专利名称：小麦盐敏基因TaDi19A及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及盐敏基因——锌指蛋白基因7a历7划 及其应用。
背景技术：
全世界盐渍化土地面积已超过8亿公顷，占总面积的6%。我国土地盐渍化程度更 为严重，约有7000万公顷，占总面积的10%。 土壤盐渍化严重影响农作物生长和产量。 随着经济的发展，土壤盐渍化愈来愈严重，已成为一个全球关注的社会问题；特别是我 国人口众多，土壤盐渍化已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此，培育耐 盐农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。
除了传统育种方法外,利用基因工程和细胞工程等新技术可以快速稳定地获得具有 优良耐盐能力的作物新品种。利用转基因改良植物技术将新的性状转入到作物中，以此 开发高效的转基因作物新品种，用于在盐碱地种植是一项具有广阔应用前景的技术。其 前提是，必须较系统地了解植物耐盐机制，分离高效的与耐盐相关的基因。
多年来，有关植物耐盐机制方面研究已取得了较大的的进展，克隆了大量盐胁迫相 关基因，为进一步阐明植物耐盐机制提供了理论线索和依据。 一些实验表明，将植物本 身以及其他生物中与耐盐相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因
植物的抗盐能力发生改变。转化的目的基因的表达包括两个方面 一是提高耐盐能力的 基因，可通过过表达或诱导型表达提高植物耐盐能力；二是盐敏感基因，可通过抑制或 诱导型抑制植株本身的组成型表达提高植物耐盐能力。
目前，已发现了一些能显著改变植物耐盐能力的基因，其中大部分为转录因子相关 基因。它们可通过调节下游耐盐相关基因的表达来调控植物的耐盐能力。研究表明，将 这些基因转化到植物中，根据功能选择性地控制它们在转基因植株中的表达特征，可以 明显提高植物的耐盐能力。
锌指蛋白是一类非常重要的蛋白质，参与细胞的多种生物学过程。根据序列特征， 锌指蛋白可分为多种类型，不同类型锌指蛋白在细胞中的功能具有显著差异。近年来已
有试验表明，部分锌指蛋白在植物耐盐过程中发挥重要作用。但有关TaDil9A所属锌指
蛋白基因在植物耐盐过程中的作用尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种耐敏基因——小麦锌指蛋白基因 7s"/人别及其应用。
本发明的技术方案在于从小麦中分离得到锌指蛋白基因一一小麦锌指蛋白基因 rs历7别，并构建RNAi载体或人工miRNA载体转入小麦等农作物中，以实现农作物在盐 渍化土壤中种植，充分利用次质土壤。
本发明提供的小麦盐敏基因名称为小麦锌指蛋白基因rs历7创，所述基因cDNA的核 苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
本发明还提供了含上述的小麦锌指蛋白基因^历7划的植物表达载体 pSTART-Dil9A。本发明所述基因rs历7剁及含所述基因7M)〃A4的植物表达载体pSTART-Dil9A 在培育耐盐植物中的应用。其中所述植物优选是普通小麦或拟南芥。
将本发明所述基因，根据RNAi策略导入植物细胞，植物就可以获得耐盐能力。为 了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因7s历7划的植物表达载体 pSTART-Dil9A进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物 (潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。
本发明所述的基因可广泛用于培育耐盐农作物物品种，并可为深入阐明植物耐盐机 制提供理论依据。
本发明的有益效果利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦锌
指蛋白基因7s历7划，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分 析证明，转基因植株的耐盐能力明显下降。据此可通过RNAi策略开发和培育耐盐作物 新品种。
图l 7s&7划基因全长cDNA序列的扩增结果 其中^13^61~为人0離/(^:^1+ #//7d III); Marker (下同)。
图2 TaDil9A定位于染色体短臂3BS的PCR结果。
图3 TaDil9A在多种处理下在山融3号中的半定量RT-PCR分析。
图4 TaDil9A的亚细胞定位。
图5 aDil9A转基因拟南芥植株PCR鉴定。 其中FT:野生型；VC:转化空载体；0E:过表达转基因植株(下同)。
图6 TaDil9A转基因拟南芥植株RT-PCR鉴定。
图7 TaDil9A转基因拟南芥植株各种胁迫下种子萌发情况。
图8 TaDil9A转基因拟南芥植株幼苗期根的伸长受盐抑制大于对照。
图9 TaDil9A转基因拟南芥植株开花期耐盐性弱于对照。
图10 TaDil9A转基因拟南芥植株中胁迫标记基因的半定量RT-PCR结果。
具体实施例方式
