专利名称：：琥珀酰二胺的制备方法及其抗菌活性的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种从细菌发酵液中分离提取得到的琥珀酰二胺(Succinamideconjugatediacid，SCD)的制备方法，及其在抗某些细菌方面的用途。
背景技术：
：抗生素已经成功用于预防和治疗由于微生物引起的感染。到目前为止，已经有几千种抗生素用于临床。由于抗生素的大量广泛使用，抗生素带来的副作用及微生物对抗生素的抗药性日益突出。如耐药性特强的绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌以及结核杆菌几乎对现有的所有抗生素都产生了耐药性，导致近年来有很多人都死于这些耐药性细菌的攻击。因此，寻找新的抗菌药物如抗生素具有重要的实际意义。微生物是抗生素等抗菌药物的主要的生物来源，是最具开发前景的资源。但由于最近几十年的不断寻找，新抗菌药物如抗生素的发现越来越难。极端环境微生物包括冷适应微生物(噬冷菌、耐冷菌、嗲熟菌、嗜酸菌和嗜碱菌等。这些微生物生活在极端的环境中，每类微生物具有独特的特征，是非常丰富的微生物资源。如有种嗜热的假单胞菌(i^Wo,mw)可产生一种铁结合化合物(pyochelin)，可抑制一些假丝酵母和一些曲霉的生长。冷适应微生物生活在冷环境中，地球上冷环境非常丰富，如海洋、两极地区、高山地区等，冷适应微生物是个非常巨大并且尚未被充分开发和利用的资源。已经有科学家从海洋冷适应微生物中发现了一些新的化合物。因此，冷适应微生物在分离新化合物方面具有很大的潜力。海洋是地球上最大的冷环境，冷适应微生物资源非常丰富。海洋冷适应微生物具有独特的生理机制适应低温环境，从中寻找新的抗菌物质具有很大的前景。海洋微生物及其代谢产物的活性成分具有化学结构的多样性、生物活性的多样性、高生物活性、特殊作用机制等一些非常值得注意的特点。国外在上世纪四十年代就开始了海洋微生物抗生物质的研究，50年前从海洋生物中发现并研制成功了第一个新抗生素头孢菌素开创了开发海洋新抗生素的先河。我们的思路是，从海洋冷适应微生物这个巨大的宝库中分离筛选新的抗菌药物，满足对新抗菌药物的需求。
发明内容本发明的目的之一是提供琥珀酰二胺(Succinamideconjugatediacid，SCD)的制备方法，及其在抗某些细菌方面的用途。本发明涉及从一株不动杆菌属的细菌菌株C4"'""o^c,wsp.)中分离提取得到琥珀酰二胺(化学结构如式l)的制备方法及在抗某些细菌方面的用途。①CH2——COO——NH3①CH2——COO——NH3式l:琥珀酰二胺化学结构式1、SCD的制备方法如下(1)供试菌株及菌悬液的制备实验菌株(丄/""06"""叩.)系本实验室从海水样品中分离，为革兰氏阴性短杆菌，通过形态学及16SrDNA序列(Genebank上申请的序列号为DQ189256)分析表明属于不动杆菌属Uc/加toZ^"w)。从-20。C保藏的菌种中取少量菌种接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于15'C进行震荡培养(200rpm，48h)进行活化，用显微计数法记数，用无菌0.8n/。NaCL溶液将菌悬液浓度调整为106107cell/mL。(2)SCD的发酵生产取上述活化好的细菌悬液接种到含有PDA液体培养基中，接种量为1%，置于15-20°C进行恒温通气发酵，通空气量0.51.0vvm，发酵35天，培养至活性物质浓度最大(72h)。(3)SCD的分离抗菌物质的分离大致经过以下几个步骤A)将发酵液于4ZC进行离心(15min，8000rpm)，收集上清液，并将上清进行减压浓縮。B)将浓縮后的上清液用分液漏斗进行萃取，所用的有机溶剂为EtOAc(乙酸乙酯)和n-BuOH(正丁醇)。C)将萃取产物回收，过硅胶层析柱，洗脱液为丙酮在石油醚中的浓度梯度(050%)，50mL为一流分。D)将流分蒸发致干，点到硅胶板上，用石油醚乙酸乙酯为3:1进行展开。把相同的Rf值的样品合并在一起，最后用丙酮重结晶，得到式l所示的琥珀酰二胺纯品。2、SCD对几种细菌的抑制作用及MIC(最低抑菌浓度)测定(1)抑菌试验首先将4种细菌菌株(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形菌)制成菌悬液(106~107)，分别取20(VL菌悬液涂布接种到牛肉膏蛋fe胨平板上，静置待菌悬液渗透到培养基中后，将无菌圆形滤纸片贴到平板表面，用微量移液器取不同浓度的SCD溶液5pL滴加到滤纸片上，用无菌水作为阴性对照，用青霉素(浓度)作为阳性对照。将平版置于37。C培养2448h，观察抑菌圈并测量直径大小。