东方伊萨酵母、热带假丝酵母配合使用的脱毒发酵方法，及产品制备工艺的制作方法

专利名称：东方伊萨酵母、热带假丝酵母配合使用的脱毒发酵方法，及产品制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及东方伊萨酵母、热带假丝酵母配合使用的先脱毒 后发酵方法、脱毒发酵同步方法，以及用该方法制备木糖醇、乙醇、阿拉伯糖的工艺。
背景技术：
半纤维素是植物细胞壁中除纤维素之外的聚糖类，含量随不同植物而有所差别， 大致占植物体重量的20-35%，是地球上除纤维素之外最丰富的多糖。纤维素是完全由葡萄糖单元聚合成的均一性聚糖，而半纤维素则主要是由木糖以 β-(1-4)糖苷键构成主链，阿伯糖、甘露糖和半乳糖形成支链结构的非均一性聚糖。半纤维 素的木聚糖主链一般含有50-150个木糖单位，无结晶结构，结合在纤维素微纤维的表面。半纤维素比纤维素容易水解得多，用稀酸在100_13(TC条件下，就很容易将半纤维 素，水解生成以五碳糖为主要成分的半纤维素水解物。发酵半纤维素水解物生产市场容量 大的木糖醇、乙醇等各类化工产品，是能够大规模利用半纤维素资源的有效途径。虽然用稀酸将半纤维素水解生成以单糖为主要成分的水解物的过程并不困难，但 是，稀酸水解过程会伴随产生一系列微生物代谢抑制物，要改善半纤维水解物的发酵性能， 必须除去其中的微生物代谢抑制物，即脱毒过程是必不可少的。目前在半纤维素水解物中已鉴定的毒物成分已经有几十种，其中代表性毒物包括 三大类，即糠醛类化合物，如糠醛，5-羟甲基糠醛；脂肪酸类化合物，如甲酸，乙酸，丙酸； 木质素降解生成的一系列含有苯环的化合物，如愈创木酚，苯甲醛，阿魏酸等。已经报道真空蒸发，溶剂抽提，活性炭吸附，大孔树脂吸附，离子交换树脂处理，都 可以脱去某些毒物，改善水解物的发酵性能。然而，一种物理或化学方法只能除去某一类有 毒物质，通常需要联合采用多种理化措施处理，半纤维水解物才能达到比较好的脱毒效果。 但是，脱毒是一个耗费成本的过程，同时使用多种理化措施对半纤维素水解物进行脱毒处 理，必须大幅度提高产物发酵的成本。事实上，自然界的一些微生物对半纤维素水解物中的某些毒物具有降解活性。 例如，例如降解木质素及由木质素降解生成的一系列酚类化合物的白腐菌(林海陆钢 张庆娜，降解造纸废水木质素菌种的筛选鉴定及应用，北京科技大学学报。2007，29 (6) 569-573;陶杨廖俊和罗学刚，生物制浆技术最新应用研究进展。纤维素科学与技术。 2007，15(1) :70-74，降解糠醛，5-羟甲基糠醛细菌，酵母(代书玲，张鲁嘉，糠醛及其衍生 物微生物降解(转化)研究进展。氨基酸和生物资源2007，29 (4) :41-45;刘爱平许学 书樊行雪，利用酵母生物转化植物纤维为乙醇的研究进展。生物技术通讯，2004，15(2) 193-196)，降解短链脂肪酸的子囊菌(何刚强堵国成刘立明，嗜热子囊菌利用短链有机 酸生产角质酶。生物工程学报，2008，24 (5) 821-828)近年有人开始尝试以生物酶法去除水解物中的毒物。Jonsson等人用漆酶与过氧 化物酶联合处理木材酸水解物，能除去了大部分的单环酚性物(monoaromatic phenoliccopounds) 0处理后的水解物用于乙醇发酵，结果葡萄糖消耗速率与乙醇生成速率提高 了近 5 倍(Jonsson J L, Palmqvist E, Nilvebrant N 0. , Detoxification of wood hydrolysates with laccase andperoxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Appl. Microbiol Biotechnol. 1998，(49) :691_697))。但复杂的毒物成分需要 复杂的酶系的联合降解，这无疑大大增加了脱毒的成本。Lopez等人以微生物Conichaeta ligniaria NRRL 30616发酵处理木质纤维稀酸 水解物，不仅去除糠醛、5-羟甲基糠醛的效果显著，同时也明显减少了水解物中的酚类物 质。经过这一菌株处理的水解物再用产乙醇酵母发酵，80h产生1. 66% 0乙醇，而未处理的 去口没有乙酉享产生(Lopez J Μ,Nichols N N,Dien B Set al. Isolation of microorganisms for biological detoxification oflignocellulosec hydrolysates. Appl Microbiol Biotechnol. 2004,64(1) :125_131)。上述研究表明，利用微生物降解木质纤维水解物中复杂有毒物质是可能实现的。 尤其是，如果能够获得一种同时具备降解半纤维水解物中的三大代表性毒物的代谢系统， 即可以同时降解糠醛、脂肪酸及含有苯环结构化合物的微生物，并且这种微生物又不能利 用木糖的话，那么直接利用这种微生物发酵半纤维水解物进行脱毒物质处理，就能有效克 服现有理化脱毒方法工艺繁琐、成本高的缺点，并具有环境友好的优势。此外，半纤维素容易水解，用稀酸或酶处理植物纤维材料，很容易生成以木糖、阿 拉伯糖为主要糖类，还包括其它杂糖的水解物。