专利名称：棉花染色体分离方法
技术领域：
本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及棉花染色体分离方法。
背景技术：
分子标记育种是农作物改良的重要技术之一。对重要的农作物建立高密度的分子 标记图谱是实现农艺性状分子标记和利用定位克隆技术分离有用基因的先决条件。目前已 构建的许多农作物分子标记连锁图谱是从整体基因组入手，通过各种分子标记所作的基因 图谱，其工作量大，且图谱难以做得精细，如从单条染色体或染色体的片段入手，既可大大 提高工作效率，又有助于提高各种作物遗传图谱和物理图谱的精细程度。1981年，Scaleghe 等创立的染色体微切割、微克隆技术为此提供了有力的手段。 染色体微切割、微克隆技术主要是通过采用微细玻璃针或激光，在倒置显微镜下 对目的基因所在的染色体或染色体区段进行切割与分离，通过聚合酶链式反应(PCR)得到 扩增产物，将产物插入到载体上，以构建染色体或染色体区段特异性的DNA文库。通过对文 库的筛选，分离出染色体或染色体区段特异性的DNA位点标记(STS) 、 DNA多态性片段和相 关基因，再用染色体步行法分离得到目的基因。该技术优点是能根据需要分离任意一条染 色体或特定染色体片段，建立相应的DNA文库，从中筛选出与目的基因紧密连锁的分子标 记。 早期的微切割是对未显带染色体进行切割，有些植物的一些染色体容易辨认。例 如处于某些特殊时期的染色体、小麦带有随体的染色体等。Vega(1994)等用此方法成功切 割了小麦单体附加系中减数分裂中呈单价体状态的染色体。Houben(1996)等微切割了黑 麦染色体组中带有的B染色体。该方法的优点是对染色体没有损伤，所建立的染色体DNA 文库完整。其不足是只能在一些易于辨认的染色体上进行，使其应用受到局限。染色体分 带技术的应用使细胞中染色体的辨认易于进行，在植物中通常采用C分带及N分带来辨认 染色体，这就使得该技术的应用对任何植物的任一染色体的任一区段的切割成为可能，大 大扩展了其应用范围。其缺点是染色体分带容易对染色体DNA造成损伤，使建立的该区段 DNA文库的完整性及准确性受到一定的影响。 显微激光切割法的特点是染色体标本在底部贴有特殊薄膜的培养皿上制作，借助 激光共聚焦扫描显微镜，利用激光所产生的高温"烧掉"目标染色体周围的染色体，接着再 "烧掉"目标染色体片段以外的其他染色体片段，然后用含有能消化染色体蛋白质的蛋白酶 K的收集液，收集被切割的片段备用。该方法可自动控制，因而具有操作简便、容易掌握等优 点。 分离到的染色体片段必须经过体外扩增才能满足一系列分子生物学研究的需要。 LA-PCR是Sa皿der等发展的效率更高的微克隆方法，即将分离的染色体DNA用限制性内切 酶(如Sau 3AI)进行消化，根据酶切后产生的粘性末端的碱基序列，分别设计1个连接子
(Linker, 24mer的寡核苷酸，其5'端磷酸化)和1个衔接子(Ad即tor， 20mer的寡核苷酸， 其5'端非磷酸化)，并使二者混合后产生与某一内切酶同样的粘性末端。由于粘性末端不受限制，当酶切后的染色体DNA与连接子衔接子混合后，可大大提高连接效率。再用其中的 连接子作PCR扩增的引物，由于每个酶切产物都连接1个已知的连接子(弓l物)，这样就可 扩增任一未知DNA片段，在PCR反应前无需分离程序，所构建的染色体区带特异性文库不仅 减少分离等步骤，避免可能产生的污染，而且由于DNA丢失少而大大提高文库的完整性。
染色体描绘是研究染色体重组、畸变机制及进化的一个强有力手段，染色体微切 割、微克隆则为其提供了丰富的探针源泉。总之，染色体微切割、微分离技术对于构建高密 度遗传图谱、筛选与目的基因紧密连锁的分于标记并进一步分离该基因及生物进化等方面 的研究起着重要作用，并显示其广阔的应用前景。相信随着分子生物学的发展，该技术也将 会得到不断完善和发展，在生命科学的研究中必将发挥更大的作用。 然而棉花染色体小而形态相近，且棉花组织富含棉酚、单宁和萜烯类等次生代谢 物质。截止目前，既没有棉花染色体显微分离方面的的报道，更没有棉花单染色体文库建立 方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供棉花染色体分离方法。 本发明的另一 目的在于提供一种构建棉花染色体DNA库的方法。 根据本发明的方法包括以下步骤 1)取材及预处理，取种子在温水中浸泡6 12h，然后暗培养，待根长至1 2cm 时，截取根尖以放线菌酮处理，将预处理过的根尖置于卡诺固定液中固定； 2)前低渗，用滴管缓缓滴加无菌双蒸水小心冲洗固定过的根尖，在4t:蒸馏水中 前低渗15 20min ; 3)酶解，切取前低渗过的根尖2 3mm于混合酶解液中37。C酶解，所述混合酶解 液含4X的纤维素酶、优选纤维素酶0nazuka R-10和1 %的果胶酶、优选果胶酶Pectolyase Y-23，以75mmol/L KC1和7. 5mmol/L EDTA缓冲液配制，pH4. O，过滤除菌;