(2)最低抑菌浓度(MIC)的测定取配制好的SCD样品溶液，由高浓度至低浓度依次注入96孔板中，每孔10pL，对照组每孔注入10pL的无菌水或相应的有机溶剂，然后再往每孔中注入90tiL的供试菌株菌悬液(4种供试菌株同上，菌悬液由供试菌株生长所需的液体培养基制成)，然后将孔板置于37°C的恒温箱中进行培养，分别于24、48、72hr观察结果，在不搅动的情况下肉眼判断，孔内无菌落视为该菌完全不生长，取完全不生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。图1:琥珀酰二胺对金黄色葡萄球菌菌的抑制作用[l，对照(无菌水)；2，青霉素(0.25mg/mL)，3，琥珀酰二胺(2.0mg/mL);4，琥珀酰二胺(2.5mg/mL)]图2:琥珀酰二胺对大肠杆菌的抑制作用[l，对照(无菌水)；2，青霉素(0.25mg/mL)，3，琥珀酰二胺(2.0mg/mL);4，琥珀酰二胺(2.5mg/mL)]其实施例如下实施例1琥珀酰二胺(SCD)的制备从-2(TC保藏的菌种中取少量菌种接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于15'C进行通气培养(200rpm，48h)进行活化，用显微计数法记数，用无菌的0.8%NaCL溶液将菌悬液浓度调整为10S10、ell/mL。取上述活化好的细菌悬液接种到含有PDA液体培养基的三角瓶中，接种量为1%，置于15°C进行通气培养，通空气量0.5-1.0vvm，培养至活性物质浓度最大(72h)。将发酵液于4。C进行离心(15min，8000ipm)，收集上清液，并将上清进行减压浓縮。将浓縮后的上清液用分液漏斗进行萃取，所用的有机溶剂为EtOAc(乙酸乙酯)和n-BuOH(正丁醇)。将萃取产物回收，过硅胶层析柱，洗脱液为丙酮在石油醚中的浓度梯度(050%)，50mL为一流分。将流分蒸发致干，点到硅胶板上，用石油醚:乙酸乙酯为3:1进行展开。把相同的Rf值的样品合并在一起，最后用丙酮重结晶，得到式l所示的琥珀酰二胺纯品。经结构解析，确定结构为琥珀酰二胺(Succinamideconjugatediacid，SCD)。琥珀酰二胺的物理性质及波谱数据如下无色透明结晶，易溶于水、甲醇、乙醇。SCD分子量118，SCD分子式C4H1()02N2经过显微熔点测定仪测定，式1化合物的熔点为102104。C，紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱及质谱结构结构数据为UV(MeOH)^狀205nm(loge3.97),263nm(loge2.42);IR(KBr)vmax2926,1693,1417,1201,638cm.1;'H-NMR(CD30D,300MHz):S2.55;13C-NMR(CD3OD,75MHz):S176.2(C=0),29.8(-CH2-);EIMS(70ev):45(100),55(88),73(74),74(67),100(18),101(7);ESI-TOF:117(M-l)+.综合以上数据，可鉴定式1化合物为琥珀二酰氨(SCD)，结构见式l，琥珀二酰氨的通式结构见式2。NH3-CO-CRlR2-CR3R4-CO-NH3式2:琥珀酰二胺具有的通式结构SCD是一种天然的新的结构化合物，未曾见过报道。图中两个带圈的加号表示与两个H+结合，带有两个正电荷，这一点刚好与图谱中的数据相吻合。本发明还涉及式1结构式化合物具有抑制几种细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阳性菌生长繁殖的用途。实施例2琥珀酰二胺(SCD)对几种细菌的抑制作用及MIC(最低抑菌浓度)测定1、试验方法抑菌试验4种供试菌株分别为金黄色葡萄球菌(Stop/^/ococc^""mm)、枯草芽孢杆菌(5ac/〃MHMto'fc)、大肠杆菌(￡.co/Z)、普通变形菌(iVo化船VM/取n's)。首先将4种细菌菌株制成菌悬液(106~107)，分别取200nL菌悬液涂布接种到牛肉膏蛋白胨平板上，静置待菌悬液渗透到培养基中后，将无菌圆形滤纸片贴到平板表面，用微量移液器取不同浓度的SCD溶液5pL滴加到滤纸片上，用无菌水作为阴性对照，用青霉素(0.25mg/mL)作为阳性对照。将平版置于37'C培养2448h，观察抑菌圈并测量直径大小。96孔板法测MIC:取配制好的SCD样品溶液，由高浓度至低浓度依次注入96孔板中，每孔10pL，对照组每孔注入10pL的无菌水或相应的有机溶剂，然后再往每孔中注入卯^L的供试菌株菌悬液(4种供试菌株同上，菌悬液由供试菌株生长所需的液体培养基制成)，然后将孔板置于37'C的恒温箱中进行培养，分别于24、48、72hr观察结果，在不搅动的情况下肉眼判断，孔内无菌落视为该菌完全不生长，取完全不生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)。2、实验结果结果显示，琥珀酰二胺对4种供试细菌均有抑制作用。在96孔板法测MIC实验中，浓6度为5mg/mL和2mg/mL的孔内，4种供试菌株均未有肉眼可见的菌落出现，而其它几个浓度的孔内均有菌落出现，故可认为2mg/mL为SCD对五种供试菌株的MIC。