只有将半纤维素水解物中的木糖、阿拉伯糖 分别纯化出来之后，它们才能实现各自的商业应用价值。纯净的木糖主要用途是制备木糖醇。木糖醇由木糖还原生成，具有甜度与蔗糖相 当，无致龋性，在体内代谢不需胰岛素参与，也不会造成血糖的急剧变化等重要特性，在防 龋齿食品，糖尿病人食品具有重要的应用价值。纯净的阿拉伯糖不仅风味与蔗糖极为相近，它的许多特殊的功能也引起了人们的 广泛关注。例如阿拉伯糖能够抑制蔗糖酶的活性，从而抑制人体对蔗糖的吸收，可用于控制 因食用蔗糖引起的血糖升高；阿拉伯糖具有抑制脂肪合成酶的活性，可用于预防肥胖。此 外，阿拉伯糖还可用作合成核苷类药物的中间体，在医药工业中有应用范围。然而，无论木糖或阿拉伯糖，只有达到很高的纯度之后才可能体现出较高的商业 价值。木糖、阿拉伯糖的分离纯化，就成为其制造过程中极为重要的环节。美国专利6，086, 681，(从溶液中回收木糖的方法，Method for recovery ofxylose from solutions, United States Patent (2000) 6，086，681)提供了一种以结晶 工艺从植物纤维的稀硫酸水解物中分离木糖的方法，该法将纯度为30-60% (对总糖)的木 糖溶液浓缩到木糖过饱和，然后冷却析出晶体木糖。不过这一发明没有涉及如何分离残余 在母液中的木糖，也没有涉及如何分离已知存在于水解物中的阿拉伯糖。美国专利6，872，316(木糖的回收，Recovery of xylose, United StatesPatent (2005) 6, 872, 316)提供了一种纳滤(nanof iltration)工艺提高植物纤维水 解液中的木糖纯度的方法。因为木糖能够较容易地透过纳滤膜，其它杂质如低聚糖、二价 盐，己糖，色素等则较多地被截留滤膜内侧。因而植物纤维水解液的纳滤透过液的木糖纯 度，可比原始水解液提高1倍以上，其后续的离子交换，脱色等工艺负担也随之减轻。在这 一发明中，阿拉伯糖与木糖一样容易透过纳滤膜，因此它不能实现木糖与阿拉伯糖之间的分离。另外，纳滤对于单糖的分离效果也是十分有限的。阳离子对单糖(或糖醇)有吸附作用，利用携带有阳离子材料作色谱填料分离不 同的单糖或糖醇，是人们从多种单糖的混合溶液中分离目标单糖(或糖醇)的手段之一。美国专利6，506，89用甜菜根制备阿拉伯糖，Method of pr印aringl-arabinose from sugar beet pulp. United States Patent (2003)，6，506，897提供的一种制备阿拉伯 糖的方法，包括了下几个步骤a)用强碱溶液提取已经榨过糖的甜菜根。b)用强酸水解前 一步骤所获得的粗阿拉伯聚糖。c)酸水解液中和，过滤。d)用单价阳子树脂(选用钠，或 钾型)作为分离树脂，色谱分离出阿拉伯糖组分。e)经阳、阴离子交换树脂及吸附树脂进 一步纯化所获得的阿拉伯糖溶液。f)结晶回收晶体阿拉伯糖，纯度98%以上。这一专利先 用碱提取物料，再用酸水解的工艺显然比较繁琐，另外，专利中有介绍水解液中是否存在木 糖，也没有介绍如何分离木糖的问题。中国专利01816511. 7(专利名称弱酸阳离子交换树脂色谱分离法从溶液中回收 单糖；国际申请PCT/FI2001/000848 2001. 9. 28 ；专利权人芬兰，达尼斯科甜味剂股份有 限公司；发明人H海基莱，J云帕伊宁等)介绍了利用结合了 Na+、Mg2+、H+或Ca2+型的弱酸 性阳离子交换树脂用于色谱分离，使用包括至少一个步骤的色谱分离的多步骤工艺，从含 鼠李糖、阿糖、木糖和其混合物的单糖的溶液中回收选自鼠李糖、阿拉伯糖(阿戊糖)、木糖 和其混合物的单糖的方法。这一专利的正文及附图描述均显示，它所提供的色谱分离方法 中，其木糖组分与阿拉伯糖的组分并未完全分离。此外，它也未述及选择性转化糖为糖醇， 以及如何进行糖醇与糖之间的分离问题。除了将阳离子交换树脂上作为糖的色谱分离填料之外，一些结合了阳离子的无机 材料也被用于糖类的分离纯化。美国专利4，664，718从戊糖/己糖混合物中分离阿拉伯糖的方法；Chang ； Chin-Hsiung, Process for separating arabinose from a pentose/hexose mixture()。 United States Patent (1987)，4，664，718介绍了以钙Y-型沸石，或钙X-型沸石作吸附 剂，从戊糖/己糖混合物中分离阿拉伯糖的方法，但这一专利没有涉及分离回收木糖，或木糖醇。美国专利4，857，从其它醛糖混合物中分离阿拉伯糖的工艺； Kulprathipanja,Process for separating arabinose from a mixture of otheraldoses, United States Patent (1989)，4，857，642介绍用铵X-型沸石作吸附剂，从其它醛糖混合 物中分离阿拉伯糖的方法。