实施例l、 "Z 27划的克隆 1. 1 T&7ft4 5'和3'端克隆
(1) 根据抑制消减文库获得的7历7划部分序列，设计引物；
(2) 提取cDNA全长文库质粒，利用设计引物与T3、 T7引物，进行PCR;
(3) 将PCR产物连接到T载体，转化大肠杆菌，选取阳性克隆测序；
(4) 将5'和3，端序列拼接，设计上下游引物，用于H i7别全长克隆； 1.2小麦全长cDNA
1.2.1小麦RNA提取
(1) 将组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；
(2) 待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每100mg材料约加入lml TRIzol 提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置 5分钟；(3) 加入0. 2ml氯仿(chloroform)，剧烈振荡混匀15秒，室温放置10分钟；
(4) 4°C, 12000rpm离心15分钟;
(5) 用移液器小心吸出上层水相，加入新的1. 5ml的离心管中，加入500p 1的异丙醇 (1:1体积)，充分混匀，_20°(:,沉淀30111^或过夜;
(6) 4。C， 12000rpm离心10min，小心弃去上清液；
(7) RNA沉淀用lml的75%乙醇洗涤。4。C, 8000rpm离心10min收集沉淀;
(8) 重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀；
(9) 去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体 积(30-50 y 1)的RNase-free水充分溶解(可放于-80。C长期保存)；
(10) 紫外分光光度计及1% Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。
注a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，10D=40ug/ral。 根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的0D26。/0D28。比值应接近 2.0(比值最好在1.9 2. l之间)。
b)用1% Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取lul RNA加入3wl的 RNase-free水，加1 y 1上样缓冲液6 5'C变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3 ul 的lkb DNAMarker作为对照。 1.2.2 cDNA制备
利用逆转录试剂盒，根据手册，制备cDNA。 1.3 7历7^全长克隆
1. 引物序列见l. l部分。
2. PCR反应体系(50uL):
3. PCR反应程序为94°C预变性5min; 94。C变性45sec， 55。C复性45sec， 72 'C延伸lmin，循环35次；72"C延伸7min。
4. 扩增片段的回收、与T载体连接、转化大肠杆菌、选取阳性克隆测序。结果见图1。
1. 47^7划全长克隆的基因组定位
提取利用缺体四体系小麦DNA，利用TaDil9A特异性引物进行PCR扩增，结果表 明77^7别位于染色体3BS。结果见图2。
实施例2、 Ta历7划的表达分析
1.胁迫下RNA的提取
山融3号和济南177种子正常萌发，Hoagland培养液培养至株高约10cm时(约3 周时间)开始进行盐胁迫(200mM NaCl)、干旱胁迫(15% PEG)、 ABA、 6-BA、冷和乙
2XGC buffer 模板cDNA
dNTPs (2. 5mM each) Primerl (10tiM) Primer2(10uM) LA Taq(TaKaRa) ddH20
0. 5u 1
0. 5ul
加至终体积50 y 1烯处理。处理不同时间后，Trizol法提取幼苗根、叶RNA上。
2. 逆转录(RT)获得cDNA
逆转录产生cDNA，方法同上。
3. PCR反应及电泳
(1) 以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下
5'端引物ATGGACTCGGAGCACTGGAT 3'端引物TCAGTCGTCTCCAAATAAAGTG
(2) PCR体系
ddH2013. 5y 1
10XTaq buffer (Mg2+free)2u 1
MgCl2 (25mM)1.2y 1
Primerl (10yM)lu 1
Primer2 (10yM)lul
dNTP (lOmM each)0. 2ii 1
rTaq polymerase (5U/yl)0. ly 1
逆转录cDNA模板lul
Total Volume20u 1
(3) PCR程序
95。C 3min， 25 30 cycles 95°C 30s， 60°C 30s， 72°C 60s; 72°C 5min. 根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量。
