene5.6(BioDiscovery)对所得的荧光图像进行定量，减去局部背景，将数据标准化，并转化为21og对数。质粒前文已经描述了表达PIK3CA组成性激活突变型的逆转录病毒载17体(llOaCaaX)和PTEN敲除载体(Kortlever等.2006.NatureCellBiol.8:877-884)。以caPIK3CA为模板，通过PCR生成PIK3CA(wt)和PIK3CA(H1047R)cDNAs，并将其克隆到pMXiresGFP逆转录病毒载体中。釆用表达逆转录病毒的GFP或发夹结构靶向GFP进行对照感染。患者对于NKI/AVL队列，基于免疫组织化学的HER2过表达(IHC3+)和/或显色原位杂交(CISH)的HER2基因扩增的患者都有资格入选。从荷兰癌症研究所/AntonivLeeuwenhoek医院及周边医院收集了HER2-过表达原发性乳腺癌、随后发展成转移性乳腺癌的34例患者，这些患者接受了曲妥珠单抗单一治疗(n=3)、曲妥珠单抗加紫杉烷(n=8)、曲妥珠单抗加长春瑞滨(n=16)、曲妥珠单抗加长春瑞滨和洛那法尼(lonafamib)(n=5)、曲妥珠单抗与紫杉醇和卡铂(n=l)或者辅助曲妥珠单抗(n=l)治疗。治疗从2002年9月至2005年9月开始。从全部34例患者中获取无复发生存数据(定义为至疾病进展时间)。26例肿瘤为高核级m,7例为中核级n,l例肿瘤为低核级。釆用IHC分析了ER状态，14例肿瘤为阳性，19例肿瘤为阴性，l例肿瘤没有可能修复ER状态。福尔马林固定的石蜡包埋的存档材料用于IHC、基因组DNA分离、PCR和序列分析。对于MDAnderson队列，证实为HER2扩增的(通过FISH和/或IHC3+阳性)21例乳腺癌患者的原发性肿瘤材料，来源于由IRB-批准的方案支持的M.D.Anderson癌症中心的冷冻乳腺组织肿瘤库。17例肿瘤为高核级(由修正的Black定为III级)，12例肿瘤IHC的ER状态为阳性，9例肿瘤为阴性。所有患者均釆用了用于转移性疾病的基于曲妥珠单抗方案的治疗；曲妥珠单抗单一治疗(11=3)、或曲妥珠单抗加紫杉烷(n-8)、或曲妥珠单抗加长春瑞滨(n-6)、或曲妥珠单抗加其他化疗(n=4)。在所有病例中，用于本分析的治疗方案是施予每个转移性疾病患者的第一个含有曲妥珠单抗的方案。从施予的第一个基于曲妥珠单抗方案开始，计算了所有患者的至疾病进展时间。诊断时的平均年龄为46.6岁，年龄范围从25岁到74.1岁(NKI:47.828.9-74.1,MDAnderson:44.5,25-65)。平均至疾病进展时间为11.8个月，时间范围从0.7个月到44.7个月(NKI:11.3，0.7-37.5,MDAnderson:12.6，0.8-44.7)。随访期间出现了48次事件，对7例患者进行了检查(NKI:29和5，MDAnderson:19和2)。PIK3CA突变的患病率为25%(NKI:21%,MDAnderson:33%)。在25%患者中观察到了低PTEN表达。DNA分离从10pm厚的石蜡包埋组织切片中分离基因组DNA。将切片在二甲苯中进行两次去石蜡处理、每次5min,在100°/0、96%和70%的乙醇中进行再水化处理、每种溶剂30s，用苏木精染色30s,用水冲洗并在lMNaSCN中在37"C下过夜孵育，以去除交联。在室温下，用PBS冲洗载玻片两次，每次10min,然后完全气干。用解剖刀从玻片上刮下胂瘤组织，在200mlQiagenATL缓冲液中(QIAampDNA提取试剂盒)获得至少70%肿瘤细胞(苏木精和曙红染色的载玻片由有经验的乳腺癌病理学家给出)，转移到eppendorf管中，用27pl蛋白酶K(protK15mg/ml储备液)以450rpm在55。C下孵育。在20h和28h时加入另外两个等份的27jilprotK。总protK孵育约44h后，按照制造商的方法进行DNA分离(Qiagen，Cat51306)。