美国专利4，880，919从醛糖混合物中分离阿拉伯糖的工艺； Kulprathipanja,Process for separatingarabinose from a mixture of aldoses,United States Patent (1989), 4, 880，919介绍用钙-铵型混合的阳离子交换树脂作吸附剂分离阿 拉伯糖。这两个专利也均未涉如何回收木糖或木糖醇的问题。以水为洗脱剂，单糖、糖醇在阳离子树脂(或沸石)上的色谱分离效果，取决于它 们分子结构的亲/疏水性能。具有相同碳原子数的同一类糖(例如，属于五碳醛糖的木糖 与阿拉伯糖)，或具有相同碳原子数的糖醇(如五碳的木糖醇与阿拉伯糖醇)之间，彼此互 为同分异构体，而其化学性质十分相近，同一种阳离子树脂对它们之间吸附能力的差异也 就很小。所以，无论用阳离子树脂(包括Na+、Mg2+、H+或Ca2+)直接分离半纤维素水解物中 的五碳糖(木糖与阿拉伯糖)，或者是分离水解物经化学氢化后所生成的醇液(糖生成相应
6的醇)，都存在设备分离效率不高，产品的收率与纯度偏低等难于解决的困难。为了提高分离效率，许多学者采用了生物发酵辅助纯化的手段，即利用只能同化 特定单糖的微生物选择性除去不需要的糖类，使水解液中目标单糖的纯度相对提高，以提 高后续分离工序的效率。Nyun 等人Nyun Ho Park, Shigeki Yoshida, Akira Takakashi, et al. Anew method for the preparation of crystalline L-arabinose fromarabinoxylan by enzymatic hydrolysis and selective fermentation withyeast. Biotechnology Letters 2001，23 :411_416用来源于绳状青霉(Penicillium funiculosum)培养物的粗 酶液水解富含阿拉伯木聚糖仏1^1^110巧1皿，含28.1%阿拉伯糖，32.8%木糖)的玉米皮， 结果有21. 3% (w/w)阿拉伯糖，18. 7% (w/w)木糖被水解出来。此外，水解物中还含有一 些其它单糖及低聚糖。水解物用能够代谢木糖，但不能代谢阿拉伯糖的土星拟威尔逊酵母 (ffilliopsis saturnus)通气培养96小时，结果95% %的阿拉伯糖在发酵液中保存下来， 而木糖仅残留量只相当于原始阿拉伯木聚糖重量的0. 002%。这种发酵液经活性碳脱色，离 子效换树脂脱盐，浓缩后结晶，所获得的晶体中未检测出木糖。用生物发酵选择性地除去木 糖的方法，虽然可以解决阿拉伯糖与木糖难于分离的困难，但却浪费了宝贵的木糖资源。李道义等人李道义，闫巧娟，江正强等(中国农业大学)，酵母菌发酵玉米皮酸 水解液制备结晶L-阿拉伯糖。食品科学，2007，28 (4) 125-127，用自己筛选的酵母菌株 WYS15-3发酵玉米皮的稀酸水解物7天，结果选择性地除去了水解液中的葡萄糖与木糖。发 酵液经脱色，脱离子、浓缩结晶等步骤，获得含量为97%的阿拉伯糖，得率为玉米皮干基的 9. 6%。按这一实验所用的菌株与方法纯化玉米皮水解液制备阿拉伯糖，不仅没有利用木糖 资源，而且生产过程太长(7天)。此外，由于所用酵母菌株不能同化水解液中的半乳糖，存 在于阿拉伯糖过饱和溶液中的半乳糖，直接影响了阿拉伯糖的结晶收率。中国专利200510040433. 0专利名称一种从木糖母液或木糖水解液提取木糖 和木糖醇的方法；发明人彭奇均提供了一种从木糖水解液或木糖母液中分离制备高纯度 木糖或木糖醇的技术。具体方法是以木糖水解液或木糖母液为原料，以酿酒酵母发酵除去 其中的葡萄糖，以合成的专用钙型阳离子树脂作为色谱分离树脂，以水为洗脱剂，通过模拟 移动床使木糖与阿拉伯糖等杂质分离，得到富含木糖的组分。或者将富含木糖，阿拉伯糖的 糖液直接氢化，使它们生成为相应的醇之后，再通过模拟移动床色谱分离，获得不同的糖醇 组分。但是，在本发明的举例中，分离水解液(糖液)的过程未能将木糖与其它杂糖(主要 是阿拉伯糖)彻底分离，将水解液中的糖加氢还原为糖醇之后再进行的色谱分离，也未能 将不同的糖醇(主要是木糖醇与阿拉伯糖醇)彻底分离。此外，这一专利虽然已经使用了 微生物除葡萄糖的技术，也介绍了糖液氢化后木糖醇的分离，但并没有涉及如何选择性地 将木糖转化为木糖醇，然后再将木糖醇与其它的糖分离的问题。由于以水为洗脱剂的离子色谱法在分离糖类方面的固有缺陷，人们也尝试用其它 的方法解决这一问题。美国专利2006010042从单糖混合物中分离与制备阿拉伯糖及木糖的工艺 Hollingsworth ；Rawle I，Process for the preparation and separation ofarabinose and xylose from a mixture of saccharides ；United States PatentAppIication, 20060100423]利用单糖与酮或醛试剂反应，生成糖乙缩醛(acetals of the