从而得出SCD对几种供试菌株的MIC为2mg/ml。本发明还涉及式1结构式化合物对人脐带静脉内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)毒性实验的用途。实施例3琥珀酰二胺(SCD)对HUVEC增殖作用的影响1、实验方法HUVEC的分离按CheungAL的方法(CheungAL,Isolationandcultureofhumanumbilicalveinendothelialcells.Cwrew,jwotoco/s/w/m'o"o6/o/ogy,2007Feb;Appendix4:Appendix4B)j每HUVEC转移到96孔培养基平板上(lxl05/ml,200nl/well)，然后将SCD加入相应的孔中，浓度分别为5,10,15，20mg/ml，每个样品接4个孔。24h后用MTT分析方法对活细胞进行检测。MTT分析方法按照Talorete的方法(TaloreteTP,BouazizM,SayadiS,IsodaH.InfluenceofmediumtypeandserumonMTTreductionbyflavonoidsintheabsenceofcells.C,化c/z朋/ogy，2006，52(3):189-98)。对结果进行统计学分析。2、实验结果与对照样品相比，SCD在不同浓度下(5,10,15,20mg/ml)没有发现对HUVEC产生毒性(表1)。表1.SCD对HUVEC增殖作用的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>试验结论抑菌实验表明，本发明化合物琥珀酰二胺对几种细菌的生长具有明显的抑制作用，细胞毒性实验结果表明，对人细胞没有明显的毒性作用。虽然SCD对供试菌株的MIC较大，但是SCD具有新的结构，有作为母体进行改造成新型的抗菌药物的潜力，具有广阔的应用前景。同时由于SCD是个分子量很小的小分子化合物，容易透过组织和细胞。因此，SCD具有广阔的开发潜力和应用前景。权利要求1、琥珀酰二胺(Succinamideconjugatediacid，SCD，化学结构如式1所示)，其特征在于其制备方法如下式1琥珀酰二胺化学结构式1-1、以PDA为基础培养基，发酵制备琥珀酰二胺a)菌种活化从-20℃保藏的菌种中取少量菌种接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于15℃进行震荡培养(200rpm)48h进行活化，将菌悬液浓度调整为106～107cell/mL。b)发酵条件发酵培养基为PDA液体培养基，1％(v/v)接种量，15～20℃，pH6.5～7.5，通空气量0.5～1.0vvm，发酵3～5天。1-2、琥珀酰二胺分离纯化将发酵液于4℃进行离心(15min，8000rpm)，收集上清液，并将上清进行减压浓缩；将浓缩后的上清液用EtOAc(乙酸乙酯)和n-BuOH(正丁醇)进行萃取；将萃取产物回收，过硅胶层析柱，洗脱液为丙酮在石油醚中的浓度梯度(0～50％)，50mL为一流分；将流分蒸发致干，点到硅胶板上，用石油醚乙酸乙酯(3∶1)进行展开，把相同的Rf值(极性越小，Rf值越大)的样品合并在一起，最后用丙酮重结晶，得到式1所示的琥珀酰二胺纯品。2、根据权利要求1所述的琥珀酰二胺，其特征在于琥珀酰二胺具有如式2所示的通式结构。NH3-C0-CR1R2-CR3R4-C0-NH3式2:琥珀酰二胺具有的通式结构其中，Rl、R2、R3和R4各自独立地表示氢、卤原子、甲基、乙基、羟基、巯基、羧基、被羟基取代的碳原子数为1-4的烷基、被羧基取代的碳原子数为1-4的垸基、甲酰基、乙酰基。3、根据权利要求1所述的琥珀酰二胺，其抑制金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形菌等部分革兰氏阳性细菌和部分革兰氏阴性细菌的生长及抗菌用途。全文摘要本发明公开了一种SCD的制备方法及其抗菌活性的用途，内容包括(1)制备以一株不动杆菌属的细菌菌株进行发酵生产。(2)分离提取发酵液离心、减压浓缩、有机溶剂萃取、过硅胶层析柱、最后用丙酮重结晶，得到SCD纯品。(3)结构解析经紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱及质谱确定结构为SCD，结构如式2。(4)抑菌实验对大肠杆菌等几种细菌具有抑制作用。(5)经对人脐带静脉内皮细胞增殖作用的影响实验表明，SCD对人体细胞没有明显的毒性作用。本发明中SCD具有新的结构、是个小分子化合物，容易透过组织和细胞，既可进行抗菌机制研究，又有开发成新型抗菌药物的潜力。文档编号C12P13/00GK101487031SQ20091000036公开日2009年7月22日申请日期2009年1月7日优先权日2009年1月7日发明者吴登峰,常海涛,辛明秀申请人:辛明秀;常海涛;吴登峰