采用标准的苯酚-氯仿方法对冷冻乳腺组织的基因组DNA进行分离。PIK3CAPCR、序列和突变分析PCR的引物和序列如下外显子9-正向5，-AGTAACAGACTAGCTAGAGACAAT-3;外显子9-反向5'-GAGATCAGCCAAATTCAGTTATTTT-3;外显子20-正向5，-CAGGAGATGTGTTACAAGGCTTAT-3;外显子20-反向5'-TCAGTTCAATGCATGCTGTTTAAT-3'。在基因组DNA的10-100ng下进行PCR反应。94°C30秒的初始变性步骤后，94°C30秒变性扩增30个循环，55。C下退火30秒，72。C下延展l分钟；然后在72。C下进行最后延展循环10分钟。PCR产物经QIAquick离心柱(Qiagen)纯化，并釆用BigDyeTerminator循环测序试剂盒(美国应用生物系统公司，AppliedBiosystems)和ABI3730自动毛细管测序仪进行测序。对于正向和反向序列均有序列变异的所有PCR产物，重复反应进行证实。PIK3CASNP分析用基于SNP的途径对普通PIK3CA突变进行检测。我们釆用Sequenom(SanDiego，CA)MALDITOFMassArray系统。首先扩增已知潜在的PIK3CA突变热点位点111、542、545和1047的DNA，运行引物延展反应来确定潜在的SNP碱基。聚合酶链反应(PCR)引物和延展引物都由SequenomAssay设计软件设计。该程序允许每孔多达30个不同SNPs的多重反应。根据制造商说明书，初始PCR反应在384孔板中进行，釆用EXO-SAP(也由Sequenom提供)清除PCR反应。根据Sequenom的方法并釆用Sequenom'sIPLEXchemistry进行引物延展反应。然后采用Sequenom的清除树脂对IPLEX反应除盐，并用SamsungNanodispenser划线到Spectrochip矩阵芯片(matrixchips)中。然后在SequenomMassArray中运行芯片。釆用SequenomTyper软件解释生成的质谱并报告预期量的SNPs碱基。所有生成的质谱均运行两次并且经过目视检查。反相蛋白裂解阵列(RPPA)通过匀浆，釆用裂解缓冲液(l%TritonX-100，50mmHEPES，pH7.4，150mMNaCl，1.5mMMgCl2,lmMEGTA,lOOmMNaF，10mM焦磷酸钠，lmMNa3V04,10%甘油，lmMPMSF和lmg/ml抑肽酶)裂解21份大体解剖的新鲜冷冻转移性HER2扩增的人乳腺肿瘤。将蛋白裂解液(上清液)稀释至lmg/ml，用1。/。SDS煮沸，再用Tecan液体处理机器人(Tecanliquidhandlingrobot)加入裂解缓冲液稀释成205份两倍系列稀释液。机器人基因TAC阵列仪(roboticGeneTACarrayer)(GenomicSolutions,Inc.,AnnArbor,MI)建立了1152个斑点，在硝化纤维镀膜玻璃载玻片(FASTSlides,Schleicher&SchuellBioscience,Inc.USA,Keene，NH)上有192个样品阵列包含在每个HER2扩增样品的系列稀释液中(Liang等.2007.NatureCellBiol9:218-224;Tibes等.2006.MolCaneTher5:2512-2521;Sheehan等.2005.MolCellProteom4:346-355)。用经验证的PTEN(CellSignaling,Inc.)最初抗体对该阵列载玻片进行了探针检测(ThisarrayedslidewasprobedwithavalidatedprimaryantibodytoPTEN),采用DakoCytomation(Carpinteria，CA)催化系统(CSA)对信号进行扩增。将第二抗体(抗兔)用作信号扩增的起始点。