7saccharides)，根据不同的糖乙缩醛对极性、非极性有机溶剂溶解性能的差异，可以使不同 的糖乙缩醛彼此分离，最后再分别将其水解为相应的单糖。不过，大量使用有机溶剂在工业 生产中的缺点是显而易见的。冯亚青等人介绍冯亚青，刘燕同，张晓东等，从L-阿拉伯树胶提取L-阿拉伯糖， 精细化工，2003，20 (5) :288-290，以微晶纤维素，或硅胶为固定相，以正丁醇、乙酸乙酯、异 丙醇与水的混合物为流动相，连续进行二次色谱分离，最后可获得含量99%的阿拉伯糖晶 体。但是，本文并没有使来源于植物细胞壁的半纤维素作原料，它所介绍利用有机溶剂作为 流动相的色谱分离方法，在大规模工业性生产中也存在诸多的安全隐患。综上所述可见，当前工业化生产木糖醇的化学工艺、或直接从半纤维水解物中分 离阿拉伯糖，都无法解决木糖与阿拉伯糖之间难于分离的问题。此外，由于化学还原过程的 非选择性，以现有的化学工艺也无法直接利用半纤维素水解物同时制备出木糖醇与阿拉伯 糖。微生物也能够催化木糖生成木糖醇。利用微生物直接发酵半纤维素水解物生产木 糖醇，由于具有节能，无需化学工艺所必不可少的木糖纯化过程等优势，已经引起人们的极 大关注。但目前发酵法生产木糖醇的效率还很低，尽管相关的研究报道甚多，但大多数仍局 限于半纤维素水解物的制备方法，木糖醇发酵工艺优化方面。从木糖发酵液制备结晶木糖 醇方面的研究甚少，也没有人研究发酵工艺木糖醇与阿拉伯糖制备相结合的问题。本发明人蔡爱华，张厚瑞，何成新等从蔗渣半纤维素水解物发酵液中分离纯化 木糖醇。食品科学。2006，27(7) :136-139曾经介绍，蔗渣半纤维素水解物发酵液经超滤 处理，超滤透过液经离子交换柱层析脱盐之后，再经活性炭脱色，这种木糖醇液浓缩至可溶 性固形物含量为80%，即可结晶得到含量>98. 5%的木糖醇产品。本发明人在该报道中还 注意到，结晶母液的阿拉伯糖浓度超过木糖醇浓度的45.0%，木糖浓度超过木糖醇浓度的 12. 6%时，它们都容易随木糖醇一起结晶析出。如果发酵液中的木糖或阿拉伯糖超过这一 浓度比例范围，将难于通过结晶的方法有效纯化出木糖醇。这一由发酵液制备结晶木糖醇 工艺的特点是，将发酵液净化处理之后直接浓缩结晶，得出木糖醇晶体产品，剩下难以进一 步结晶纯化，含有木糖醇，阿拉伯糖，木糖等成分的结晶母液。发明人当时显然没有意识到 木糖醇发酵与阿拉伯糖提取结合的问题。丁兴红等人丁兴红夏黎明影响半纤维素发酵液中分离纯化木糖醇关键因子 的研究。中国食品学报。2006，6(6) :87-90以木糖醇溶液与半纤维素发酵液为研究对象， 考察了木糖醇初始浓度、残糖(阿拉伯糖)、晶种和结晶温度对木糖醇结晶动力学的影响， 并确定了木糖醇初始质量浓度为750g/L，结晶温度为-4°C。在木糖醇溶液中添加1%。木糖 醇晶种，能缩短结晶诱导期的延续时间，提高结晶速度。木糖醇溶液中少量的阿拉伯糖能提 高木糖醇结晶速度，但当阿拉伯糖质量浓度高于120g/L时，木糖醇晶体的纯度会降低。这 篇报告所述工艺路线，也是将净化后的发酵液直接浓缩，浓缩液直接结晶制出木糖醇产品。 虽然它提到了发酵液中阿拉伯糖的存在将影响木糖醇晶体的纯度，但并没有论述木糖醇与 阿拉伯糖之间的分离问题。应国清等人应国清，王普，张峰，虞炳钧发酵法生产木糖醇的分离纯化工艺。中 国医药工业杂志。2002，33(3) :117—123则在含有残余木糖的发酵液(转化液)中加入 一定浓度的NaOH，沸水回流约2h，将残留在发酵液中的木糖降解为相应的酸和并生成相应的盐类，再用阴、阳离子交换树脂除去盐，最后浓缩结晶得到木糖醇晶体。这一工艺显然不 考虑回收发酵液中的其它糖类。我们用钙型阳离子树脂对木糖、阿拉伯糖及木糖醇进行色谱分离的过程中发现， 木糖与阿拉伯糖的色谱峰大部分相互重叠，但是，这两种糖与木糖醇的色谱峰却基本不重 叠(

图1)。显然，木糖醇-阿拉伯糖(糖-醇)之间的色谱分离效率，要比木糖-阿拉伯糖 (糖-糖)之间的分离效率高得多。如果我们能够选择性地将半纤维素水解物中的木糖转 化为木糖醇，并使阿拉伯糖不参与反应，那么就可以实现将对原料木糖-阿拉伯糖的分离， 转变成为对产品木糖醇_阿拉伯糖的分离，木糖与阿拉伯糖之间的分离难题也就迎刃而解 了。某些酵母菌具有代谢消耗葡萄糖，转化木糖生成木糖醇，但不能利用阿拉伯糖的 特性。原来以木糖_阿拉伯糖_葡萄糖为主要成分为半纤维素水解物，经这种微生物发酵 之后就会转变为以木糖醇-阿拉伯糖为主要成分的发酵液。于是，用这种酵母对半纤维素 水解物进行一次发酵，不仅能达到生物转化(木糖转化为木糖醇)与生物纯化(细胞代谢 消耗除去葡萄糖，木糖醇与阿拉伯糖的纯度相对提高)的双重效果，而且后续的产物色谱 分离的效果也将得到有效改善。此外，对发酵液的一次色谱分离过程，事实上同时纯化了木 糖醇与阿拉伯糖两个产品，从而避免了单纯生产木糖醇或阿拉伯糖时对原料选择的严格限 制，并提高原料的综合利用水平，节约了生产成本。

发明内容
