专利名称：用于检测食品和饲料中花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子的引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用环介导等温扩增技术进行转基因产品快速筛选的方法，具体是一种快速检测转基
因植物常用启动子花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子所用的引物序列。
背景技术：
自1983年第一例转基因作物问世以来，转基因技术在农业各领域得以迅速应用与发展。全球转基因 作物品种不断增加，种植面积己累计达到6.9亿公顷。采用转基因技术，可对农作物的质量、数量进行精 确的改良和提高。转基因作物在产量、抗逆能力(包括抗病、抗虫、抗冻、抗除草剂)和营养品质等方面 较传统作物有显著改进，可大大降低生产成本，缓解环境的不断恶化。在享用转基因技术带来的巨大实惠 的同时，转基因产品潜在的生态安全、食品安全问题也日益引起人们关注，各国纷纷制定相应的法律法规 对转基因产品进行监管。除美国、加拿大、阿根廷、和中国香港特区实行自愿标识制度外，国际上大多数 国家如欧盟各国、匈牙利、瑞士、波兰、日本、韩国等均制定了强制性标识制度。我国于2001年、2002 年颁布实施《农业转基因生物安全管理条例》及《农业转基因生物标识管理办法》，启动了农业转基因生 物的监督监管机制。我国政府规定，凡是列入标识管理目录并用于销售的农业转基因作物，应当加以标识， 未标识和不按规定标识的，不得进口和销售，因此，必须对转基因产品进行有效的检测。
在利用基因工程技术将一个外来基因整合进入植物细胞时，外来基因必须配备一个启动子。启动子是 决定基因表达部位、时间、强度的主要调控元件。花椰菜花斑病毒CaMV的35S启动子能在许多植物物种 中，几乎所有发育阶段及所有组织中高效表达，被广泛用于构建转基因植株，如玉米、棉花、大豆、番茄 等，大约有85-90%的转基因植物使用了该启动子。35S启动子有很多版本，但其保守序列相当稳定，是转 基因检测的最佳靶点。通过检测CaMV35S启动子，可筛选产品中是否含转基因植物成分，
目前转基因产品的检测，主要采用蛋白检测和DNA检测的方法。两类方法，对于不同产品中转基因 成分的检出和定量检测，各有优、缺点。以DNA为测试对象的方法与以蛋白为测试对象的方法相比，在 产品成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受产品基质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象 蛋白质组成那样易受加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法中，主要采用聚合酶链式反应(PCR)， 该方法灵敏、特异，但需要昂贵的试剂和仪器。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, 简称LAMP)技术，是一种新型的体外恒温核酸扩增方法，具有高特异性、高效率和快速灵敏的特点，可以 大量扩增所需的靶序列。实验结果可通过使用染料，在日光下肉眼直接判定。该方法只需要极少的试剂费 用和一个水浴锅即可完成绝大多数检测过程，是真正普及型的核酸检测方法。
发明内容
本发明的目的是针对花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子，设计一组特异性引物，进而建立一种快速筛选转基因产品的方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些产品检测中的局限性，为转基因产品检测提供有 效工具，从而加强转基因产品的监督监管，确保产品标签的一致性，保护消费者的知情权和选择权。
本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物 和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含耙DNA的正义链和反义链；(2) 其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参 与下由--个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动 的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA; (3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA 的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA; (4)在等温条件下，内引物以 茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使 靶DNA累积到109-101(1拷贝。扩增结果可通过荧光染料染色肉眼观察。
本发明涉及的花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子环介导等温扩增检测用的引物，其序列如下
(1) 上游内引物(FIP): 5'-AGGTGGCACCTACAAATGCCATCGGCAGAGGCATCTTGAAC-3';
(2) 下游内引物(BIP): 5'-TAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGTCTCAGAAGACCAAAGGGC-3';
(3) 上游夕卜弓l物(F3): 5'-TCCATCTTTGGGACCACTGT國3';
(4) 下游外引物(B3): 5'-CGACACTCTCGTCTACTCCA-3';