采用Microvigene软件(VigeneTechInc.,NorthBillerica,MA)扫描、分析、定量染色的载玻片，从载玻片上的所有样品中生成一系歹'」PTEN的稀释-信号强度超曲线(supercurve)，然后将每个样品与该超曲线拟合以生成表示每个样品裂解液的相关PTEN信号强度的对数值。釆用每个样品中50个其他探针蛋白的平均表达水平校正PTEN的表达的蛋白载量。通过21份样品，就定量的PTEN表达而言，底部25。/。的肿瘤被分类为具有低PTEN表达，其他75。/。的肿瘤被分类为具有高PTEN表达。免疫组织化学将来自石蜡块的3pm系列切片在二甲苯中进行去石蜡处理，并在各级系列乙醇中进行水化处理。用LabVision全自动免疫组化染色机(LabVisionCorporation,Fremont,CA,USA)对PTEN(DAKO,1:200)、HER2(克隆3B5，1:3000;vandeVijver等.1988.NewEnglJMed319:1239-1245)和ER(雌激素受体-a(ER;1D5+6F11,稀释1:50，Neomarkers,LabVisionCorporation,Fremont,CA,USA))的最初抗体进行染色。用抗原修复技术进行检测(枸橼酸盐pH6.0)。评分根据染色强度和分布，采用别处描述的免疫反应积分(IRSXChui等.1996.BrJCancer73:1233-1236;Friedrichs等.1993.Cancer72:3641-3647)对PTEN表达水平进行半定量评分。简而言之，IRS=SI(染色强度)xPP(阳性细胞的百分数)。SI定义为0=阴性；1=弱；2=中;3=强。PP定义为:0=0%;1=0-25%;2=25-50%;3=50-75%;4=75-100%。已知将血管内皮作为阳性对照表达正常PTEN。根据IRS分数，PTEN状态分级如下低PTEN表达，IRS0-3;高PTEN表达，IRS4-12。就一种肿瘤而言，不可能修改PTEN分数。当没有肿瘤细胞被染色时，ER染色解释为阴性，当多于10%的肿瘤细胞显示细胞核ER染色时，解释为阳性。当无(分数0)、少于10%(分数l)或多于10%(分数2)的肿瘤细胞显示弱染色时，Her2neu染色被评分为阴性，当多于10%的肿瘤细胞显示强膜-染色时(分数3)，Her2neu染色被评分为阳性。当肿瘤显示HER2IHC的分数为2+时，我们对HER2进行显色原位杂交(CISH)。通过CISH评价基因状态，每个细胞核平均至少或多于6个拷贝的样品被认为是HER2扩增。釆用所述(Hannemann等.2006.BrJCancer95:1334-1341)的Spot-LightCISHPolymer检测试剂盒(Zymed,SanFrancisco,CA，USA)进行CISH。统计学分析我们釆用将年龄作为时间尺度的多因素Cox回归，评价至疾病进展时间与两个候选的风险因子PIK3CA突变和PTEN表达之间的联系。随访的时间从诊断的年龄开始，至进展的年龄(死亡年龄或截尾年龄(theageatcensoring),以先到的年龄计)结束。在两个参加中心，测量的PTEN表达不同。对于连续表达值的低和高的分类，我们选择了常用NKI测量的截点(范围为0-12，截点〈3vs〉3，其结果是25%的NKI患者分类为低)，将MDAnderson患者中表达值的相应百分比作为MDAnderson患者的截点(范围为57.3-488.4，截点<105vs>105)。1例NKI患者的PTEN表达缺失。所有的分析均通过中心分层，并通过釆用年龄这个变量作为时间尺度，根据年龄进行了调整。采用混杂法进一步评价了级别和ER状态。为通过两个候选风险因子图解说明事件历史，生成Kaplan-Meier曲线图。进行对数秩检验以评价组-特异性生存曲线的均勻性。我们釆用Fisher精确检验评价了治疗应答(完全应答(CR)或部分缓解(PR)/疾病稳定(SD)>6个月vs进展疾病(PD)或部分缓解(PR)/疾病稳定(SD)<6个月)与PIK3CA突变和PTEN表达之间的关系。