专利名称：一种重组超氧化物岐化酶基因的杆状病毒及其制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。
背景技术：
超氧化物歧化酶(SOD, Superoxide dismutase )是一种在生物体内广泛存 在的抗氧化酶。1938年Mann和Keilin在进行牛血红细胞分级分离时，发现一 种淡蓝色的含铜蛋白，但对其生理功能尚不清楚。1968年，Fricovich发现"02-使细胞色素C的还原受到一种蛋白因子抵制。1969年McCord和Fridouich证 实该抑制因子与血铜蛋白相同。并发现血铜蛋白、肝铜蛋白、脑铜蛋白皆有 超氧阴离子自由基(02-)歧化活性，故命名为超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)。近十年来SOD —直是国内外专家学者研究的热点。SOD是 体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当体内 超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，具有预防器官损伤、护肤、延 缓衰老等生理功能。同时SOD是一种很有用途的药用酶。
有关SOD的研究受到国内外学者的广泛关注，涉及到化学、生物、医药、 日用化工、食品诸领域。SOD临床应用主要集中在抗炎症方面(以类风湿以及 放射治疗后引起的炎症病人为主)，此外对某些自身免疫性疾病(如红斑狼疮、 皮肌炎)、肺气肿、抗癌和氧中毒等都有一定疗效；在食品工业主要用作食品添 加剂和重要的功能性基料;在其它方面也有相关应用。国内外已用SOD治疗氧 中毒、老年性白内障、糖尿病、心血管疾病、各种炎症等多种疾病，还可作为 辐射防护剂，用于辅助放疗与化疗以及肾、肝、心脏等器官的保护和移植，以 降低大剂量辐射所引起的副作用。世界各国都研制开发出许多富含SOD的食 品、饮料、化妆品、护肤品，以及具有增白、恢复青春、延缓衰老作用的保健目前国内SOD的生产工艺基本上以动物血或植物为原料，以Mccord和 Fridovich法提取SOD,包括以下三个步骤乙醇-氯仿除去血红蛋白；有机溶 剂和硫酸铵分级沉淀；离子交换柱层析纯化。这些方法安全性不高，易导致动 物病毒交叉感染，欧盟已于1999年颁布法令，禁止从动物血液中提取的SOD 用于人类。另外，这些方法获得最终产物量少， 一般情况下，1公斤血液只可 提取SOD 0.08克左右。
杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首 次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的oc-干扰素以来(smith, Mol Cell Biol. 3: 2156. 2165, 1983 )，已有数十个外源基因得到了高效表达，仅我国 就有cc-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22: 355-361， 1990)、 慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21: 223-227, 1995)、马立克氏病毒 糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23: 104-108， 1997)等多种。杆状病毒包括 BmNPV、 Ac画PV、 ApNPV、 BssNPV、 EOSNPV、 HaNPV、 HzNPV、 Ld函PV、 MbMNPV、 UpMNPV、 S1MNPV、 SeMNPV、 TnNPV等，昆虫宿主包括家蚕、 野蚕等。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕杆状病毒表达系统是世 界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。
本发明利用家蚕生物反应器高效表达嗜高温菌中稳定存在的SOD，在70。C 热处理后便可除去大部分杂蛋白，获得高活力SOD,简化了SOD生产的工艺 流程，降低其生产成本，SOD在一条蚕蛹中的表达量最多可达到lmg,远高于 传统的生产方式，具有重要的科研和产业化价值。
