专利名称：玉米胁迫反应性nac转录因子及启动子和使用方法
技术领域：
本发明涉及植物的基因操纵领域，特别是调节基因活性以影响植物的发育和生长。
背景技术：
耐旱性是受多基因控制的复杂性状。基因开关例如转录因子可对植物生理产生显 著且特异的作用，是理想的调节靶标。胁迫应答NAC转录因子(SNAC)可控制许多对适应干 旱胁迫来说重要的下游基因的表达并最终可通过例如以下的一种或多种机制来增强耐旱 性减少气孔器、延迟衰老和增加源库强度(sink and sourcestrength)。文献已显示ABA 和干旱反应性NAC可增强拟南芥(Tran等，(2004) Plant Cell 16 =2481-2498)和水稻的耐 旱性(Hu等，(2006) PNAS 103(35) 12987-12992)。因此，还可将玉米的SNAC基因单独使用 或与其它基因联合使用以增强耐旱性。异源DNA序列在植物宿主中的表达依赖于被可操作地连接的、在所述植物宿主中 有功能的调节元件的存在。调节元件的选择将决定异源DNA序列在生物体内何时何处表 达。当需要在细胞植物各处和/或发育始终持续表达时，采用组成型启动子。相反地，当需 要响应刺激物的基因表达时，诱导型启动子为所选的调节元件。当需要在特定的组织或器 官中表达时，可采用组织特异性或组织偏爱型启动子。换句话说，这类启动子可驱动在特定 组织或器官中唯一或优先表达。这样的组织特异性启动子可为暂时组成性或诱导性的。在 任何情况下，可使转化载体的表达构建体包含核心启动子序列上游和/或下游的其它调节 序列，以引起异源核苷酸序列在转基因植物中不同水平的表达。随着该领域的发展以及可获得基因的增多，对用多基因转化的植物存在更大的需 求。这些多个外源基因通常需要被各别的调节序列控制。此外，在转基因生物体中有些基 因应被组成性地调节而其它基因应在某些发育阶段或某些位置表达。因此，需要具有各种 作用的多种调节序列。还需要多种调节序列以避免非所需的分子的相互作用，该相互作用可由采用相同 的调节序列控制超过一个基因引起。发明人在本文中公开了转录因子相关启动子的分离和表征，所述转录因子可作为 用于分离的目标核苷酸序列表达的调节元件使用，从而作用于植物的各种性状。作为备选 或除此之外，所述启动子可用于驱动可评分的标记物(scorable marker)。发明简述本发明的组合物和方法包含和采用涉及调节植物发育、形态及生理的玉米SNAC 转录因子。组合物还包含表达盒和表达载体，所述表达盒和表达载体包含本发明的ZmSNAC 序列和其中ZmSNAC表达被修饰的植物、植物细胞及植物部分。本发明的植物、植物细胞及 植物部分均相对于不按照本发明修饰的植物、植物细胞或植物部分可通过以下表型的改变 表现出增强的非生物胁迫耐受例如延迟卷叶、降低蒸腾速率、增加气孔闭合和增强细胞膜 的稳定性。
本文提供了用于改变植物中ZmSNAC多肽的水平的方法，所述方法包括将选定的 多核苷酸引入植物中。所述多核苷酸可被引入构建体中，所述构建体经过设计以调节植物 各处或靶组织中或靶向的发育阶段中ZmSNAC多肽的水平或活性。附图简述
图1提供了不同品种中NAC转录因子的氨基酸比对。包括ANAC(Atlg52890， SEQ ID NO 12) ；ATAF2(At5g08790, SEQ IDNO 13) ；ATAFl(Atlg01720, SEQ ID NO 14)； NAP (Atlg69490, SEQ ID NO 15) ；AtNAM(Atlg52880, SEQ ID NO 16) ；TIP(At5g24590, SEQ ID NO: 17) ； CUC2(At5g53950, SEQ ID NO 18) ；CUCl(At3gl5170, SEQ ID NO: 19)； CUC3 (Atlg76420, SEQ ID NO 20)；拟南芥 NACl (Atlg56010，SEQ ID NO 21) ；ZmSNACl (SEQ IDNO 2) ；ZmSNAC2(SEQ ID NO 4) ；ZmSNAC3(SEQ ID NO 6) ；ZmSNAC5(SEQ ID NO 10)； ZmSNAC4 (SEQ ID NO 8)和共有序列(SEQ ID NO :22)。图2显示了由所述ZmSNACl启动子驱动的⑶S的表达。序列简述SEQ ID NO :1和2提供了 ZmSNACl的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :3和4提供了 ZmSNAC2的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :5和6提供了 ZmSNAC3的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO :7和8提供了 ZmSNAC4的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO 9和10提供了 ZmSNAC5的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO 11 提供了 ZmSNACl 的启动子序列。SEQ ID NO 12-21提供了附图简述中提及的拟南芥NAC蛋白。SEQ ID NO 22提供了拟南芥和玉米(Zea mays)NAC蛋白的共有序列。发明详述现将就附图更全面地描述本发明，附图中显示了本发明一部分但不是所有的实施 方案。事实上，本发明可具体化为多种不同形式并且不应理解为受限于本文所述的实施方 案；更准确地说，本发明提供这些实施方案以便该公开内容满足适用的法律要求。本文各处 相似的数字表示相似的要素。本发明所属领域的技术人员应想到本文所述的本发明的许多修改和其它实施方 案具有之前的说明和相关附图中提出的教导的益处。