测量体液中维生素b6的质谱法的制作方法

专利名称：测量体液中维生素b6的质谱法的制作方法
专利说明测量体液中维生素B6的质谱法 发明领域 本发明涉及用串联质谱法(MS-MS)结合液相色谱法检测维生素B6的活性形式5’-磷酸吡哆醛(PLP)。

背景技术：
本说明书中所引用的文献通过参考下面的书目以数字表示在括号内。没有一篇引用的参考文献是被承认的现有技术。
维生素B6是水溶性维生素，以七种形式存在吡哆素(PN)、5’-磷酸吡哆素(PNP)、吡哆醛(PL)、5’-磷酸吡哆醛(PLP)、吡哆胺(PM)、5’-磷酸吡哆胺(PMP)和4-吡哆酸(PA)。除了PA之外的所有形式都在体内可互相转换。PN、PL和PM是食物中的天然化合物，其在吸收后被磷酸化成活性形式，成为PNP、PLP和PMP。PLP作为氨基酸代谢的辅因子起作用。PN是作为维生素B6补充提供的形式。通常情况下，100毫克的维生素B6将在两小时内产生血浆峰，半衰期为8小时。超过25毫克的剂量产生很小的血浆PLP变化。PA是维生素B6的最终代谢物，其排泄在尿中。
维生素B6在氨基酸、脂类、碳水化合物和神经递质的新陈代谢中发挥重要作用。例如，维生素B6作为许多关键酶的辅酶起作用，所述关键酶例如犬尿氨酸酶，其催化从色氨酸合成烟酸；δ-氨基酮戊酸合酶，其催化血红素的合成；和糖原磷酸化酶，其催化以糖原储存在肌肉中的匍萄糖的释放。维生素B6也参与神经递质合成和氨基酸合成，以及高半胱氨酸到胱硫醚和胱硫醚到半胱氨酸的分解代谢，这涉及与增高的高半胱氨酸水平密切相关的途径。
维生素B6缺乏引起虚弱、易受感染、失眠、抑郁、皮炎、舌炎、口腔炎和癫痫发作。慢性维生素B6缺乏可以甚至引起严重的神经压迫疾病。低血液维生素B6水平被认为是心血管病的危险因素。尽管维生素B6缺乏作为低摄入性营养不良在美国是很少见的，但它通常与其他疾病相关，如酒精中毒、肝硬化、肾衰竭和小肠吸收不良等。因此，检测血浆中维生素B6的活性形式PLP，以确定维生素B6缺乏或过量，因而评估健康状况和监控治疗是重要的。
传统上，测量红细胞中天冬氨酸转氨酶的水平来诊断维生素B6缺乏。但是，这种测试是功能性测定而不是PLP状况的直接测量(参考文献1)。
血浆PLP浓度的临床分析是血液中活性形式维生素B6的直接测量。许多出版物报导了用高效液相色谱测定(HPLC)成功地检测血浆PLP(参考文献2-8)。Hachey等描述了通过质谱法测定生物样品中的维生素B6(参考文献9)。液相色谱-串联质谱可被用于测量人血浆中的维生素B6(参考文献10)。然而，Rybak等报导，在现有的基于HPLC的测定和酶的维生素B6测定中观察到不精确(参考文献24)。
发明概述 本发明涉及用串联质谱法(MS-MS)结合液相色谱法检测体液样品中维生素B6的活性形式5’-磷酸吡哆醛(PLP)的存在或数量。优选地，本发明涉及检测血浆中PLP的存在或数量。
在某些实施方式中，体液样品是从哺乳动物如狗、猫、马等获得的样品。特别优选的哺乳动物是灵长类，最优选的是人类。适合的样品包括血液、血浆、血消、尿液、唾液、眼泪和脑脊液。优选地，样品是血浆样品。这些样品可以获自，例如，患者；即，在临床设施中诊断、预后或治疗疾病或状况的有生命的人。
一方面，本发明提供用串联质谱法检测体液样品中PLP的存在或数量的方法。该方法包括下列步骤(i)用液相色谱法纯化所述样品；(ii)从纯化样品中产生PLP的母离子；(iii)产生母离子的一个或多个子离子；和(iv)检测步骤(ii)或步骤(iii)或二者中产生的一个或多个离子的存在或数量，且将检测到的离子与样品中PLP的存在或数量关联起来。在某些实施方式中，该方法用于检测血浆中PLP的存在或数量。在优选的实施方式中，样品中的PLP通过电雾化被电离。
在优选的实施方式中，在样品中提供可独立地检测的内标，其在样品中的存在或数量也被检测。在这些实施方式中，存在于样品中的PLP和内标都被纯化，然后被电离以产生在以阳离子模式操作的质谱仪中可检测到的多个离子，并且用质谱法检测从PLP和内标的每一个产生的一个或多个离子。
术语“以阳离子模式操作”是指那些检测阳离子的质谱方法。类似地，“以阴离子模式操作”是指那些检测阴离子的质谱方法。
在优选的实施方式中，在质谱仪中可检测的PLP离子包括具有质荷比(m/z)为248.03+/-1m/z的离子——对母离子而言和质荷比(m/z)为150.00+/-1m/z的离子——对子离子而言。通过质谱法观测到的母离子和子离子(一个或多个)的m/z值的变化通常范围是从0.001到1m/z单位原子质量。例如，用不同质谱仪鉴定248.03母离子所观测到的质量的变化应该在1m/z内，其范围在247.03m/z和249.03m/z之间。