发明内容
本发明提供 一 种重组杆状病毒及其制备方法。
本发明还提供本发明所述的重组杆状病毒在制备嗜高温菌SOD蛋白中的 应用。
一方面，本发明提供一种重组杆状病毒，该病毒含有嗜高温菌SOD基因，重组病毒可接种家蚕，表达嗜 高温菌SOD蛋白，当然，本发明的重组杆状病毒不仅可以接种家蚕，还可接种 其它昆虫。
同样，利用别的杆状病毒表达系统，如AcMNPv、 ApNPv、等也可按同样 的方法表达生产。用基因重组技术，将SOD基因在多角体启动子或别的病毒和 真核生物的强启动子的控制之下，通过体内或体外重组，将SOD基因整合到杆 状病毒的基因组上，得到重组病毒。
在一个具体实施方式
中，本发明将嗜高温菌超氧化物歧化酶SOD基因的与 家蚕杆状病毒BmBacPAK6进行重组，获得重组家蚕杆状病毒BmBacPAK-SOD, 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏曰期为2008年 11月28日，保藏编号为CGMCC No.2769，分类命名为家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus )。 禾!j用本发明的重组家蚕杆状病毒 BmBacPAK-SOD接种家蚕，可获得家蚕生物反应器。该反应器可大规模生产，
具有资源优势和成本优势。
另一方面，本发明提供一种制备重组杆状病毒的方法，该方法包括制备 嗜高温菌超氧化物歧化酶SOD基因，其基因序列如SEQ ID NO.l所示；将制 备的SOD基因导入杆状病毒中，形成重组杆状病毒。
在一个具体实施方式
中，本发明提供制备重组家蚕杆状病毒的方法，是通 过PCR扩增嗜高温菌SOD基因，经酶切后与转移载体PVL1393质粒(如图1 所示)连接获得重组转移载体。然后使该重组转移载体与线性化杆状病毒 BacBAK6重组，将外源基因SOD插入杆状病毒中BacBAK6，得到含有嗜高温 菌SOD基因的重组杆状病毒，构建原理如图2所示。
另一方面，本发明提供一种利用本发明所述的重组杆状病毒制备重组SOD 蛋白的方法。该方法包括将本发明所述的重组杆状病毒感染家蚕，大量表达后， 经高温纯化。
在一个具体实施方式
中，将本发明所述的重组杆状病毒感染家蚕细胞，培 养120小时，收集细胞培养液离心后，收集沉淀，用PBS悬浮破膜，离心再收集上清即为嗜高温菌SOD基因表达产物。该蛋白具有极高的耐热性并且在70 。C处理2h后还具有80%的酶活力。
本发明中最优化的方案是从嗜高温菌(Geobacillus kaustophilus HT八426 ) 基因组中分离得到的SOD基因，将扩增后的SOD基因经BamHl ,EcoRI双酶 切后，通过粘性末端相连的方法，将目的基因与经BamHI和EcoRI双酶切的 转移载体pVL1393连接，获得重组转移载体pVL1393-SOD。经酶切和PCR鉴 定基因正确。将重组转移载体pVL1393-SOD DNA与已线性化的病毒 Bm-BacPAK6DNA由脂质体包埋后共转染家蚕培养细胞，培养4-6天，待能观 察到细胞出现感染症状后，通过噬斑筛选技术，获得携带嗜高温菌SOD基因的 大量重组家蚕杆状病毒BmBacPAK-SOD。本发明对嗜高温菌SOD基因表达产 物的活性鉴定。测得其酶活力3505 ±32 U/2x 106细胞。嗜高温菌SOD基因表 达产物经高温(70°C)纯化后可保持80%活性。
本发明提供一种药物，其活性成分为利用重组杆状病毒按照上述方法制备的 嗜高温菌SOD蛋白。
利用此方法生产SOD的优点在于
1、 家蚕缺失互补型线性化杆状病毒使筛选重组病毒高效省时。
2、 这一表达系统的表达效率高，重组SOD蛋白活性可达3505 ±32U/2x 106细胞水平， 一条蚕蛹中的表达量最多可达到lmg,而常规的原核表达，其表 达量是0.05-0.3mg/ml菌液。因而可大大降低生产成本，并使大规模生产成为可 能。
3、 杆状病毒仅是昆虫或节肢动物的病毒，对人畜无毒无害，而且经重组后 的病毒基因失去多角体的保护在自然界的生存能力很弱，不会造成公害。利用 家蚕生物反应器生产SOD与从动物血提取SOD的方法相比，能够避免动物病 毒的交叉感染，更为安全可靠。