因此，应理解的是本发明并不限制公 开的特定实施方案，而且修改和其它的实施方案意欲包括在所附权利要求的范围内。尽管 本文采用了特定的术语，但其仅以一般性和描述性的方式使用并且无限制的目的。组合物本发明的组合物包括与调节植物发育、形态和生理有关的玉米SNAC转录因子多 肽和多核苷酸。具体而言，本发明提供了分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码SEQ ID N0:2、4、6、8和10所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明还提供了分离的多肽，所述多肽 具有由本文所述多核苷酸(例如SEQ ID N0:l、3、5、7和9中所述的那些多核苷酸)编码的 氨基酸序列。NAC转录因子由大范围的植物种类中存在的基因编码，该名称来源于NAM转录因 子(无顶端分生组织(no apical meristem) ；Souer 等，(1996)Cell 85 159-170) ,ATAFl, 2转录因子和CUC2转录因子(杯状子叶2 (cup-shaped cotyledon) ；Aida等，(1997)Plant Cell9 :841-857)。NAC转录因子的表达模式以及通过调节其表达赋予的突变表型 是相似的。高度保守的N端DNA结合域已被确定并且其结构已被表征(Ernst等，(2004) EMBO Reports 5(3) :297_303)。更多样化的C端区包含转录激活域(Xie等，(2000) Genes Dev. 14 3024-3036 ；Duval 等，(2002)Plant Mol. Bio. 50 :237_248)。据显示，NAC 转录因 子与涉及分生组织形成、器官分化、植物生长素信号传导、根的生长以及生物和非生物胁 迫应答的许多基因相互作用(参见Olsen等，(2005) Trends in Plant Science 10(2) 1360-1385的综述)。已在拟南芥中鉴定了 NAC的识别序列(NACRS)和核心结合序列(Tran 等，(2004)Plant Cell 16:2481-2498)。本发明包含分离或基本纯化的多核苷酸或蛋白组合物。“分离的”或“纯化的”多 核苷酸或蛋白或其生物活性部分大致上或基本上不含通常与所述多核苷酸或蛋白在其天 然存在的环境中共存或接触的其他组分。因此，当通过重组技术制备时，分离的或纯化的多 核苷酸或蛋白基本上不含其它的细胞物质或培养基，或者当用化学方法合成时，基本上不 含化学前体或其它的化学品。“分离的”多核苷酸最好不含在所述多核苷酸所来源生物体的 基因组DNA中天然地位于所述多核苷酸侧翼的序列(最好是蛋白编码序列)(即位于所述 多核苷酸的5’端和3’端的序列)。例如在不同的实施方案中，分离的多核苷酸可含有在 所述多核苷酸所来源的细胞的基因组DNA中天然地位于所述多核苷酸侧翼的少于约5kb、 4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb的核苷酸序列。基本不含细胞物质的蛋白包括具有少于 约30%、20%、10%、5%或(干重)污染蛋白的蛋白制备物。当本发明的蛋白或其生物 活性部分通过重组方式制备时，最佳的是，培养基表示少于约30%、20%、10%、5 %或1 % (干重)的化学前体或非目标蛋白的化学物质。本发明还包括公开的多核苷酸的片段及变体和由此编码的蛋白。“片段”是指部分 多核苷酸或部分氨基酸序列以及由此编码的蛋白。多核苷酸的片段可编码保留了天然蛋白 的生物学活性的蛋白片段。或者，多核苷酸的片段可用作杂交探针，所述探针通常并不编码 保留生物学活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段可为至少约20个核苷酸、约50个核 苷酸、约100个核苷酸和多至编码本发明的蛋白的全长多核苷酸。编码本发明的NAC转录因子的生物活性部分的ZmSNAC多核苷酸片段应编码至少 15、25、30、50、100、150、200、225、250、275、300或339个邻接的氨基酸，或多至本发明的全 长多肽的氨基酸总数。SNAC多核苷酸的片段可用作通常不需要编码具有生物活性的多肽的 杂交探针或PCR引物。因此，ZmSNAC多核苷酸片段可编码SNAC转录因子的生物活性部分，或它可以是利 用以下公开的方法被用作杂交探针或PCR引物的片段。SNAC转录因子的生物活性部分可通 过以下方法制备分离本发明ZmSNAC多核苷酸之一的一部分，表达ZmSNAC蛋白的编码部分 (例如通过体外重组表达)并评价编码部分的活性。活性可通过DNA结合活性或蛋白相互 作用研究来评价，和/或通过在转基因植物中表达ZMSNAC蛋白或所述蛋白的部分并评估所 述植物的表型来评价。作为ZmSNAC核苷酸序列片段的多核苷酸包含至少16个、20个、50个、75个、100 个、150 个、200 个、250 个、300 个、350 个、400 个、450 个、500 个、550 个、600 个、650 个、700 个、800个、900个或1000个邻接的核苷酸，或多至本文公开的全长ZmSNAC多核苷酸中的核
苷酸数。
5