优选的内标是2-羟基-6-甲基吡啶-3-羧酸(Aldrich)。在优选的实施方式中，在质谱仪中可以检测到的内标具有质荷比(m/z)154.04+/-1m/z——对母离子而言和136.00+/-1m/z——对子离子而言。测定用的可选内标是同位素标记的维生素B6。
如果多个子离子被监测，产生自同一母离子的不同子离子的质量跃迁离子比变化应该不超过+/-25％，这是根据College of AmericanPathologists (CAP)标准。例如，如果化合物从同一母离子产生子离子A和B，则离子比是(离子A的强度除以离子B的强度)×100。
在其他优选的实施方式中，纯化步骤包括(a)施加体液样品到萃取柱上；(b)在使5’-磷酸吡哆醛保留在柱内的条件下冲洗萃取柱；(c)从萃取柱中洗脱保留的包含5’-磷酸吡哆醛的物质；(d)将萃取柱洗脱的包含5’-磷酸吡哆醛的物质施加到分析柱中；和(e)从分析柱中洗脱纯化的5’-磷酸吡哆醛。在优选的实施方式中，萃取柱是大颗粒萃取柱，而分析柱是C-8分析柱。在其他实施方式中，萃取柱是湍流液相色谱柱，并且更优选的是高湍流液相色谱柱(HTLC)。
“大颗粒”柱，意思是包含的平均颗粒直径大于大约35微米的柱子。在优选的实施方式中，萃取柱包含大约50微米直径的颗粒，C-8分析柱包含直径大约为3.5微米的颗粒。如本文所用，术语“大约”意思是指±10％。优选地，萃取柱是0.5(ID)×50mm的混合模式阴离子交换聚合物柱，颗粒尺寸为50微米。
如本文所用的，术语“分析柱”是指色谱柱，该柱具有足够的色谱“塔板”，以实现从柱子中洗脱的样品中物质的充分分离，以允许确定分析物的存在或数量。这样的柱子常常区别于“萃取柱”，它的通常目的是从非保留的物质中分离或萃取保留的物质，以得到纯化样品做进一步分析。优选的分析柱是HPLC柱。
以上描述的本发明的概述是非限制性的，并且从以下本发明的详细描述和权利要求中本发明的其他特征和优点将是明显的。
附图简述

图1是在如下综合参数下串联质谱分析得到的EDTA-血浆中PLP的色谱母/子离子的m/z值 248.03/150.00amu；SW500.00；观察宽度(分钟)3.75；RT参照(RTR) 是；最小峰高(MPH，信噪比) 3.0；平滑度5；峰检测算法(PDA) genesis。色谱图是由制造商提供的软件(Aria version 1.5，CohesiveTechnologies)，用质谱中的峰强度(面积计算)产生的。如图1所示，PLP的最高峰出现在估计保留时间0.75分。
图2是在如下综合参数下串联质谱分析得到的内标2-羟基-6-甲基吡啶-3-羧酸的色谱母/子离子的m/z值 154.04/136.00amu；SW50.00；观察宽度(分钟) 3.75；RT参照(RTR) 是；最小峰高(MPH，信噪比) 3.0；平滑度 5；峰检测算法(PDA) genesis。每个过程中内标被等量加入到每个样品中。如图1所示，2-羟基-6-甲基吡啶-3-羧酸的最高峰出现在估计保留时间3.16分。
图3描述了PLP的典型标准曲线。软件利用PLP和它的内标的峰面积比，以简化数据。内标的峰面积对于所有测试的样品是一致的(在+/-30％之内)，PLP的浓度水平相应于PLP与内标的峰面积比。由MS/MS获得的峰面积比，对各种已知的在2ng/mL和250ng/mL之间的PLP浓度作图，得到标准曲线。包括作为零标(zero standard)的空白血浆或血清。1/x权重线性回归被用来进行数据简化。
优选实施方式详述 本发明描述了检测样品中维生素B6的活性形式PLP的存在或数量的方法。该方法利用液相色谱进行PLP的首先纯化，接着是串联质谱(MS/MS)，因此提供了检测和量化液体样品中PLP的高通量测定系统。该测定提供了增强的特异性，并且与其他维生素B6测定所要求的相比，使用更少的时间和更少的样品制备完成测定。在各种实施方式中，本发明的方法精确地定量样品中以2ng/mL到250ng/mL之间范围存在的PLP，同时本方法对于检测浓度低至0.96ng/mL的PLP足够灵敏。
通过HTLC/HPLC进行样品纯化 优选地，在质谱法之前，PLP首先用高湍流液相色谱(HTLC)和高效液相色谱(HPLC)纯化。“纯化”在本文中不是指从样品中除去除了关注的分析物之外的所有物质。相反，纯化是指相对于样品中一种或多种其他组分增加一种或多种关注的分析物的数量的过程。在优选的实施方式中，纯化可以被用于除去一种或多种干扰物质，例如，一种或多种会干扰分析物离子被质谱检测的物质。