4、 嗜高温菌SOD全长411个氨基酸，该蛋白具有极高的耐热性并且在常 温下具有较高的酶活力，因此用此方法生产的嗜高温菌SOD无需经过繁复的纯 化步骤，只需将嗜高温菌SOD基因表达产物高温处理， 可得高活力的重组嗜高温菌SOD蛋白，简化了 SOD生产的工艺流程，降低其生产成本。
与现有技术相比，利用家蚕生物反应器高效表达嗜高温菌中稳定存在的 SOD蛋白，原料易得，生产成本低，具有重要的科研和产业化价值。
图1为转移载体PVL1393质粒环状图谱； 图2为重组家蚕杆状病毒构建原理图。
具体实施例方式
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的
1、 设计引物，扩增目的片段SOD基因。
2、 构建重组载体。经EcoRI与BamHI双酶切的SOD基因片段通过粘性 末端连接至经EcoRI与BamHI双酶切的转移载体中，构建成重组转移质粒。
3、 制备含SOD基因的重组杆状病毒。取重组转移载体、线性化病毒DNA、 脂质体，用HBS混匀。加入已贴壁细胞的BmN细胞，继续培养，待细胞破裂 后，收集上清，对其进行空斑筛选，即得含SOD基因的重组病毒。
4、 SOD基因的表达与纯化。重组病毒感染家蚕细胞后，培养120小时， 收集细胞培养液，离心收集沉淀，用PBS悬浮破膜，离心再收集上清即为SOD 基因表达产物。
实施例l.SOD基因的制备
根据已发表的相关同源基因全序列，设计上游引物P1和下游引物P2，分 别含BamHI酶切位点、起始密码子ATG和EcoR I酶切位点、终止密码TAA, cDNA为模板，引物P1和P2设计如下
Pl: 5'-CGGATCCATGCGTGGGGCAAGCACGGA-3'(如SEQNO.2所示) P2: 5'- ATTTGCGGCCGCTTTAAAACGGCTGCCAAC -3 (如SEQ N0.3所示) 从嗜高温菌(Geobacillus kaustophilus HTA426 )基因组中扩增目的片段S0D基因。
实施例2.重组转移载体pVL1393-SOD的构建。
将扩增后的目的基因SOD经BamH I , EcoR I双酶切后，通过粘性末端相连 的方法，与经BamH I和EcoR I双酶切的转移载体pVL1393 (购自Introvigen 公司)连接，获得重组转移载体pVL1393-SOD。
实施例3.制备含嗜高温菌SOD基因的重组杆状病毒
取5 |u 1重组转移载体质粒和20 )u 1经Bsu36 I酶切线性化病毒DNA用HBS 将总体积补至50jul,混匀。取脂质体10jaL,用HBS将总体积补至50jal,混 匀，并将两者混勻。吸去培养瓶中已贴壁细胞的上清，将事先培养的BmN细 胞(购自上海生化细胞所)用无血清培养基TC-100洗两次，加入lOOul混合 物。27。C继续培养4-6天后，将共转染细胞的培养液转接另一瓶生长状态良好 的细胞。待感染细胞破裂后，收集上清，对其进行空斑筛选，有重组斑的即得 重组病毒BacPAK-SOD。以亲本病毒Bm-BacPAK6 DNA和家蚕细胞总DNA为 阴性对照，以pVL1393-SOD为阳性对照，选取一个重组病毒BacPAK-SOD DNA 作为鉴定样品，进行PCR扩增，然后电泳检测。结果显示，重组病毒斑能扩增 出与阳性对照大小相同的片段，但阴性对照却不能，说明SOD已经重组于病毒 BacPAK-SOD之中。
实施例4.嗜高温菌SOD在家蚕细胞中的表达
重组病毒BacPAK-SOD和Bm-BacPAK6病毒以MOI=10的剂量感染家蚕细 胞，在27。C培养箱中培养120小时，收集细胞培养液，12000rpm离心5分钟 后，收集沉淀，用PBS (0.02mol/L， pH7.4)悬浮，经冰洛超声波破膜，离心 再收集上清即为嗜高温菌SOD表达产物，-2(TC保存备用。
实施例5、嗜高温菌SOD基因表达产物的活性鉴定取实施例4中所得嗜高温菌SOD表达产物为样品。吸取4.5ml Tris'HCl-EDTA 缓冲液(pH8.2)于10ml比色管；置25。C水浴20 min;加入已恒温至25。C样 品溶液50|al,立即混匀；加入25。C预热的45 mmol/L邻苯三酚40 jal (10 mmol/LHCl溶液配置)，立即混匀；迅速倒入lcm石英比色杯325nm波长测光 密度值；每隔30s测一次光密度值，共测4min，求出邻苯三酚自氧化速 率,ODB/min。结果显示野生病毒Bm-BacPAK6转染的细胞表达产物SOD活 性为263 ±3 U/2 x 106细胞；重组病毒BacPAK-SOD转染的细胞表达产物SOD 活性达3505 ± 32 U/2 x 106细胞。
