专利名称：一种利用种间耦合atp再生技术制备茶氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种茶氨酸的制备方法，具体是一种利用种间耦合ATP制备 茶氨酸的方法，属于酶工程技术领域和微生物发酵技术领域。
背景技术：
ATP再生技术(ATP regeneration technology)是一类把ATP生成过程和需 消耗ATP的酶反应紧密联系，以促进需消耗ATP的酶反应顺利进行的技术。 目前ATP再生技术处于探索阶段和接近实际应用阶段，正面临突破，它是中 间产物发酵法和酶工程的瓶颈技术，是实现用微生物细胞(或酶)生产众多生 物活性物质产品的关键技术，对其深入研究以期在特殊环境下对ATP再生这 一生物化学过程实现调控。按照ATP再生和酶转化底物是否由同一菌种完成， ATP再生技术分为自耦合ATP再生技术(ATP再生和酶转化底物由同一菌种 完成)和种间耦合ATP再生技术(ATP再生和酶转化底物分别由两个不同菌种 完成)。由于种间耦合ATP再生技术能够广泛地选择高活性的产物合成酶和高 ATP再生能力的面包酵母或嗜热脂肪芽孢杆菌相结合，其应用更接近实用阶 段。
茶氨酸是茶树组织合成的特有氨基酸。茶氨酸具有改善食品风味、改善睡 眠、益智、静心安神、改善经期综合症、产生欣快感、抗疲劳、防止老年性痴 呆、抗高血压、抗肺瘤、神经细胞保护等等应用方面。茶氨酸是一种具有多种 生理效应的特殊氨基酸，在食品添加剂方面已有广泛应用，在功能食品方面崭 露头角，在医药方面有待开发，市场潜力巨大。茶氨酸工业化生产的主要4种， 分别为提取法、组织培养法、化学合成法、微生物转化法。国内的研究未能形 成大规模的工业化生产。微生物转化法是最有发展前景的茶氨酸工业化生产方 法，也是目前茶氨酸商业生产国日本的主要生产方法。
现有技术中关于ATP再生技术及制备茶氨酸的状况如下 1、日本有采用共培养技术生产茶氨酸的文献报道，其实质采用的是面包 酵母作为ATP再生菌，假单胞菌为产酶菌种，催化茶氨酸转化生产中Y-谷氨
3酰基转移反应的酶是假单胞菌所产的谷氨酰胺合成酶，但文献报告并没有明确
提出种间耦合atp再生技术的概念。
2、 国内外有关种间耦合atp再生技术生产品的报道，但没有采用此技术 生产茶氨酸的报道。
3、 国外有嗜热脂肪芽孢杆菌是最佳atp再生菌种的报道，但没有该菌用 于制备茶氨酸的报道。
4、 国内外有y -谷氨酰基转移酶用于茶氨酸制备的报道，但是选择的是大 肠杆菌生产的y-谷氨酰基转移酶来生产茶氨酸，没有选择地衣芽孢杆菌所产 生的y -谷氨酰基转移酶来生产茶氨酸的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补已有技术的不足，提供一种新型的、高效的、生产 过程稳定、副产物少的利用种间耦合atp再生技术制备茶氨酸的方法。 本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种利用种间耦合atp再生技术制备茶氨酸的方法，包括以下步骤 (1 )以地衣芽孢杆菌制备y-谷氨酰基转移酶固定化细胞；以嗜热脂肪芽 孢杆菌制备l、 6-二磷酸果糖转化培养液；
(2) 将y-谷氨酰基转移酶固定化细胞、1、 6-二磷酸果糖转化培养液和 底物混合，经转化制得茶氨酸转化液；所述底物是谷氨酰胺或谷氨酸和乙胺的 混合物；
(3) 茶氨酸转化液经提取、精制得到茶氨酸。
上述步骤(1)中所述制备y-谷氨酰基转移酶固定化细胞是以地衣芽孢杆 菌作为产酶菌种进行产酶发酵制得y -谷氨酰基转移酶固定化细胞。
上述步骤(1)中所述制备1、 6-二磷酸果糖转化培养液是以嗜热脂肪芽 孢杆菌作为atp再生菌种经活化培养后经过转化培养制得1、 6-二磷酸果糖转 化培养液；所述以嗜热脂肪芽孢杆菌作为atp再生菌种经活化培养转化制得1、 6-二磷酸果糖转化培养液是以嗜热脂肪芽孢杆菌利用含有蔗糖、无机磷酸盐的 营养基质生产供能体l、 6-二磷酸果糖，制备成l、 6-二磷酸果糖转化培养液。
本发明种间耦合atp再生技术的过程概括为(1)分别建立供能系统和 酶反应系统；(2)将两个系统耦合，实现atp再生和促进酶反应。详述如下