HTLC是色谱的一种形式，它利用通过柱填充物测定的物质的湍流作为进行分离的基础。HTLC已被用于在用质谱分析之前制备包含两种无名药品的样品(参考文献11-15)。本领域的普通技术人员理解“湍流”。当流体流动得缓慢而平稳时，该流被称为“层流”。在层流中流体粒子的运动是有秩序的并且粒子通常是直线前进。相反，在更快的速度下，水的惯性克服流体的摩擦力而形成湍流。流体不与因摩擦力而减慢或因不平坦的表面而偏离的不规则边界“超过”相接触。当流体汹涌地流动时，它以漩涡和旋转(或涡旋)的方式流动，比流体是层流时更“拖后”。很多参考文献可以用来帮助确定何时流体流动是层流或湍流(参考文献16和17)。
传统的HPLC分析依赖于样品组分和柱填充物之间的化学相互作用，其中样品通过柱子的层流是从样品中分离出关注的分析物的基础。技术人员会理解，在这样的柱子中的分离是一种分配过程。相反，可以相信如HTLC柱和方法提供的“湍流”可以提高传质的速率，因而改进分离系统提供的分离特征。HTLC柱通过高色谱流速通过包含刚性颗粒的装充柱来分离组分。通过使用高流速(例如3-4ml/min)，柱子中出现湍流，引起固定相和分析物之间几乎完全的相互作用。HTLC柱另外的优点是，避免了与生物流体基质相关的大分子累积，因为在湍流条件下高分子量种类不被保留。
因为HTLC方法能结合多种分离于一种自动化程序中，它不仅减少了对冗长的样品制备和显著高速度下操作的需要，而且通过最小化纯化期间操作者的参与，消除了操作者出错的机会。这样的方法也取得了优于层流(HPLC)色谱的分离性能。HTLC允许直接注入生物样品(血浆、尿液等)。这在传统形式的色谱法中是难以实现的，因为变性蛋白和其他生物碎片很快堵塞了分离柱。
另外，允许柱多路传输和直接与MS仪结合的HTLC设备的商业可得性使这些仪器特别适用于高通量应用。
在色谱过程中，物质的分离受变量如洗脱剂(也称为“流动相”)的选择、梯度洗脱的选择和梯度条件、温度等影响。
本发明对于HTLC和HPLC色谱应用复合梯度。更具体地说，梯度始于以0.4mL/分钟泵入100％去离子水到HTLC柱上和以0.4mL/分钟泵入5％的乙酸到HPLC柱上60秒钟。当梯度开始时样品被同时注入。随后，用流速1.5mL/分钟的100％去离子水冲洗HTLC柱50秒钟，然后以同样的速度用5％乙酸水溶液冲洗40秒钟。用5％乙酸水溶液在流速0.4mL/分钟下从HTLC柱到HPLC柱洗脱萃取物200秒，从样品注入计算2分钟时开始洗脱。然后，以流速0.4mL/分钟，通过5％乙酸水溶液/乙腈(45到15％/55到85％)的梯度，促进从HPLC柱的洗脱。梯度时间的提醒是为了用去离子水、5％乙酸水溶液和乙腈淋洗和再平衡柱子。色谱的总持续时间是9.0分钟，每个样品的数据窗为4.3分钟。因此，当用交叠梯度操作双重通路时，可以在9分钟方法时间内分析两个样品。
在某些实施方式中，可以在关注的分析物可逆地被柱填充材料保留而一种或多种其他物质不被保留的条件下，通过施加体液样品到柱子来纯化分析物。在这些实施方式中，可以使用其中关注的分析物被保留在柱子中的第一流动相条件，并且一旦非保留物质被洗掉，随后可以使用第二流动相条件以从柱子中除去被保留的物质。可以逐步分阶段采用第二流动相，通常在计算机控制下指令流动相随时间的组成，或通过在流动相中直接改变进行。也可以通过“反冲”柱或逆转流动相的流动方向，从柱子中除去保留物质。这可能对保留在柱子顶部的物质来说尤其便利。作为选择，可以通过在其中关注的分析物与一种或多种其他物质相比在不同速率下洗脱的流动相条件下施加样品到柱子来纯化分析物。如上所讨论的，相对于样品中的一种或多种其他组分，这样的方法可以富集一种或多种关注的分析物的数量。
在优选的实施方式中，PLP首先通过液相色谱法纯化，包括步骤(a)施加体液样品到萃取柱上；(b)在使5’-磷酸吡哆醛保留在柱内的条件下冲洗萃取柱；(c)从萃取柱中洗脱保留的包含5’-磷酸吡哆醛的物质；(d)将萃取柱洗脱的包含5’-磷酸吡哆醛的物质施加到分析柱中；和(e)从分析柱中洗脱纯化的5’-磷酸吡哆醛。优选地，萃取柱是HTLC柱，而分析柱是HPLC柱。
在多种实施方式中，一个或多个纯化和/或分析步骤可以以在线自动化方式执行。例如，在一个实施方式中，纯化步骤(a)-(e)以在线自动化方式执行。在另一个实施方式中，在步骤(a)-(e)之后的质谱法步骤以在线方式执行。此处所用术语“在线自动化方式”是指执行各步骤而不需要操作者的干预。例如，通过仔细选择阀和连接管件，可以按需要连接两个或多个色谱柱，因此从一个到下一个柱子传递物质而不需要任何手动步骤。在优选的实施方式中，阀和管件的选择由预编程计算机控制，以执行必要的步骤。最优选地，色谱系统也以这样的在线方式连接检测系统，例如MS系统。如此，操作者可以放置一盘样品在自动取样器中，在计算机控制下执行其余操作，以致纯化和分析所有选择的样品。