在应用中，上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物体积比为6:6:1:1; 使用上述引物，检测产品中转基因植物成分的方法，依次包括下列步骤(1) - (3):
(1) 待检样品DNA的提取
DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。
(2) CaMV35S启动子环介导等温扩增
A. 在扩增反应管中加入10XBst buffer反应缓冲液2.5nL (内含200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基 甲垸-盐酸、100mtnol/L氯化钾、10Ommol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1%曲拉通X-IOO)、 25mmol/L dNTP1.3nL、 100mmol/L硫酸镁3nL、 2mol/L甜菜碱5pL、 10nmol/L上游内引物3pL、 10nmol/L下游内引 物3jiL、 10nmol/L上游外引物0.5nL、 10nmol/L下游外引物0.5nL、 8U/nL Bst DNA聚合酶lnL、 ddH20
(灭菌双蒸水)3.2nL,混匀；
B. 在扩增反应管中加入待检样品DNA2nL (200ng),混匀；
C. 于恒温水浴上65'C放置60min;
D. 将水浴调到85'C中止反应，5min后取出待检。 (3)显色检测
在待检的每个反应管中加入1HL显色剂PICO Green,直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为红色，说明待检样品未检出CaMV35S启动子，如果颜色变为橙黄色，则说明检出CaMV35S启动子，待检样品 中含有转基因植物成分。
本发明根据花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子的保守序列，设计了两个特异性内引物和两个特异性外 引物。该组引物可保证不同转基因植物中花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子的检出。使用该组引物，采用 环介导等温扩增技术，可灵敏、特异地检出产品中的CaMV 35S启动子。该方法不需要昂贵的PCR仪， 只需普通的水浴锅，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料观察即可，简单而快速，特别适用 于一些基层单位。
图1用环介导等温扩增技术检测某待测豆腐样品DNA，样品的显色反应。 图2用环介导等温扩增技术检测某待测大米样品DNA，样品的显色反应。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
按照以下程序进行检测
(1)待测豆腐样品DNA的提取
A. 称取0.1g豆腐，剪碎，转至1.5mL离心管中。加入600nL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀后，65'C 水浴保温10min:
B. 在管中加入等体积酚/氯仿600nL，上下颠倒充分混匀，抽提2min;
C. 12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置10min 后，12000g离心5min,去上清，保留沉淀；
D. 在沉淀中加入60nL RNA酶，37'C放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37'C溶解沉淀，5min 后加入300pL缓冲液，上下颠倒混匀10次；
E. 取出离心柱，将离心柱放置在l个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min;
F. 将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec,弃去套管中溶液，在离心柱中加入200nL洗液，8000g 离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
G在离心柱中加入200nL70。/。乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次
H. 12000g离心30sec,除去离心柱中痕量残留溶液；
I. 将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50nL洗脱缓冲液，37'C放置2min 后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。(2)待测豆腐样品DNA的环介导等温扩增
A. 在扩增反应管中加入10XBst buffer反应缓冲液2.5nL (内含200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基 甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、lOOmmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1%曲拉通乂-100)、 25mmol/L dNTP1.3nL、 100mmol/L硫酸镁3nL、 2mol/L甜菜碱5pL、 10nmol/L上游内引物3pL、 1Onmol/L下游内引 物3nL、 10nmol/L上游外引物0.5nL、 1Onmol/L下游外引物0.5pL、 8U/|iL Bst DNA聚合酶1jiL、 ddH20
(灭菌双蒸水)3.2(lL，混匀；
B. 在扩增反应管中加入待检样品DNA2nL (200ng)，混匀；
C. 于恒温水浴上65'C放置60min;
D. 将水浴调到85'C中止反应，5min后取出待检。 (3)加入显色剂PICOGreen，显色检测