“变体”意指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或 多个位点处一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或天然多核苷酸中一个或多个位点 处一个或多个核苷酸的取代。本文所用“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷 酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编 码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过利用已知的分子生物学技术 (例如下文概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术)来鉴定。变体多核苷酸还包括合成 来源的多核苷酸，例如通过利用定点诱变得到但仍编码本发明的ZmSNAC蛋白的那些多核 苷酸。通常，根据本文其它地方所述的序列比对程序和参数所确定，本发明的特定多核苷酸 的变体应具有相对于所述特定多核苷酸的至少约40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列 同一性。本发明的特定多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体还可通过变体多核苷酸所编码 的多肽与参考多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分比的比较来评价。因此，例如 公开了分离的多核苷酸，其编码的多肽与SEQ ID N0:2、4、6、8或10的多肽具有既定的序列 同一性百分比。任何两条多肽之间的序列同一性百分比可利用本文其它地方所述的比对程 序和参数来计算。本发明的任何既定的多核苷酸对是通过比较它们所编码的两条多肽共有 的序列同一性百分比来评价，两条编码多肽之间的序列同一性百分比为至少约40%、45%、 50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%、99%或更大的序列同一性。“变体”蛋白意指通过天然蛋白中一个或多个位点处一个或多个氨基酸的缺失或 添加和/或天然蛋白中一个或多个位点处一个或多个氨基酸的取代由天然蛋白衍生而来 的蛋白。本发明所包括的某些变体蛋白是有生物活性的，换句话说它们依然具有天然蛋白 所需的生物活性，即本文所述的转录因子活性。这样的变体可由例如遗传多态性或人为操 作产生。根据本文其它地方所述的序列比对程序和参数所确定，本发明的天然SNAC蛋白 的生物活性变体与天然蛋白的氨基酸序列具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的 序列同一性。本发明的蛋白的生物活性变体可与所述蛋白相差少至1-15个氨基酸残基、少 至1-10个(例如6-10个)、少至5个、少至4个、3个、2个或甚至1个氨基酸残基。本发明的蛋白可以以各种方式被改变，包括氨基酸的取代、缺失、截短和插入。 用于这些操作的方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备SNAC蛋白 的氨基酸序列变体和片段。用于诱变和多核苷酸改变的方法为本领域所熟知。参见 例如 Kunkel (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 488-492 ；Kunkel 等(1987)Methods inEnzymol. 154 :367_382 ；美国专利第 4，873，192 号；Walker 和 Gaastra 编辑· (1983) Techniques in Molecular Biology(MacMillan PublishingCompany, New York),以上 文献在此引作参考。不影响目标蛋白的生物活性的合适的氨基酸取代的有关指南可参见 Dayhoff ^ W Il M (1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl. Biomed. Res. Found. , Washington, D. C.)，其在此引作参考。保守取代例如将一种氨基酸换成具有相 似性质的另一种氨基酸可为最佳的。因此，本发明的基因和多核苷酸包括天然存在的序列及突变形式两者。同样地，本
6发明的蛋白包括天然存在的蛋白及其变型和修饰形式。这样的变体应仍具有所需的转录因 子活性。显然，对编码变体的DNA作出的突变决不能安排在阅读框之外的序列中，而且最好 不应产生能引起mRNA 二级结构的互补区。本文包括的蛋白序列的缺失、插入和取代不期需对该蛋白的特性产生根本性的变 化。然而，当在进行所述取代、缺失或插入之前很难预测它们的确切效应时，本领域技术人 员应认识到该效应可通过常规的筛选测定法来评价。即活性可通过测定DNA结合活性或蛋 白之间的相互作用、瞬时研究中基因表达的激活情况或转基因植物中基因表达的效应来评 价。变体多核苷酸和蛋白还包括通过诱变方法和重组方法(例如DNA改组(DNA shuffling))得到的序列和蛋白。利用所述方法可操作一种或多种不同的NAC编码序列， 以产生具有所需性能的新型NAC多肽。重组多核苷酸文库是以这种方式由一群相关序 列的多核苷酸产生，所述多核苷酸包含具有基本的序列同一性并可在体内外被同源重组 的序列区。例如，采用该方法，编码目标结构域的序列基序可在本发明的ZmSNAC基因与 其它已知的NAC基因之间被改组，以得到编码具有增强的目标性能的蛋白的新基因。用 于此类DNA改组的策略为本领域已知。参见例如Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91 10747-10751 ；Stemmer(1994)Nature 370 389-391 ；Crameri 等(1997)Nature Biotech. 15 :436_438 ；Moore 等(1997)J. Mol. Biol. 272 :336_347 ；Zhang 等(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :4504_4509 ；Crameri 等(1998)Nature 391 :288_291 ；PCT
发明者N·J·贝特, X·牛 申请人:先锋高级育种国际公司