(4) 1%琼脂糖凝胶电泳。结果见图3。
实施例3、 TaDil9A的表达定位
构建7^7似,；67^融合表达载体，转化拟南芥原生质体，培养1小时后，用荧 光显微镜观察，进行瞬时表达分析，确定TaDil9A的亚细胞定位。结果见图4。
实施例4、植物表达载体的构建(35S启动子)
植物表达载体pSTART是含有35S启动子和NPTII基因的双元载体，在其多克隆 位点上含有限制性内切酶KpnI和SacI位点。分别用限制性内切酶Kpnl和Sacl双 酶切载体pSTART和目的基因片断。完全酶切的载体在1%琼脂糖凝胶上电泳分离后， 经胶回收、用CIAP脱磷酸，然后与双酶切的cDNA片段相连，构建获得植物表达载体。 酶切体系，转化大肠杆菌DH10B感受态，鉴定重组子。连接、回收、转化及鉴定方法 同上。
(1)质粒KpnI和SacI双酶切 碱裂解法提取质粒，各取10ug酶切，酶切体系如下
Kpnl 1 u 1
Sacl 1 u 1
质粒 广2ul
10X Buffer K 1 u 1
ddH20 To 20 n 1于37'C恒温水浴锅酶切2小时以上。双酶切后以1XTAE为电泳缓冲液，将酶切 产物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pSTART大片段和目 的基因条带，回收。
(2) 质粒酶切回收的载体大片段的脱磷。
(3) 经酶切和脱磷的载体片段和目的基因片段以摩尔比1:4的比例进行16'C连
接过夜。
(4) 连接产物热激法转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，转化菌在含Kan 50y g/ml 的LB固体平板上37。C培养16小时左右。
(5) 重组子的鉴定
① 质粒的PCR验证
挑取单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37'C振荡培养过夜，碱 变性法提取质粒，用基因特异引物进行PCR扩增，体系如下
PCR反应条件如下预变性94。C 3min， 35个循环为94°C 30sec， 55。C 30sec， 72'Clmin，最后，72'C延伸10min。 PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
② 质粒酶切鉴定
提质粒进行KpnI和BamHI双酶切，酶切体系同上。0.8%琼脂糖凝胶电泳，检 测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。
实施例5、农杆菌感受态的制备与转化
5.1农杆菌AGL1/EHA105感受态的制备
(1) 从YEP平板(含50yg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50ug/ml 利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min， 28。C培养过夜。
(2) 取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培 养至OD柳,达O. 5。
(3) 菌液冰浴30min, 4°C， 5000rpm离心10min，收集菌体。
(4) 将菌体重悬于冰浴的10ml 0. 15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。
(5) 再悬浮于lml 20mmol/L冰预冷的CaC12溶液中，以200u 1/管将菌液分装在1. 5ml Eppendorf管中，置液氮中速冻lmin， -7(TC保存备用。
5. 2冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105
(1) 在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入lPg表达载体质粒DNA，混匀后冰浴 30min。
(2) 置液氮速冻lrain,迅速移至37。C保温3min。
(3) 加入无抗生素的YEP 800ul， 28。C震荡培养3hr。
(4) 7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50iig/ml利福平、50ug/ml Kan的YEP平 板上，28。C倒置暗培养2-3天。
5. 3菌体PCR鉴定
菌体PCR方法及程序同上。
实施例6、拟南芥转化及筛选 6. 1拟南芥种植将种子放入EP管中，70。/。乙醇中浸泡5min，然后清洁剂(20%漂水(白猫，上海)， 0. 1% Triton)洗涤10-15min,无菌水冲洗4次，4。C春化72h。向消毒好的种子中加入O. 5% agarose (冷却至40度以免把种子烫死，加agarose是为了有利于种子散开)，铺于1/2 MS固体培养基上，超净台上吹干，(可多吹一会，以免种子萌发过程中培养皿盖子上有 水汽)。转入人工气候室中培养一周左右，可移栽。将人工土壤装入合适大小的pot, 70度烘干2小时以上(杀死虫卵等，否则会长虫)，然后将pot放在营养液中，使其 充分吸水，将在1/2MS固体培养基上生长7-10天的幼苗移栽于饱含营养液的人工土壤 中，盖上保鲜膜，转入人工气候室中培养。1-2天后揭去保鲜膜。隔几天浇一次水(浇 在P0T底下的铁盘子里)。