样品管颜色变为橙黄色，见图1。阴性对照和阳性对照结果均正常，据此可判定该样品检出花椰菜花 斑病毒CaMV35S启动子。
实施例2
按照以下程序进行检测 (1)待测大米样品DNA的提取
A. 取大米适量，磨碎后，称取0.1g转至1.5mL离心管中。加入600|iL预热的裂解缓冲液，轻轻混匀 后，65'C水浴保温10min;
B. 在管中加入等体积酚/氯仿600nL，上下颠倒充分混匀，抽提2min;
C. 12000g离心5min，吸取上清到一新的离心管中，加入与上清等体积的沉淀液，混匀，常温放置10min 后，12000g离心5min，去上清，保留沉淀；
D. 在沉淀中加入60jiL RNA酶，37'C放置2min后，用枪头将其充分混匀，于37'C溶解沉淀，5min 后加入300nL缓冲液，上下颠倒混匀10次；
E. 取出离心柱，将离心柱放置在l个2mL的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min;
F. 将离心柱和2mL套管一起用8000g离心30sec，弃去套管中溶液，在离心柱中加入200(iL洗液，8000g 离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
G在离心柱中加入200nL70。/o乙醇，8000g离心30sec，弃去溶液；重复此步骤一次；
H. 12000g离心30sec，除去离心柱中痕量残留溶液
I. 将离心柱放置在一个新的1.5mL离心管中，在离心柱底部中央加入50nL洗脱缓冲液，37'C放置2min 后，12000g离心30sec。离心管中的溶液即可用作PCR反应的模板。(2)待测大米样品DNA的环介导等温扩增
A. 在扩增反应管中加入10XBst buffer反应缓冲液2.5nL (内含200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基 甲烷-盐酸、10Ommol/L氯化钾、10Ommol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1X曲拉通X-100)、 25mmol/L dNTP1.3nL、 10Ommol/L硫酸镁3nL、 2mol/L甜菜碱5pL、 1Onmol/L上游内引物3jiL、 1Onmol/L下游内引 物3(jL、 10jxmol/L上游外引物0.5nL、 1Onmol/L下游外引物0.5nL、 8U/pL Bst DNA聚合酶ljiL、 ddH20
(灭菌双蒸水)3.2nL，混匀；
B. 在扩增反应管中加入待检样品DNA2nL (200ng),混匀；
C. 于恒温水浴上65'C放置60min;
D. 将水浴调到85'C中止反应，5min后取出待检。 (3)加入显色剂PICO Green，显色检测
样品管颜色变为橙黄色，见图2。阴性对照和阳性对照结果均正常，据此可判定该样品检出花椰菜花 斑病毒CaMV35S启动子。核苷酸序列表
<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
〈120〉用于检测花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子的引物
<160〉 4
<210> 1
<211〉 41
〈212〉腿
<213>人工序列
<221〉 prim—bind
<222> (1)".(41)
〈400〉 1
aggtggca_cct￡icaaatgccatcggcagaggcatcttg^c 41
<210> 2
〈211〉 42 <212〉腿 <213〉人工序列
<221〉 prim—bind
〈222〉 (1)…(42)
<400〉 2
tagctgggcaatggaatccgaggtctcagaagaccaaagggc 42
<210> 3 〈211〉 20 <212>腿 <213〉人工序列 〈221> prim—bind 〈222〉 (1)…(20) <400〉 3
tccatctttgggaccactgt 20
<210〉 4 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <221〉 prim一bind <222〉 (l)...咖 <400〉 4cgacactctcgtctectcca 20
权利要求
1.一种花椰菜花斑病毒CaMV 35S启动子快速检测用的上游引物和下游引物，其特征在于上游内引物序列为5′-AGGTGGCACCTACAAATGCCATCGGCAGAGGCATCTTGAAC-3′，下游内引物序列为5′-TAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGTCTCAGAAGACCAAAGGGC-3′，上游外引物序列为5′-TCCATCTTTGGGACCACTGT-3′，下游外引物序列为5′-CGACACTCTCGTCTACTCCA-3′。
全文摘要
本发明属于食品和饲料中转基因成分的检测技术，具体地说是用于检测食品和饲料中转基因植物常用启动子花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子的引物组。本发明针对花椰菜花斑病毒CaMV35S启动子，根据其基因的保守序列，设计一组特异性引物。使用该组引物，采用环介导等温扩增技术，可快速、灵敏、特异地检测CaMV35S启动子，从而筛选产品中是否含转基因植物成分。该引物也可以试剂盒的形式和其他试剂一起提供，用于核酸扩增反应。该法操作简便、重复性好。
文档编号C12Q1/68GK101550444SQ200910000630
公开日2009年10月7日 申请日期2009年1月12日 优先权日2009年1月12日
发明者刘彩霞, 敏 孙, 孙雯娴, 彪 徐, 超 林, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心