所有检验均为双侧检验。结果作为鉴别含有曲妥珠单抗耐药的基因的无偏倚方案，我们在HER2-过表达乳腺癌细胞株BT-474中釆用了大规模RNA干扰基因筛选。我们在前文已经描述了针对一些8,000人基因、被RNA干扰抑制的24,000shRNA逆转录病毒载体的基因库的传代，以及被称为siRNA条形码筛选的快速筛选这些基因库的技术(Brummelkamp等.2006.NatChemBiol2:202-206;Bernsetal.2004.Nature428:431-437)。简而言之，基于载体中"条形码"标识符(唯一的19-merDNA序列)的相对丰度，这项技术能鉴别在种群中富集的shRNAs，在携带24,000个不同条形码序列的DNA微阵列中测量。BT-474细胞主要通过其增殖率的降低，而不是调亡或完全增殖抑制，对曲妥珠单抗产生应答(图la)。为了鉴别被shRNA抑制导致对曲妥珠单抗耐药的基因，用shRNA基因库感染BT-474细胞，并用P票呤霉素筛选shRNA载体。筛选后，将细胞以低密度划线到两个种群中。一个种群未经处理作为对照，而另一个种群暴露在IOpg/ml曲妥珠单抗中。4周后收集细胞，通过PCR扩增恢复分离的基因组DNA和shRNA试剂盒，并与所述DNA微阵列杂交(Berns等.2004.Nature428:431-437;见图lb)。我们结合5份独立曲妥珠单抗条形码筛选的数据，分析了恢复的shRNAs的相对丰度。图lc中显示了与未处理种群相比，经曲妥珠单抗处理的种群中shRNA载体的相对丰度。我们选择了通过曲妥珠单抗选择富集的前5个shRNAs载体，其中针对PTEN肿瘤抑制剂基因的shRNA富集的最显著(用箭头标记)。在第二轮筛选检测中，只有针对PTEN的载体对曲妥珠单抗产生耐药。更重要的是，敲除PTEN表达(Kortlever等.2006.NatureCellBiol8:877-884)的第二个独立的shRNA也对曲妥珠单抗产生耐药，有效地排除了导致耐药表型的shRNA载体"脱乾"效应的可能性(图2a)。我们发现BT-474细胞中敲除PTEN降低了对曲妥珠单抗的敏感性，与早期发现一致，这证明了PTEN丢失与基于曲妥珠单抗治疗的耐药有关(Nagata等.2004.CancerCell6:117-127)。更重要的是，我们对8,000例受试基因的观察发现，仅敲除PTEN就产生曲妥珠单抗耐药，这表明PTEN途径在曲妥珠单抗耐药中起着决定性的作用。然而，因为仅在乳腺癌的部分中观察到PTEN的丢失，所以不可能单独用PTEN的丢失解释在临床中观察到的、频繁的原发性和获得性对曲妥珠单抗的非应答。在一些25。/。原发性乳腺癌中鉴别编码PI3K的pll0a催化亚基(PIK3CA)的基因激活突变(Saal等.2005.CancerRes65:2554-2559)。这些突变的大多数都位于外显子9和20的两个热点，有证据表明两种最常见的突变(E545K和H1047R)能导致PI3K途径信号增加(Isakoff等.2005.CancerRes65:10992-11000)。为了检测PI3K途径的激活是否能导致曲妥珠单抗耐药，我们用PIK3CA结构性地激活突变型caPIK3CA(pl10aCaaX)对BT-474细胞进行了逆转录病毒转导。图2显示该突变型的表达表现出(rendered)BT-474对曲妥珠单抗几乎完全不敏感。而且，在SK-BR3细胞(图2b)和BT-474细胞(未显示数据)中，PIK3CA(wt)的表达和乳腺癌-衍生的突变型PIK3CA(H1047R)也显示对曲妥珠单抗产生了耐药。显然，通过PIK3CA(wt)的过表达，PI3K信号的少量增加就能足以抵消细胞培养物中曲妥珠单抗的生长抑制效果。在曲妥珠单抗耐药的发展中，这些发现与PDK途径的主要作用一致。