本发明的目的是为了解决现有的半纤维素水解物理化脱毒工艺所存在的过程烦 琐，成本高的问题。本发明的内容包括发明人自造纸厂，木糖厂，糠醛厂周围土壤污泥样富含培养、 分离、筛选，获得能有效改善木质纤维水解物发酵性能的两个分离物S_7和Lj-3。发明人 鉴定分离物S-7属于东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)，它在2006年9月18日被保 存到中国武汉 武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO :M206098, 不能利用木糖；分离物Lj-3属于西方伊萨酵母(Issatchenkia occidentalis)，它在2006 年9月18日被保存到中国武汉 武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为 CCTCCNO :M206097，利用木糖的能力极微弱。发明人用这种脱毒活性新菌株建立了半纤维水 解物的生物脱毒法；将脱毒活性菌株与发酵木糖生成木糖醇微生物混合接种，实现半纤维 素水解物同步脱毒发酵生产木糖醇；将脱毒活性菌株与发酵木糖生成乙醇的微生物混合接 种，实现半纤维素水解物同步脱毒发酵生产乙醇。上述两种酵母的保藏信息参见本专利申 请所附的两份保藏受理通知书。属于本发明的两个生物脱毒活性菌株S-7(CCTCC NO :M206098)和Lj_3(CCTCC NO :M206097)，其分离筛选、及分类鉴定的过程如下用蔗渣半纤维素水解物为分离培养基的基本成分，适当真空后用碱调节pH5-6。如 果制成平板，外加琼脂20g/L作为固形剂。从纸浆厂废水污染的环境采集的土壤、淤泥作分离样品。250ml三角瓶装量25ml， 接入废水或淤泥分离样品约lg，30°C，200rpm摇瓶富集培养72h。取有菌体生长的培养液在 同一培养基平板上划线分离，选择能够快速生长的类型，转到斜面保存。
斜面培养物转移到半纤维稀酸水解物中并在摇瓶条件下培养24小时，离心除去 菌体，然后接入能够同化木糖的酵母菌株进行发酵，选留那些能够有效改善半纤维素稀酸 水解物发酵性能的脱毒活性菌株。如此经过十余个批次的样品分离，获得改善半纤维素水 解物发酵性能活性最强的两个分离物，编号分别为S-7和Lj-3。高效液相色谱的检测结果表明，S-7和Lj-3对半纤维素稀酸水解物中的代表性毒 物醋酸，糠醛及酚性物均有良好的降解活性，其中S-7不利用木糖，Lj-3只能微弱利用木糖。上述方法分离得到的两个菌株于4°C冷藏或冻干法保藏。按照《酵母菌鉴定手册)》(青岛海洋大学出版社)一书提供的方法，鉴定了 S-7 和Lj-3的细胞、菌落与生理生化特征(表1，表2)。分离物S-7的生理、生化特征与《酵母 菌鉴定手册》中所描述的东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)完全相同；分离物Lj_3 的生理、生化特征与同一书中所述的西方伊萨酵母(Issatchenkia occidentalis)完全相 同。用引物5，-GCATATCAAAAGCGGAGGAAAAG-3，和 5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，，聚合 酶链式反应(PCR)扩增S-7和Lj-3的26S rDNA D1/D2区域核酸序列(方法参照Kurtzman C P, Four new Candida species from geographically diverselocations. Antonie van Leeuwenhoek,2001,79 353-361) 0测定扩增产物的核酸序列(表3，表4)，并用此序列在 GenBank核酸序列数据库中进行同源序列搜索(Nucleotide-nucleotide BLAST)。搜索结果 表明，S-7 的 26S rDNA D1/D2 区域的核酸序列，与 GenBank 现有 Issatchenkia orientalis 同一区域核酸序列同源性均达100% ；Lj-3与其中与Issatchenkia occidentalis同一区 域核酸序列的同源性达到100%。根据上述的细胞、菌落形态、生理生化与分子生物学特征的可以确定，S-7的分类 地位属于东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis) ；Lj-3的分类地位属于的西方伊萨酵 母(Issatchenkia occidentalis)。东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis) S-7在中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)的保藏号为CCTCC NO :M206098，它的26S rDNA D1/D2区域的核苷酸序列在 GenBank的登记号为EF030708http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db = nucleotide & val =116834296 ；西方伊萨酵母(Issatchenkiaoccidentalis)Lj_3 在 CCTCC 的保藏号为 CCTCC NO :M206097，它的26S rDNA D1/D2区域的核苷酸序列的GenBank登记号为EF030710http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db = nucleotide & val =116834298。表1分离物S-7、Lj-3的细胞与菌落形态特征