相反，此处所用术语“离线”是指在样品载入第一个柱子之后要求操作者手动干预的方法。因此，如果样品发生沉淀，并且上清液然后被手动载入自动取样器中，则沉淀和载入步骤是与随后步骤离线的。
通过MS/MS的样品分析 纯化样品在被MS/MS分析之前要经电离。如此处所用，术语“电离”是指产生具有等同于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。阴离子是那些具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而阳离子是那些具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。
如此处所用，术语“质谱法”或“MS”是指基于离子的质荷比或“m/z”来过滤、检测和测量离子的方法。一般来说，一个或多个关注的分子被电离，随后离子被引入质谱仪，其中，由于磁场和电场的结合，离子遵循由质量(“m”)的电荷(“z”)决定的空间路径(参考文献18-23)。
可以用几种检测模式检测离子。例如，可以用选择性离子检测模式(SIM)检测选择的离子，或者作为选择，可以用扫描模式检测离子，例如，多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)。
优选地，用四极分析器来确定质荷比。例如，在“四极”或“四极离子阱”设备中，振荡射频场中的离子经受了与施于电极之间的DC电势、RF信号的振幅和m/z成比例的力。可以选择电压和振幅，使得只有具有特定质荷比(m/z)的离子行进通过四极杆的长度，而所有其他离子都偏离。因此，对注入设备的离子来说，四极设备既可以充当“虑质器”又可以充当“质量检测器”。
“串联质谱法”或“MS/MS”用来增强MS技术的分辨率。在串联质谱法中，产生于所关注的分子的母离子(又称为先驱离子)可以在MS仪中过滤，随后母离子被打成碎片，以生成一个或多个子离子(又称为碎片离子或产物离子)，其然后在第二个MS过程中分析。
碰撞诱导解离(“CID”)常常用于产生用于进一步检测的子离子。在CID中，母离子通过与惰性气体如氩气碰撞获得能量，并且随后被称为“单分子分解”的过程分解为碎片。母离子中必须储存足够的能量，以便由于增强的振动能，离子内的某些键可以被破坏。
通过小心选择母离子，只有某些关注的分析物产生的离子通过碎裂室，产生子离子。由于母离子和子离子都以可重复的方式在给定的一套电离/碎裂条件下产生，因此MS/MS技术可以提供非常强大的分析工具。例如，过滤/碎裂的结合可以用于消除干扰物质，并且在复合样品如生物样品中特别有用。
质谱仪通常为使用者提供离子扫描，即，在给定范围内(例如100到900amu)每个m/z的相对丰度。分析物测定的结果，即，质谱，能通过本领域内已知的很多方法与原始样品中分析物的数量相关联。例如，假设对取样和分析参数小心控制，给定离子的相对丰度可以与将相对丰度转换为原始分子绝对数量的表进行比照。作为选择，分子标准可以与样品一起运行，以及基于从那些标准产生的离子构建标准曲线。使用这样的标准曲线，给定离子的相对丰度可以被转换成原始分子的绝对数量。在某些优选的实施方式中，内标被用来产生标准曲线，以计算PLP的数量。将离了的存在或数量和原始分子的存在或数量关联起来的许多其他方法对本领域的普通技术人员来说是众所周知的。
技术人员会理解，基于要测量的分析物、样品的类型、检测器的类型、正模式相对负模式的选择等，可以确定电离方法的选择。可以使用多种方法产生离子，包括但不限于电子电离、化学电离、快速原子轰击、场脱附和基质辅助激光解吸电离(MALDI)、表面增强激光解吸电离(SELDI)、光子电离、电雾化电离和感应耦合等离子体。电雾化电离是优选的电离方法。如此处所用，术语“电雾化电离”或“ESI”是指这样的方法，其中溶液沿着短长度毛细管通过，达到被施加了高的正或负电势的该毛细管末端。达到管末端的溶液被蒸发(雾化)成溶剂蒸汽中非常小溶液滴的喷射或喷雾。这种雾滴流动通过汽化室，汽化室被轻微加热以防止冷凝并使溶剂挥发。当液滴变得更小时，电学表面电荷密度增加，直至相同电荷之间的自然排斥引起离子及中性分子被释放时。
用放射酶学测定法(REA)确定的在3和35ng/mL之间的血浆PLP浓度——对于2-17岁孩童，或用REA确定的在3和26ng/mL之间的血浆PLP浓度——对于18岁或以上成人——在正常范围内。用REA法获得的成人的参照值与那些通过本发明的LC-MS-MS法获得的值有很好的关联性。观察到斜率为0.9745，即由LC-MS-MS法获得的值在统计学上比REA值高2.6％。