在乳腺癌中高频率的激活PIK3CA突变(约25%;Saal等.2005.CancerRes65:2554-2559)，连同我们的观察结果，细胞培养物中激活的PI3K信号能诱导强曲妥珠单抗耐药，引导我们研究在临床中癌症相关的PIK3CA突变或改变的PTEN水平是否能够预示曲妥珠单抗耐药。对此，我们利用了来自在AntonivanLeeuwenhoek医院(i^34)和MDAnderson癌症中心(11=21)治疗的两组HER2过表达的转移性乳腺癌患者的样品。这55例患者接受了曲妥珠单抗单一治疗(n=6),或曲妥珠单抗联用化疗方案(n=49)。本研究中评价了PTEN表达水平(釆用免疫组织化学分析或蛋白芯片)和PIK3CA突变状态(通过定位测序或SNP碱基分析)，并建立了治疗应答与基于曲妥珠单抗治疗的相互关系(见方法项、图4和图5)。我们在24%(54例中的13例；一个样品未评分)的受检肿瘤中观察了减少的PTEN表达(表2)。在基于曲妥珠单抗治疗开始后，根据至疾病进展时间的临床随访数据生成了Kaplan-Mder生存曲线。图3a表明PTEN低肿瘤的患者的统计学显著性(p=0.028)比无复发生存的弱。55个肿瘤样品后续的PIK3CA序列分析在外显子20(H1047R)中鉴别了10个突变，在外显子9(E542K和E545K)中鉴别了4个，这与25。/。的PIK3CA突变频率相符，与公开的乳腺癌PIK3CA突变频率一致(Saal等.2005.CancerRes65:2554-2559;见表2)。有趣的是，14个PIK3CA突变中的12个是在PTEN高肿瘤中鉴别的，这与PTEN丢失和PIK3CA突变很少出现在相同的乳腺癌肿瘤中的结果一致(Saal等.2005.CancerRes65:2554-2559)。显然，消除PTEN表达或致癌的PIK3CA突变缓解了对其他靶目标的选择压力。然后我们确定了通过致癌的PIK3CA突变激活PBK途径是否可以预示基于曲妥珠单抗治疗结局。图3b中Kaplan-Mder生存曲线明确证实了在突变-阳性肿瘤的患者中，边界线显著地(p=0.052)弱于无复发生存。然而，用28%(40例中的ll例)PTEN低肿瘤污染PIK3CA野生型肿瘤，与至疾病进展时25间缩短有关(图3a)。因为PTEN丢失和PIK3CA突变都有助于PI3K途径激活，所以我们将患者分类为两组，"激活的"PI3K途径(PTEN低+PIK3CA突变型；n-25)或"未激活的"PI3K途径(PTEN高+PIK3CAwt;n=29),并生成Kaplan-Meier生存曲线图。图3c所示的曲线证明PTEN丢失或PIK3CA突变的患者基于曲妥珠单抗治疗后无复发生存显著地低于无PTEN丢失或PIK3CA突变的患者(p=0.002)。更重要的是，当两种事件(PTEN丢失或PIK3CA突变)都被考虑时，两组之间无复发生存差异的显著性更加明显。两个队列的分析分别给出了非常相似的生存曲线(图6)。根据将年龄作为时间尺度的多因素Cox回归分析，通过中心分层和调节ER状态的危害率表明PDK途径状态对于疾病进展是独立的显著的风险因子(HR2.1，p=0.02;表l)。而且，较差的临床应答(定义为根本无应答，或部分缓解以及少于6个月的疾病稳定)与PI3K途径的激活具有显著相关性(Fisher精确检验p=0.049),但与单独的PTEN丢失或PIK3CA突变无显著相关性(表3)。这些数据提示结合PTEN表达和PIK3CA热点突变分析可以作为基于曲妥珠单抗治疗应答的重要预示因子。两个中心之间PTEN和PIK3CA的效果没有异质性证据(p>0.47)。这些数据提供了PIK3CA突变有助于曲妥珠单抗的无应答性(图3b)的第一手证据，与单独的PTEN(24%,图3)相比，PTEN状态与PIK3CA状态的结合可高达两倍鉴别患者组增加的复发风险(46%)。因此，我们的数据表明，对于HER2扩散的乳腺肿瘤中曲妥珠单抗应答性的最佳预言，需要同时评价PIK3CA突变状态和PTEN表达水平，以及反应途径激活状态。