本发明建立酶合成反应系统是采用篩选获得的高活性的y -谷氨酰基转移
4酶产酶菌种(地衣芽孢杆菌)经产酶发酵后，制备成Y-谷氨酰基转移酶固定 化细胞，该固定化细胞和酶合成反应底物谷氨酰胺(或谷氨酸)和乙胺一起构 成酶合成反应系统。
本发明建立ATP供能系统是采用嗜热脂肪芽孢杆菌利用蔗糖、无机磷酸 盐等为营养基质生产供能体1、 6-二磷酸果糖(FDP)，制备成FDP转化培养液。 其中高活性的乙酸激酶和高含量的能量供体FDP可满足茶氨酸生产过程中 ATP再生的需要。
本发明转化生产茶氨酸是将上述两个系统在一定条件下耦合,就能使催化 底物转化生成茶氨酸同时实现被消耗的ATP的再生，使茶氨酸合成反应高效 率地进行，获得高产量的茶氨酸转化液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
(1 )本成果和日本文献报道有相似之处，即采用了两个不同菌种相结合 来生产茶氨酸，采用了相同的底物谷氨酸(或谷氨酰胺)，将其Y-谷氨酰基转 移到乙胺上生成茶氨酸。但是本专利成果和日本文献报道有很大的不同，具体 为①ATP再生菌种选用了嗜热脂肪芽孢杆菌而不是面包酵母，采用嗜热脂肪 芽孢杆菌作为ATP再生菌种，具有产能水平高、生产过程稳定、副产物少等 优点；②产酶菌种选用了地衣芽孢杆菌而不是假单胞菌，用地衣芽孢杆菌作为 产酶菌种生产茶氨酸，是本发明技术方案的重要特色，目前尚无这方面的公开 报道，为本领域的专业技术发展提供了一种新思^s③催化底物转化生成茶氨 酸的酶选用了地衣芽孢杆菌所产的Y-谷氨酰基转移酶而不是假单胞菌所产的 谷氨酰胺合成酶，虽然在特定条件下，二者均可以催化谷氨酰胺(或谷氨酸) 和乙胺生成茶氨酸，但反应机理不同，副产物不同，y-谷氨酰基转移酶可催 化自转肽反应，而谷氨酰胺合成酶不能； 种间耦合ATP再生技术和日本相 关文献上所述的共培养技术相比，反映了不同的理念，而且使用了不同的操作 方法，前者所述的共培养强调两种菌在一起培养有利于茶氨酸的转化生产，但 文献中也认识到，产能培养和转化培养最适合的pH值差异太大，共培养有效 的同时，也受到两个培养最适合pH值不配的制约，限制了该项技术的进一步 发展，而本发明采用的种间耦合ATP再生技术，是对共培养技术的改进和完 善，将产能培养(FDP转化液生产)和茶氨酸转化生产分开在不同条件下进行， 不是简单地直接将产能菌种(嗜热脂肪芽孢杆菌)直接加入到茶氨酸转化生产
5培养液中，加入到茶氨酸转化培养液中的是经过活化的产能菌体培养物(包括
菌体和能量供体FDP),这样操作效果更好。
(2)目前现有技术中没有提出以1、 6-二磷酸果糖为能量供体进行ATP 再生，也没有将此方面应用于制备茶氨酸的启示，本发明提供的技术方案是一 种全新的技术方案，是一项能够促进需消耗ATP的酶反应顺利进行的技术， 也是一项适合微生物转化法生产茶氨酸的技术。在食品、医疗或酶工程领域具 有十分广阔的应用前景。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。 实施例1
将产酶菌种地衣芽孢杆菌接种斜面3(TC培养48小时，移种种子培养 (30ml/瓶)30°C 、 250转/分培养24小时，接种发酵培养(30ml/瓶)30°C 、 250 转/分培养24小时获得产酶发酵液，发酵液1000ml—4000转/分、15分钟，得 到菌体10克(y-谷氨酰基转移酶活性9u/ml)。以卡拉胶包埋菌体制备成Y-谷氨酰基转移酶固定化细胞(50克)备用。
② ATP再生菌种(嗜热脂肪芽孢杆菌)—活化培养—转化生产FDP —FDP 转化培养液(56mgFDP/ml、菌体含量为1.5%)备用。
③ 将固定化细胞50克、FDP转化培养液10ml、底物50ml(谷氨酰胺 0.35mol/L、乙胺2.0mol/L)混合，调节pH值至10.5 —30°C、 180转/分培养48 小时转化生产茶氨酸—茶氨酸转化液(茶氨酸含量37mg/ml)。谷氨酰胺转化 成茶氨酸的转化率为60%。
④ 茶氨酸提取精制工艺:茶氨酸转化液预处理(pH3.0、 80。C加热、过滤得 到滤液)—732树脂吸附—氨水洗脱—减压浓缩洗脱液至(120mg茶氨^/ml) —2倍95%乙醇结晶(4°C)—真空千燥—茶氨酸成品。提取总收率为62%。 实施例2