如下实施例用于阐明本发明。这些实施例绝不意在限制本发明的范围。
实施例1样品制备 A.血浆样品 在禁食一夜之后从对象收集血液到EDTA中。在样品收集前24小时应该限制对象消费酒精和维生素。在收集血液后应该立即将血浆与细胞分离，或在6小时内从保持冷藏和避光保护的全血中分离出血浆。
在2-8℃、以2,200-2,500rpm、800-1000g离心5-10分钟分离细胞。然后血浆被转移到深棕色聚丙烯或聚乙烯迁移管中，以避光保护。作为选择，如果它包裹了铝箔，则可以使用中性色彩的聚丙烯或聚乙烯管。在-10℃到-30℃冷冻该管。如果样品被保存在-10℃到-30℃六天或在-60℃到-80℃六个星期，则样品是可以接受的。
B.内标储液和工作溶液 1.0mg/mL的2-羟基-6-甲基吡啶-3-羧酸(Aldrich，目录号H43008)的内标储液在去离子水中制备。1.25μg/mL的内标工作溶液由储存溶液在0.1％的甲酸中制备。
C.PLP储液和工作溶液 所有的PLP溶液应该被保护避免暴露于光。
1.0mg/mL的PLP(Sigma，目录号P9255)储液在去离子水中制备。然后5μg/mL的PLP储液由1.0mg/mL的储液在0.1％的甲酸中制备。500ng/mL的中间PLP标准溶液由5μg/mL的中间PLP储液，通过以不含PLP的血浆/血清(Biocell Labs，Carson，CA，目录号1131-00)稀释，进行制备。在使用之前，检查来自Biocell的分析物——萃取过的、脱脂的和除去纤维蛋白的血浆/血清，以确保其不含PLP。
如下表所指出，通过在不含PLP的血浆/血清(Biocell Labs，Carson，CA，目录号1131-00)中连续稀释500ng/mL的PLP标准溶液来制备PLP工作标准。这些工作标准用于产生图3所示的PLP标准曲线。
实施例2样品纯化 从样品注入柱子到色谱分析的过程是一个一体化的过程，包括用HTLC进行在线萃取、纯化和供应期望的分析物到HPLC柱子、用HPLC进行分析物的分析分离和用质谱进行化合物鉴定并获得每个分析物的具体质荷比。因为游离的和不想要的碎片通过萃取柱被高速冲扫，PLP以及内标被捕获和浓缩在柱子里。然后HTLC萃取柱被反冲，且样品载入HPLC分析柱。随后分析柱被梯度洗脱。柱子是在线的，并且允许所关注组分的色谱分离。纯化过程在下文中进一步详细描述。
在线萃取之前，200μL血浆样品，其包括标准、对照、空白和未知物，和0.6mL内标工作溶液混合在0.1％甲酸中。把样品分别倒入96-孔板中并盖上。将96-孔板放入自动取样器冷却单元。然后把10±2μL样品注入Cohesive TX-4HTLC系统。
HTLC系统逻辑上分为两种功能1)固相萃取，其使用大颗粒尺寸(例如50μm)填充柱和2)HPLC色谱法，其使用二元梯度和3.5μm反相分析柱。在本实施例中，Cohesive

Max的0.5×50mm柱(Cohesive Technologies，目录号952980)用于萃取。萃取柱是0.5(ID)×50mm、50μ颗粒尺寸的混合模式阴离子交换聚合物柱。萃取柱保留PLP、内标和小分子，同时允许大分子和电解液被洗脱出柱子。
在色谱分析过程中，梯度始于以0.4mL/分钟泵入100％去离子水到HTLC柱子上和以0.4mL/分钟泵入5％的乙酸到HPLC柱子上60秒。当梯度开始的同时样品被注入。随后，用100％去离子水冲洗HTLC柱50秒，然后以高流速(大约1.5mL/分钟)用5％乙酸水溶液冲洗40秒。高流速形成了萃取柱内部的湍流。这种湍流确保了PLP与柱子中大颗粒的优化结合，以及其余蛋白和碎片通过至废物。
载入和冲洗步骤之后，样品从HTLC萃取柱上被洗脱并转移到分析HPLC柱，这用5％乙酸水溶液以0.4mL/分钟的流速进行200秒，从样品注入计算2分钟时开始。HPLC柱是颗粒尺寸为3.5μm的C-8柱。这样的HPLC柱是商业上可得到的。用在该实施例中的柱是ZorbaxSB-C82.1×150mm柱(Agilent Technologies，目录号830990-906)。
通过5％乙酸水溶液/乙腈(45到15％/55到85％)的二元梯度，以0.4mL/分钟的流速，驱动HPLC柱的洗脱。梯度时间的提醒是为了用去离子水、5％乙酸水溶液和乙腈淋洗和再平衡柱子。色谱总的持续时间是9.0分钟，每个样品的数据窗4.3分钟。因此，当用交叠梯度操作双重通路时，可以在9分钟方法时间内分析两个样品。