6. 2拟南芥转化
(1) 当拟南芥(哥伦比亚野生型)花序形成时，将花序顶端减掉以诱导侧花序的生成。 转化前将材料浇透营养液。
(2) 转化前一天，取2ml活化的农杆菌AGL 1加到含相应抗生素的200ml YEP培养基 中，过夜培养至00,=1. 0-1.2。
(3) 离心收集菌体，并重悬于浸染液(5%蔗糖，0.04%SihvetL-77)中，使006。。=0. 8。
(4) 将花序浸入浸染液30秒，其间前后摆动花序，使花序上形成一层膜。
(5) 用保鲜膜覆盖花序，暗培养一天后揭去保鲜膜，至于19-22'C培养室培养。
(6) 隔5-7天再同法浸染一次。
(7) 大约一个月后收获种子。 6.3拟南芥转化阳性株系筛选
(1) 收获的T0代种子消毒后(75X乙醇5min，清洁剂洗涤10-15min，无菌水冲洗3 — 5 次)，铺于含50ug/mL Kan或50iig/mL Hygo的MS筛选培养基上(方法同上)。
(2) 4。C春化48h，移到人工气候室生长7-10天。将抗性小苗移到土中继续生长。
(3) 等植物绝大多数花苞已经结果荚，用小绳将植物单株绑起，以便单株收获T1代种 子。
(4) PCR扩增以转化株系的基因组DNA为模板，使用基因特异引物。PCR反应体系和反 应条件见前。结果见图5。
(5) Tl种子处理同前，在T2代植物中挑选抗性比为3:1的单插入独立株系。
(6) RT-PCR验证表明，T^历7划在转化植株中正常表达。结果见图6。
实施例7、转&历7划拟南芥抗性分析
7. 1萌发率测定
将对照、转空载体、转^历7划拟南芥种子经消毒(方法同上)后，植入含有NaCl、 ABA、甘露醇和H202的MS培养基中，25度培养，观察萌发情况。结果见图7。
7. 2植株抗性分析
(1) 拟南芥种子消毒、萌发(方法同上)；
(2) 将萌发4天幼苗转移到含有125raM NaCl中MS培养基中垂直培养，观察幼苗生 长差异。结果见图8。
(3) 将土培3周左右开花期转基因植株和对照用200mMNaCl灌溉处理，观察植株耐盐状况。结果见图9。
7.3转ra仍7ft4拟南芥幼苗中耐盐相关Marker基因分析
(1) 拟南芥种子消毒、萌发、培养(方法同上)；
(2) 经盐、旱、ABA处理后，提取根、叶RNA，逆转录形成cDNA，进行RT-PCR分析。 方法同实施例2，结果见图IO。序列表
〈110〉山东大学
〈120〉小麦盐敏基因7^历7划及其应用
<141>2009-2-17
〈160>1
〈210〉1
<211>747
<212>cDNA
<213>小麦
〈221〉小麦盐敏基因7aZ i/划基因
〈222〉(1)…(747)
<400>1
atggactcggctcgcgcctcgccgccgccaagcgcttctacgccgcgcag60
ctcggccacatcgacgatatggcgggg3tggggStgg3gg犯gtgg3C3tggacatggaa120
gacgacgggggg卿tgg已gatgcagctggatggccggag180
gtcgcctgcccctactgctagacctcggctccctctgcgtccacctcgag240
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acatcag已tgccgaagaaccattg犯a/tceLtctgttccggttctcgatgatacttcaatt600
cacctcctca3ccttgggaatcaagtattgactcgtccctcacaagtgag660
agc鄉gcgacctttgtgcaagacctggtc720
ctctccacttt3tttggaig3CgaCtg权利要求
1. 一种小麦盐敏基因TaDi19A，其特征在于所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQID No.1所示。
2. —种含有权利要求1所述基因TflZ)〃A4的植物表达载体pSTART-Dil9A。
3. 权利要求1所述基因7^Z)//il4在培育抗盐植物中的应用。
4. 权利要求2所述植物表达载体pSTART-Dil9A在培育抗盐植物中的应用。
5. 如权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述植物是普通小麦或拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种小麦盐敏基因即小麦锌指蛋白基因TaDi19A及含有所述基因TaDi19A的植物表达载体pSTART-Di19A；本发明还公开了所述基因TaDi19A及含有所述基因TaDi19A的植物表达载体在培育抗盐植物中的应用。实验证明，本发明所述过表达转基因植株的抗盐能力明显下降，据此可通过RNAi策略培育耐盐作物新品种。
文档编号C12N15/82GK101508997SQ200910014350
公开日2009年8月19日 申请日期2009年2月20日 优先权日2009年2月20日
发明者夏光敏, 徐春晖, 朔 李, 杨亚南, 王勐骋 申请人:山东大学