此外，本研究突出了曲妥珠单抗应答中PI3K信号的中心重要性，从而建议了用于治疗曲妥珠单抗无应答的乳腺癌或预防耐药出现的联用治疗方案。表格表l多因素Cox回归分析<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>PD:进展性疾病，CR:完全缓解，PR:部分缓解，SD:疾病稳定表4经常被改变的PIK3CA的氨基酸残基38(精氨酸)60(谷氨酰胺)88(精氨酸)542(谷氨酸)545(谷氨酸)661(谷氨酰胺)701(组氨酸)733(赖氨酸)901(半胱氨酸)909(苯丙氨酸)1008(丝氨酸)1011(脯氨酸)1021(酪氨酸)1025(苏氨酸)1035(谷氨酸)1043(甲硫氨酸)1044(天冬酰胺)1046(丙氨酸)1047(组氨酸)1049(甘氨酸)1065(组氨酸)}}>}}}}}胺酸酸}>酸}>酸酸酸酸酸酸酸酸酰氨氨酸酸氨酸酸氨氨氨氨氨氨氨氨冬冬胱氨氨胱氨氨脯甘精谷赖甘甘脯天天半丝谷半谷膽460001824508580390001112245701253111111113334444权利要求1、一种用于确定患有癌症的个体对HER2-靶向治疗是否处于呈现或获得应答降低的风险的方法，所述方法包括a.测定所述个体的所述癌症细胞样品中的PI3K核苷酸序列，或其部分序列；b.将所述序列与对照样品中PI3K的相应序列进行对比；和c.在对比的基础上确定所述风险。2、一种用于确定患有癌症的个体对HER2-靶向治疗是否处于呈现或获得应答降低的风险的方法，所述方法包括a.测定所述个体的所述癌症细胞样品中与PI3K相关的信号转导途径的活性状态；b.基于所述状态确定所述风险。3、如权利要求2所述的方法，其中将所述活性状态与对照样品中所述信号转导途径的活性状态相对比，且在所述对比的基础上确定所述风险。4、如权利要求2所述的方法，其中确定所述与PIK3CA相关的信号转导途径的活性包括确定编码PIK3CA的基因的扩增。5、如权利要求2所述的方法，其中确定所述与PIK3CA相关的信号转导途径的活性包括确定来自PIK3CA基因的基因产物的表达水平。6、如权利要求2所述的方法，其中确定所述与PIK3CA相关的信号转导途径的活性包括确定PIK3CA的激酶活性。7、如权利要求1或2所述的方法，其包括在如图7所述编码PIK3CA的核酸的1624、1633、1634或3140任一位点，或在编码PIK3CA的基因核酸分子中相应的位点，或在所示核苷酸序列的任何部分或衍生序列中相应的位点，确定PIK3CA的核苷酸序列，其中编码的氨基酸在位点542(谷氨酸)、545(谷氨酸)和1047(组氨酸)处，由所示氨基酸改变为另一个氨基酸，表明关于HER2-靶向治疗呈现或获得应答降低的风险。8、如权利要求2所述的方法，其中确定与PIK3CA相关的信号转导途径的活性包括确定PIK3CA-指示基因的表达水平。9、如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述HER2-靶向治疗选自基因治疗、化疗、化合物-介导的治疗、siRNA-介导的治疗、蛋白治疗和抗体-介导的治疗。10、如权利要求9所述的方法，其中所述HER2-靶向治疗包括抗体-介导的治疗。11、如权利要求10所述的方法，其中所述抗体-介导的治疗包括曲妥珠单抗。12、PIK3CA抑制剂或PIK3CA突变型抑制剂在制备治疗HER2-耐药癌症患者的药物中的应用。13、如权利要求12所述的应用，其中所述癌症患者是乳腺癌患者。全文摘要本发明公开了一种用于确定患有癌症的个体对HER2-靶向治疗是否处于呈现或获得应答降低的风险的方法。一方面，本发明利用由脂质激酶调节的信号转导途径的活性来确定所述风险。文档编号C12Q1/68GK101688243SQ200880018423公开日2010年3月31日申请日期2008年4月14日优先权日2007年4月13日发明者凯特琳·伯恩斯,雷内·伯纳德斯申请人:荷兰癌症研究所基金会