为HTLC选择的参数如下注入体积 10±2μL自动取样器盘温度 5±2℃切换阀环路体积200μL 对装载泵来说，装载水溶液A是5％乙酸，装载有机溶液B是100％乙腈，以及装载水溶液C是100％水。对洗脱泵来说，洗脱溶液A是5％乙酸，洗脱溶液B是100％乙腈。总的方法持续时间是9分钟，其中获得物的数据窗4.33分钟。
洗脱后，PLP与样品中的其他分析物分离。然后分离出来的PLP被转移到MS/MS，进行量化。
实施例3样品分析 检测通过电雾化三级四极MS-MS系统(Thermo Finnigan TSQQuantum Ultra)来完成。液体溶剂从分析柱流入MS/MS分析器的加热喷雾器界面。溶剂/分析物混合物在界面的加热管中首先转换成蒸汽。包含在雾状溶剂中的分析物被电离，通过界面的电晕放电针添加正电荷，这施加了大的电压给雾化的溶剂/分析物混合物。离子通过仪器的孔并进入第一个四极杆。四极杆1和3(Q1和Q3)是滤质器，允许基于离子的质荷比(m/z)进行离子的选择。四极杆2(Q2)是碰撞室，在这里离子通过与氩分子的碰触形成碎片。
MS/MS的第一个四极杆(Q1)选择m/z是248.03的PLP或m/z是154.04的内标。具有这些m/z值的离子通过碰撞室(Q2)，而具有任何其他m/z值的离子与四极杆的侧面碰撞而被毁坏。进入Q2的离子与中性气体分子碰撞。这过程被称为碰撞诱导解离(CID)。用于该实施例的CID气体是氩气。产生的子离子进入四极杆3(Q3)，在这里PLP的子离子(m/z 150.00)或内标的子离子(m/z 136.00)被选择，而其他离子被筛选出来。选择的子离子被检测器收集。基于分析物与内标的峰面积比——通过阳性模式的选择性反应监测(SRM)获得——进行量化。
选择的MS/MS参数是扫描类型阳离子SRM运行时间4.5±0.2分钟MS/MS跃迁PLP(248.03母离子到150.00子离子)内标(154.04母离子到136.00子离子)MS共同参数喷雾电压 3200鞘气(sheath gas) 50辅助气 10毛细管温度 350℃管透镜(tube lens)偏压 63碰撞能量 10扫描宽度 0.002扫描时间 0.1Q1分辨率 0.2Q2分辨率 0.7 由于离子和检测器碰撞，它们产生了电子脉冲。脉冲被转换成数字信号，该信号被计数，以提供离子计数。获得的数据转送给计算机，计算机以收集到的离子数对时间作图。计算机测量产生的峰高，从校准物质产生响应因子，因此样品中的PLP被量化。
实施例4样品浓度的测定 未知浓度的计算基于PLP和内标的峰面积比与标准曲线对照，使用Xcalibur(Thermo Finnigan)的LCquan软件。用PLP和内标的子离子峰面积比进行计算。
首先，校准标准曲线是用8个PLP标准作图的，分别为2ng/mL、3.91ng/mL、7.82ng/mL、15.63ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL和250ng/mL。通常每次包括作为零标的空白血浆/血清。软件利用PLP和内标的峰面积比进行数据简化。1/x权重的线性回归数学模型被用来进行数据简化。PLP和内标的峰面积比对已知的PLP浓度作图，得到标准曲线。可接受的校准曲线必须具有0.9950或更高的相关系数(R2)。
为确定样品中的PLP浓度，样品中的PLP和内标的峰面积比通过LC/MS/MS方法确立，然后通过LCquan软件与标准曲线整合。
引用的出版物每个下述出版物以及每个上文引用的出版物通过引用以其整体并入本文。1.Talwar等，“pyridoxal phosphate decreases in plasma but noterythrocytes during systemic inflammatory response，”Clinical Chemistry49515-518，20032.Bisp等，“Determination of vitamin B6vitamers and pyridoxic acid inplasmadevelopment an devaluation of a high-performance liquidchromatographic assay，”Anal.Biochem.30582-89，20023.Bailey等，“High performance liquid chromatography method for thedetermination of pyridoxal-5-phosphate in human plasmahow appropriateare cut-off values for vitamin B6deficiency？”