菌落形态细胞特征S-7表面干燥，边缘辐射状。多端出芽，细胞平均长度为10 20um之间。Lj-3有光泽，表面粘稠，边缘整齐平滑。多端出芽，细胞平均长度为5 15um。 表2分离物S-7、Lj-3的生理生化特征(+，利用；_，不利用)
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东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis) S-7 (CCTCC NO :M206098) 26SrDNA Dl/ D2区域的核酸序列(GenBank登记号EF030708)1taagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcggcaaga
61gctcagatttgaaatcgtgctttgcggcacgagttgtagattgcaggttggagtctgtgt
121ggaaggcggtgtccaagtcccttggaacagggcgcccaggagggtgagagccccgtggga
181tgccggcggaagcagtgaggcccttctgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctccaa
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541gtgtaggtcacggatgctggcagaacggcgcaacaccgcccgtcttgaaacacgga
西方伊萨酵母(Issatchenkia occidentalis) Lj-3 (CCTCC NO :M206097)的 26SrDNA Dl7/D2区域核酸序列(GenBank登记号EF030710)
1tatcaataagcggaggaaaagaaaccaacagggattgcctcagtagcggcgagtgaagcg
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481tgtggctcttcggagtgttatagccagtgcgagatgctgcgtgcggggaccgaggactgc
541gacatctgtctcggatgctggcacaacggcgcaataccgcccgtcttgtaa 本发明按下述方法制备所需要的半纤维素水解物将甘蔗渣、玉米芯、稻草等作物秸秆粉碎至适当粒度，按固液比1 6 7加入 0.3 3% (w/w)的稀硫酸或稀盐酸溶液，搅拌均勻，在耐酸的压力容器内加热至100 130°C，维持0.5 3小时。水解结束后滤除残渣，滤液即为半纤维素水解物。用固体碳酸 钙或氢氧化钙将半纤维素稀酸水解液调至PH值3 8，可直接或浓缩后再进行生物脱毒。 一般地，较高酸浓度的条件可以使用较低的水解温度，或相应缩短水解时间，较低的酸浓度 则必须提高水解温度或延长水解时间。本发明按下述方法培养用于半纤维水解物生物脱毒，木糖醇发酵，乙醇发酵的微 生物菌种脱毒菌株种子液的培养将CCTCC NO :M206098或CCTCC NO :M206097的斜面培 养物接入液体种子培养基，装液量为摇瓶容量的20%，在27--30°C，转速200rmp条件下 摇床培养12 18小时，即可获得可用于脱毒的种液。种子培养基组成为葡萄糖50g/L， MgSO4. 7H20 2g/L, K2HPO4 4g/L，KH2PO4 6g/L，酵母膏 5g/L。发酵木糖生成木糖醇的菌株种子液培养所用的菌株为热带假丝酵母(Candida tropicalis)，它在2005年6月15日被保存到中国武汉·武汉大学中国典型培养物保 藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO :M205067，分类命名为热带假丝酵母1-18 Candida tropicalis 1-18,(见发明专利“热带假丝酵母菌株的分离及其用于木糖醇生产的方法”， 发明专利申请号200510037580. 2)，含葡萄糖20g/L，木糖20g/L，其余成分与培养条件同脱 毒菌株种子培养。发酵木糖生成乙醇的菌株种子液培养所用的菌株为保藏于中国工业微生物菌种 保藏管理中心(CICC)的嗜单宁管囊酵母(Pachysolen tannophilus) CICC 1770，培养基成 分及培养条件同发酵木糖生成木糖醇的菌种培养。本发明按下述方法进行半纤维素水解物生物脱毒半纤维素水解物总糖含量为4 20% (w/w)，其中还原性单糖占总糖含量> 90% 以上，以木糖为主成分。用碱液(氢氧化钙，氨水等)调节至PH3-7，按10% (ν/ν)接种量 接入培养好的CCTCC NO :Μ206098或CCTCC NO :Μ206097种子液，在25 35°C，通气条件下 发酵脱毒5 20小时，其中的大部分微生物有毒成分即可被降解除去。收集离心沉淀的 菌体重复用于下一批新鲜的半纤维素水解物脱毒，离心上清液可直接或者浓缩后用于木糖 醇发酵，或乙醇发酵。