① 将产酶菌种地衣芽孢杆菌接种斜面3(TC培养48小时，移种种子培养 (30ml/瓶)30°C、 250转/分培养24小时，接种发酵培养(30ml/瓶)30°C 、 250
转/分培养24小时获得产酶发酵液，发酵液1000ml—4000转/分、15分钟，得 到菌体10克(Y -谷氨酰基转移酶活性8u/ml)备用。
② ATP再生菌种(嗜热脂肪芽孢杆菌)—活化培养—转化生产FDP — FDP转化培养液(53mgFDP/ml、菌体含量为1.5%)备用。
③ 将菌体细胞10克、FDP转化培养液lOrnl、底物50ml(谷氨酰胺 0.35mol/L、乙胺2.0mol/L)混合，调节pH值至10.5 —30°C、 180转/分培养48 小时转化生产茶氨酸—茶氨酸转化液(茶氨酸含量39mg/ml)。谷氨酰胺转化 成茶氨酸的转化率为64%。
④ 茶氨酸提取精制工艺:茶氨酸转化液预处理(pH3.0、 80。C加热、过滤得 到滤液)—732树脂吸附—氨水洗脱—减压浓缩洗脱液至(125mg茶氨^7ml) —2倍
95%乙醇结晶(4°C)—真空干燥—茶氨酸成品。提取总收率为60%。 实施例3
① 将产酶菌种地衣芽孢杆菌接种斜面30。C培养48小时，移种种子培养 (30ml/瓶)30°C、 250转/分培养24小时，接种发酵培养(30ml/瓶)30°C 、 250
转/分培养24小时获得产酶发酵液(Y -谷氨酰基转移酶活性2u/ml)备用。
② ATP再生菌种(嗜热脂肪芽孢杆菌)—活化培养—转化生产FDP —FDP 转化培养液(53mgFDP/ml、菌体含量为1.5°/。)备用。
③ 将产酶发酵液20ml、 FDP转化培养液10ml、底物50ml(谷氨酰胺 0.35mol/L、乙胺2.0mol/L)混合，调节pH值至10.5 —30°C、 180转/分培养48 小时转化生产茶氨酸—茶氨酸转化液(茶氨酸含量35mg/ml)。谷氨酰胺转化 成茶氨酸的转化率为56%。
④ 茶氨酸提取精制工艺:茶氨酸转化液预处理(pH3.0、 80。C加热、过滤得 到滤液)—732树脂吸附—氨水洗脱—减压浓缩洗脱液至(123mg茶氨^/ml) —2倍
95%乙醇结晶(4°C)—真空干燥—茶氨酸成品。拔-又总收率为30%。
权利要求
1. 一种利用种间耦合ATP再生技术制备茶氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤(1)以地衣芽孢杆菌作为生产γ-谷氨酰基转移酶的产酶菌种制备γ-谷氨酰基转移酶固定化细胞；以嗜热脂肪芽孢杆菌作为ATP再生菌种制备1、6-二磷酸果糖转化培养液；(2)将γ-谷氨酰基转移酶固定化细胞、1、6-二磷酸果糖转化培养液和底物混合，以1、6-二磷酸果糖为能量供体促进ATP再生经转化制得茶氨酸转化液；所述底物是谷氨酰胺或谷氨酸和乙胺的混合物；(3)茶氨酸转化液经提取、精制得到茶氨酸。
2.如权利要求1所述的制备茶氨酸的方法，其特征在于步骤(1)所述以 嗜热脂肪芽孢杆菌作为ATP再生菌种制备1、 6-二磷酸果糖转化培养液是以嗜 热脂肪芽孢杆菌利用含有蔗糖、无机磷酸盐的营养基质生产供能体1、 6-二磷 酸果糖，制备成l、 6-二磷酸果糖转化培养液。
全文摘要
本发明公开了一种种间耦合ATP再生技术制备茶氨酸的方法，包括以下步骤以地衣芽孢杆菌制备γ-谷氨酰基转移酶固定化细胞；以嗜热脂肪芽孢杆菌制备1、6-二磷酸果糖转化培养液；将γ-谷氨酰基转移酶固定化细胞、1、6-二磷酸果糖转化培养液、底物混合制备转化制得茶氨酸转化液；所述底物为谷氨酰胺(或谷氨酸)和乙胺；茶氨酸转化液经提取、精制得到茶氨酸。本发明提供的技术方案是一种全新的、以ATP再生技术和酶转化反应技术相耦合制备茶氨酸的技术方案。是一项能够促进需消耗ATP的酶反应顺利进行的技术，也是一项适合微生物转化法生产茶氨酸的技术。在食品、医疗、酶工程领域具有十分广阔的应用前景。
文档编号C12P13/04GK101457241SQ20091003641
公开日2009年6月17日 申请日期2009年1月4日 优先权日2009年1月4日
发明者傅锦坚, 刘冬英, 孟佩佩, 张文军, 胡立勇, 邓祖军 申请人:广东药学院