Eur.J.Clin.Nutr.53448-455，19994.Kimura等，“Highly sensitive and simple liquid chromatographicdetermination in plasma of B6 vitamers，especially pyridoxal5’-phosphate，”J.Chromatogr A.722296-301，19965.Edwards等，“A simple liquid-chromatographic method for measuringvitamin B6compounds in plasma，”Clin.Chem.35241-245，19896.Botticher等，“A new HPLC-method for the simultaneousdetermination of B1-，B2-and B6-vitamers in serum and whole blood，”Int.J.Vitam.Nutr.Res.57273-278，19877.Ubbink等，“Stability of pyridoxal-5-phosphate semicarbazoneapplications in plasma vitamin B6 analysis and population surveys ofvitamin B6 nutritional status，”J.Chromatogr.342277-284，19858.Schrijver 等，“Semi-automated fluorometric determination ofpyridoxal-5’-phosphate(vitamin B6)in whole blood by high-performanceliquidchromatography(HPLC)，”Int.J.Vitam.Nutr.Res.，51216-222，19819.Hachey等，“Quantitation of vitamin B6 in biological samples byisotope dilution mass spectrometry，”Anal.Biochem.151159-168，198510.Midttun等，“Multianalyte quantification of vitamin B6 and B2species in the nanomolar range in human plasma by liquidchromatography-tandem mass spectrometry，”Clin.Chem.，511206-1216，200511.Zimmer等，J.Chromatogr.A 85423-35(1999)12.美国专利5,968,36713.美国专利5,919,36814.美国专利5,795,46915.美国专利5,772,87416.PS.Bernard & J.M.Wallace，“Turbulent Flow AnalysisMeasurement and Prediction，”John Wiley & Sons，Inc.(2000)17.Jean Mathieu & Julian Scott，“An Introduction to Turbulent Flow，”Cambridge University Press(2001)18.美国专利6,204,50019.美国专利6,107,62320.美国专利6,268,14421.美国专利6,124,13722.Wright等，“Proteinchip surface enhanced laser desorption/电离(SELDI)mass spectrometrya novel protein biochip technology fordetection of prostate cancer biomarkers in complex protein mixtures，”Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2264-76(1999)23.Merchant和Weinberger，“Recent advancements in surface-enhancedlaser desorption/电离-time of flight-mass spectrometry，”Electrophoresis211164-67(2000)24.Rybak等，“Clinical vitamin B6analysisan interlaboratorycomparison of pyridoxal 5’-phosphate measurements in serum，”ClinicalChemistry 511223-1231(2005)