本发明按下述方法发酵脱毒后的半纤维素水解物生产木糖醇已经过CCTCC NO :M206098，或CCTCC NO :M206097发酵脱毒过的半纤维素水解物，真空浓缩至木糖约150g/L，氨水调节至pH = 6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇发酵的 半纤维素水解物培养基。木糖醇发酵用摇瓶进行，摇瓶装量10%，按5% (ν/ν)接种量接入 热带假丝酵母(Candida tropicalis) CCTCCNO :M205067 种子液，200rmp，33°C进行发酵至 木糖消耗完。收集离心沉淀的菌体，投入到新鲜的半纤维素水解物培养基中继续新一轮的 木糖醇发酵，离心上清液用于制备木糖醇。本发明按下述方法利用半纤维素水解物进行同步脱毒发酵生产木糖醇真空浓缩半纤维素水解物至木糖含量约100-150g/L，用碱(氢氧化钙，或氨水) 调至pH3--pH7，，离心或过滤除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纤维素水解物培养基，分装 于三角瓶；取培养好的株CCTCC NO :M206098种子液，或者CCTCC NO :M206097的种子液，并 与等体积的CCTCC NO :M205067种子液混合，然后按5% (ν/ν)和用种量接入半纤维素水解 物中，摇瓶培养至木糖消耗完。离心收集沉淀的酵母细胞并用于新鲜的培养基中，继续同步 脱毒发酵。如此不断地循环，直至酵母细胞不能利用。对预先进行脱毒处理后获得的半纤维素水解物后续进行木糖醇发酵和制备阿拉 伯糖的方法包括如下步骤Si.对经过CCTCC NO :Μ206098发酵脱毒的半纤维素水解物真空浓缩至木糖约 150g/L，氨水调节至pH = 6，另加入酵母膏5g/L，得到用于木糖醇发酵的半纤维素水解物培
养基；S2.木糖醇发酵用摇瓶进行，摇瓶装量10%，按5% (ν/ν)接种量接入CCTCCNO M205067种子液，200rmp，33°C进行发酵至木糖消耗完；S3.收集离心沉淀的菌体，投入到新鲜的半纤维素水解物培养基中继续新一轮的 木糖醇发酵，离心上清液制备木糖醇；S4.对木糖醇发酵液除去细胞后，经离子交换净化，再用钙型阳离子树脂进行色谱 分离，获得纯净的木糖醇分流，所述分流的木糖醇发酵液经浓缩、结晶，获得结晶木糖醇；S5.分流木糖醇发酵液后，获得阿拉伯糖分流发酵液，对阿拉伯糖分流发酵液用铵 型阳离子树脂进行色谱分离，提高阿拉伯糖纯度，再通过浓缩、结晶，获得结晶阿拉伯糖。利用半纤维素水解物进行同步脱毒发酵生产木糖醇和阿拉伯糖的方法包括如下 步骤Si.真空浓缩半纤维素水解物至木糖含量约100-150g/L，用碱(氢氧化钙，或氨 水)调至pH3--pH7，，离心或过滤除去沉淀，加入酵母膏5g/L，得半纤维素水解物培养基；S2.取培养好的CCTCC NO :M206098种子液，并与等体积的CCTCC NO :M205067种 子液混合，然后按5% (ν/ν)和用种量接入半纤维素水解物中，摇瓶培养至木糖消耗完；S3.离心收集沉淀的酵母细胞并用于新鲜的培养基中，继续同步脱毒发酵；如此 不断地循环，直至酵母细胞不能利用；S4.对木糖醇发酵液除去细胞后，经离子交换净化，再用钙型阳离子树脂进行色谱 分离，获得纯净的木糖醇分流，所述分流的木糖醇发酵液经浓缩、结晶，获得结晶木糖醇；S5.分流木糖醇发酵液后，获得阿拉伯糖分流发酵液，对阿拉伯糖分流发酵液用铵 型阳离子树脂进行色谱分离，提高阿拉伯糖纯度，再通过浓缩、结晶，获得结晶阿拉伯糖。本发明按下述方法利用半纤维素水解物进行同步脱毒发酵生产乙醇同步脱毒发酵生产乙醇所用的半纤维素水解物的培养基，与同步脱毒发酵生产木
13糖醇的培养基相同。取培养好的株CCTCC NO :M206098种子液，或者CCTCCNO :M206097的种 子液，与等体积的CICC 1770种子液混合，然后按5% (ν/ν)和用种量接入半纤维素水解物 培养基摇瓶中，培养至木糖消耗完。离心收集沉淀的酵母细胞循环用于发酵新鲜的培养基， 继续同步脱毒发酵，如此不断地循环，直至酵母细胞不能利用。蒸馏回收离心上清液中的乙本发明用高效液相色谱法检测生物脱毒菌株对半纤维素水解物中的代表性毒物 质，及主要酚类物质降解活性。选择乙酸、糠醛及愈创木酚作为半纤维素水解物中不同类型抑制物的代表，将这 三种化合物一起加入到普通酵母培养基中，并接入脱毒活性菌株(CCTCCNO :M206097,或 CCTCC NO :M206098)进行发酵。利用这三种化合物均在198nm处均有较强的紫外吸收的特 点，在如下色谱条件WaterS486高效液相色谱仪，ZORBAX XDB-C18色谱柱，流动相甲醇 磷酸(0.2%，w/w) = 75 25 (ν/ν)，对比检测这三种化合物在发酵前后的含量变化，判断 这两个菌株对这三种代表性有毒成分均具有降解活性(图1)。由于酚类化合物在270nm附近均有强的紫外吸收，故以270nm为检测波长，以高效 液相对比检测操作1的蔗渣半纤维素水解物、操作3的经东方伊萨酵母CCTCC NO :M206098 生物脱毒，经西方伊萨酵母CCTCC NO :M206097生物脱毒的蔗渣半纤维素水解物(图2)。