实施例6、基因表达产物的高温纯化
将实例4中所得嗜高温菌SOD表达产物于7(TC模块洛2h后，不耐高温的 蛋白在7(TC变性沉淀，噬高温菌SOD蛋白仍为溶解状态，12000rpm离心3分 钟，所得上清即为SOD基因表达产物。按照实施例5所示方法对所得SOD基 因表达产物进行活性测定，结果显示，野生病毒Bm-BacPAK6转染的细胞表达 产物高温处理后不再表现出SOD活性，而重组病毒BacPAK-SOD转染的细胞 表达产物可保持80%的SOD活性，证实了高温纯化获得高活力SOD的可行性。 以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。SEQUENCE LISTING
<110>浙江中奇生物药业股份有限公司
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权利要求
1.一种重组杆状病毒，其特征在于，该病毒含有超氧化物歧化酶SOD基因。
2. 根据权利要求1所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述SOD基因为嗜 高温菌超氧化物歧化酶SOD基因，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 根据权利要求1或2所述的重组杆状病毒，其特征在于，该病毒为家蚕 扦状病毒。
4. 根据权利要求2所述的重组杆状病毒，其特征在于，该病毒为 BmBacPAK6，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编 号为CGMCCNo.2769。
5. —种制备权利要求1所述重组杆状病毒的方法，该方法包括(1) 制备超氧化物歧化酶SOD基因；(2) 将所制备的SOD基因导入到转移载体中，获得重组转移载体；(3) 将步骤(2)获得的重组转移载体DNA与杆状病毒DNA重组，获得 重组杆状病毒。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转移载体为pVL1393。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述杆状病毒为家蚕杆 状病毒BmBacPAK6。
8. —种制备嗜高温菌SOD蛋白的方法，该方法包括用权利要求1 4任一项 所述重组杆状病毒接种家蚕，经高效表达后，高温纯化，获得嗜高温菌SOD蛋 白。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述高温纯化温度为7(TC。
10. —种药物，其特征在于，其活性成分为按照权利要求8或9所述方法 制备的重组嗜高温菌SOD蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种重组杆状病毒及其制备和应用。本发明构建含有嗜高温菌超氧化物歧化酶SOD基因的重组杆状病毒，可在家蚕中高效表达超氧化物歧化酶SOD，所述蛋白经高温纯化保持较高的SOD活性。本发明将所述嗜高温菌超氧化物歧化酶SOD基因与家蚕杆状病毒BmBacPAK6进行重组，获得重组家蚕杆状病毒BmBacPAK-SOD，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2769。本发明还公开一种用所述重组杆状病毒表达和纯化嗜高温菌超氧化物歧化酶的方法。与现有技术相比，原料易得，生产成本低，具有重要的产业化价值。
文档编号C12N7/01GK101613679SQ20091000045
公开日2009年12月30日 申请日期2009年1月13日 优先权日2008年6月25日
发明者威 于, 吕正兵, 吴祥甫, 张天成, 张志芳, 张耀洲, 阳 曹, 朱柏林, 健 陈 申请人:浙江中奇生物药业股份有限公司