权利要求
1.一种用串联质谱法检测体液样品中5’-磷酸吡哆醛的存在或数量的方法，包括
(i)用液相色谱法纯化所述样品；
(ii)从所述纯化样品中产生所述5’-磷酸吡哆醛的母离子；
(iii)产生所述母离子的一个或多个子离子；和
(iv)检测在步骤(ii)或步骤(iii)或二者中产生的一个或多个所述离子的存在或数量，并将检测到的离子与所述样品中所述5’-磷酸吡哆醛的存在或数量相关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化步骤包括
(a)施加所述样品到萃取柱上；
(b)在使5’-磷酸吡哆醛保留在所述柱内的条件下冲洗所述萃取柱；
(c)从所述萃取柱中洗脱保留的包含5’-磷酸吡哆醛的物质；
(d)将从所述萃取柱中洗脱的所述包含5’-磷酸吡哆醛的物质施加到分析柱中；和
(e)从所述分析柱中洗脱纯化的5’-磷酸吡哆醛。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述萃取柱是混合模式的阴离子交换聚合物柱，且所述分析柱是C-8分析柱。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述萃取柱包含大约50微米的颗粒，且所述分析柱包含大约3.5微米的颗粒。
5.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(a)-(e)以在线自动化方式进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其中步骤(ii)-(iv)与步骤(a)-(e)一起以在线自动化方式进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述母离子具有248.03+/-1的质荷比。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一个或多个子离子包含具有质荷比为150.00+/-1的子离子。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血浆。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)通过电雾化电离进行。
11.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(iii)通过使用中性气体的碰撞诱导解离进行。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述中性气体是氩气。
13.根据权利要求1所述的方法，其中检测的PLP对于2-17岁的孩子来说在3到35ng/mL之间的范围。
14.根据权利要求1所述的方法，其中检测的PLP对于18岁或以上的成人来说在3到26ng/mL之间的范围。
15.根据权利要求1所述的方法，其中内标在步骤(i)之前被加入到所述体液样品中。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述内标是2-羟基-6-甲基吡啶-3-羧酸。
17.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(ii)中产生的所述内标的所述母离子具有质荷比154.04+/-1。
18.根据权利要求16所述的方法，其中步骤(iii)中产生的所述内标的所述子离子具有质荷比136.00+/-1。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述液相色谱法包括使用湍流液相色谱柱。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述湍流液相色谱柱是高湍流液相色谱柱。
全文摘要
提供的是使用结合液相色谱法的串联质谱法检测体液样品中维生素B6的活性形式5’-磷酸吡哆醛的存在或数量的方法。
文档编号C12P13/00GK101730744SQ200880023632
公开日2010年6月9日 申请日期2008年6月11日 优先权日2007年6月14日
发明者Q·蒋, S·尚, R·E·瑞茨 申请人:奎斯特诊断投资公司