并 分析这一检测波长条件下的一些特征峰的信息(表4)，可知半纤维素水解物经生物脱毒处 理之后，其中的糠醛及许多有毒的酚类物质已被降解。本发明用对比生物发酵的方法检测生物脱毒菌株对半纤维素水解物的脱毒效 果用CCTCC NO :M205067 对比发酵经 CCTCC NO :M206097,或经 CCTCCNO :M206098 脱 毒处理前后半纤维素水解物，检测发酵产物木糖醇；或用CICC1770对比发酵经CCTCC NO M206097，或经CCTCC NO :M206098脱毒处理前后半纤维素水解物，检测发酵产物乙醇。可以 发现，经过本发明所提供的生物菌株及脱毒方法处理后的半纤维水解物，无论用于木糖醇 发酵或乙醇发酵，发酵物的产量、生成速率均有大幅度提高。由此即可肯定，本发明提供的 生物脱毒菌株及生物脱毒方法能有效地提高半纤维素水解物的发酵性能。本发明突出的实质性特点和显著进步是1.本发明发现并提供的东方伊萨酵母CCTCC NO :M206097，西方伊萨酵母CCTCC NO :M206098这两个菌株，对半纤维水解物中三大代表性微生物代谢抑制物以醋酸为代表 的有机酸，以糠醛为代表的糖类降解产物，及以愈创木酚为代表的酚类化合物，均同时具有 降解活性，它们对半纤维水解物均具有突出的生物脱毒活性。2.本发明利用东方伊萨酵母CCTCC NO :M206097，或西方伊萨酵母CCTCCNO M206098生物降解半纤维素水解物中的多种有毒成分，事实减少了基质中的杂质。与传统的 理化脱毒工艺相比，用本发明对半纤维素水解物进行脱毒，显然具有简捷、低成本、及环境 友好的突出优势。3.本发明提供的两个脱毒活性菌株，其中CCTCC NO :M206097完全不能同化木糖、 CCTCC NO :M206098对木糖的代谢能力也十分微弱，利用它们对半纤维素水解物脱毒，并并 不会造成其中的木糖损失。由于这一特点，将它们与发酵木糖生成木糖醇，或发酵木糖生成 乙醇的微生物置于同一发酵系统中，可实现半纤维水解物脱毒过程与木糖醇发酵，或与乙醇发酵相偶联，极大地简化发酵半纤维素水解物生产木糖醇发酵，或生产乙醇的工艺。具体而言，本发明还提供了一套通过发酵半纤维素水解物生产木糖醇，与从半纤 维素水解物提取阿拉伯糖相结合的新方法，有效解决了化学工艺生产木糖醇的过程中，以 及由半纤维素水解物提取阿拉伯糖的过程中，由于木糖与阿拉伯糖之间化学性质相近带来 的分离效率低，产品收率低，或使用有机溶剂带来的安全隐患。与现有从发酵液制备木糖醇 的工艺相比，本发明多收获了阿拉伯糖；与现有的阿拉伯糖的生产工艺相比，本发明多收获 了木糖醇。本发明对于提高资源利用率，降低木糖醇及阿拉伯糖生产成本方面的优势十分 明显。本发明的整个过程包括用酸或酶水解富含木聚糖的原料，获得以木糖，阿拉伯糖 为主成分，同时含有葡萄糖，甘露糖，半乳糖等杂糖的水解物。这种水解物经除去微生物生 长抑制物的脱毒处理之后，接入能够同化利用葡萄糖，专一性地转化木糖为木糖醇，但不能 利用阿拉伯糖的酵母菌株。当发酵液木糖浓度低至一定限度之后停止发酵，得到以木糖醇 与阿拉伯糖为主成分的发酵液。发酵液经细胞分离，离子交换脱盐，脱色之后适当浓缩，直 接用钙型阳离子树脂为吸附剂，以纯水为洗脱剂进行色谱分离，分别得到纯度99%以上的 高纯度木糖醇液，及以阿拉伯糖一杂糖溶液。高纯度木糖醇液减压浓缩，降温结晶获得晶 体木糖醇。阿拉伯糖一杂糖溶液改用铵型阳离子交换树脂为吸附剂，仍以纯水为洗脱剂 进行色谱分离，获得纯度1较高的阿拉伯糖液。最后将阿拉伯糖浓缩结晶，获得晶体阿拉伯 糖。虽然上述色谱分离过程可以在填充了阳离子树脂的固定色谱柱上完成，但工业化 的模拟移动床色谱装置能有效提高分离效率。图4显示了本发明的整个工艺过程。用于本发明的半纤维素水解物是按如下方法制备的。将富含半纤维素的材料如 玉米皮(corn fiber)、玉米芯(corn cob),蔴· (sugar cane bagasse)等，以质量分数为 0. 5-2. 5% (w/w)的稀硫酸，或盐酸，以酸液能够浸泡过物料为宜，在110-140°C条件下水解 0. 5-2. 5h。水解后收集液体部分，用Ca (OH) 2或CaCO3调节至pH3_pH4，除去沉淀，上清液再 用相当于原料重量1一3%的活性碳吸附处理。滤去活性碳的溶液再依次通过阳离子，阴离 子交换树脂净化，浓缩后即得到可用于发酵的半纤维素水解物。本发明按如下的方法，在发酵罐内利用酵母细胞选择性地催化将半纤维素水解物 中的木糖经生物催化转化为木糖醇，而阿拉伯糖不参与生物催化反应。本发明所指的微生物主要是热带假丝酵母。这种酵母能够利用半纤维素水解物 中的葡萄糖，半乳糖，甘露糖等六碳糖作为碳源生长，而不会生成相应的糖醇；对于五碳醛 糖，热带假丝酵母能够转化木糖为木糖醇，却不能利用同属五碳醛糖的阿拉伯糖。本发明实 际使用的菌株由本发明人筛选的，并保存于中国典型培养物保藏中心的热带假丝酵母菌株 Candida tropicalis CCTCC M20506专利申请号:200510037580. 2，
发明者周玉恒, 张厚瑞, 蔡爱华, 覃香香, 陈海珊 申请人:唐传生物科技(厦门)有限公司