4)后低渗，用吸管小心吸除酶解液后，用滴管缓缓滴加无菌双蒸水小心冲洗根尖 2次后，4。C蒸馏水中后低渗15 20min ; 5)染色及压片，将后低渗过的根尖移置于盖玻片上，去除根冠保留生长区，滴加 10 iU卡宝品红染色5min，轻轻捣碎后反转覆于固定于支架上的膜载片上，轻压即可，立即 放于-2(TC中保存； 6)揭盖片，取出-201:保存的制片，稍停后直接揭盖片，601:烘烤膜载片lh，立即 使用或者4t:保存备用； 7)在Cell Cut Plus激光显微切割仪上切割收集目标染色体，具体方法是将制备 好的染色体标本放到Cell Cut Plus激光显微切割仪载物台上，在低倍镜下找到目标染色 体，然后转至40倍或100倍镜下进行切割； 8)切割后的染色体用黏性的E卯endorf管盖粘附收集，然后加入含10 y L50ng/ PL蛋白酶K溶液(1XT4DNA连接酶缓冲液配制)的0. 2mL黏性Eppendorf管中，高速离心 数秒钟，-2(TC存放备用。 根据本发明的棉花单染色体扩增池，其通过以下方法制备 1)取材及预处理，取种子在温水中浸泡6 12h，然后暗培养，待根长至1 2cm时，截取根尖以放线菌酮处理，将预处理过的根尖置于卡诺固定液中固定； 2)前低渗，用滴管缓缓滴加无菌双蒸水小心冲洗固定过的根尖，在4t:蒸馏水中
前低渗15 20min ; 3)酶解，切取前低渗过的根尖2 3mm于混合酶解液中37°C酶解，所述混合酶解 液含4X的纤维素酶、优选纤维素酶0nazuka R-10和1 %的果胶酶、优选果胶酶Pectolyase Y-23，以75mmol/L KC1和7. 5mmol/L EDTA缓冲液配制，pH4. O，过滤除菌;
4)后低渗，用吸管小心吸除酶解液后，用滴管缓缓滴加无菌双蒸水小心冲洗根尖 2次后，4。C蒸馏水中后低渗15 20min ; 5)染色及压片，将后低渗过的根尖移置于盖玻片上，去除根冠保留生长区，滴加 10 ii L卡宝品红染色5min，轻轻捣碎后反转覆于固定于支架上的膜载片上，轻压即可，立即 放于-2(TC中保存； 6)揭盖片，取出-201:保存的制片，稍停后直接揭盖片，601:烘烤膜载片lh，立即 使用或者4t:保存备用； 7)在Cell Cut Plus激光显微切割仪上切割收集目标染色体，具体方法是将制备 好的染色体标本放到Cell Cut Plus激光显微切割仪载物台上，在低倍镜下找到目标染色 体，然后转至40倍或100倍镜下进行切割； 8)切割后的染色体用黏性的E卯endorf管盖粘附收集，然后加入含10 y L50ng/ PL蛋白酶K溶液(1XT4DNA连接酶缓冲液配制)的0. 2mL黏性Eppendorf管中，高速离心 数秒钟，_201:存放备用； 9)采用Sau 3A连接接头PCR (Linker-adaptor PCR， LA-PCR)的方法扩增微分离 得到的染色体，Sau 3A接头是由23碱基和19碱基的两个寡核苷酸片段形成，23碱基的寡 核苷酸碱基序列为5' -6八1^0^^60^^八1"1^^(1:(:-3'，19碱基的寡核苷酸碱基序列为 5' -GGGTCGAATTCG AGCTCAG-3'，接头的制备、染色体片段的蛋白酶K消化、接头连接及两轮 PCR扩增反应参照Albani (1993)和Chen (1995)的方法进行并略加改动，为了避免外源DNA 的污染，整个单染色体体外扩增操作过程均在无菌条件下进行，并设立严格的不含染色体 DNA的阴性对照和以10pg基因组DNA为模板的阳性对照，PCR扩增进行两轮，从而获得棉花 单染色体扩增池。 根据本发明的方法采用前低渗、酶解、后低渗和压片法结合进行染色体膜制片的 准备，细胞壁完全去除干净，染色体经轻压后分散良好，形态清晰，利于目标染色体的识别。
在Cell Cut Plus激光显微切割仪下进行目标染色体的切割收集，减少了人工挑 取染色体的繁琐程序和大的劳动强度，也避免了外源DNA的污染，方便快捷地获得目标染 色体。 去蛋白和内切酶酶切后进行LA-PCR扩增，可以去除染色体上的蛋白质以释放DNA 双链，在Sau3AI内切酶的作用下形成粘末端，与人工合成的接头连接进行随机扩增，可以 得到有较大DNA片段的单染色体扩增池。 为了验证所得单染色体探针池的来源和目标，以Southern Blotting和FISH进行 验证。 本发明的方法首次在棉花中解决了染色体膜载片的制备、染色体激光切割、单染 色体扩增池的获得和来源及目标验证。
本发明方法所制备的单染色体扩增池可用于棉花单染色体文库的构建、专化序列 的克隆、RFLP分子标记作图、重要基因定位和分离等研究。
图1是亚洲棉石系亚1号中期分裂相(A)及其核型图(B); 图2是亚洲棉石系亚1号的单染色体显微分离过程(箭头示5号染色体)； 图3是亚洲棉石系亚1号的第5号单染色体的LA-PCR扩增； 图4是亚洲棉石系亚1号的第5号单染色体第2次LA-PCR扩增产物的Southern
杂交检测； 图5是荧光原位杂交结果。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明
本发明，而不能限制本发明的保护范围。 实施例1棉花第5号染色体显微分离技术 1材料和方法 1. 1实验材料 实验材料是二倍体的亚洲棉品种石系亚1号，来自于中国农业科学院棉花研究 所。实验试剂纤维素酶0nazuka R-10和果胶酶Pectolyase Y-23购自Solarbio， Southern 试剂盒购自Boehringer Mannheim公司，地高辛探针标记试剂盒购自Roche公司，纯化回收 Kit购自上海生工公司，T-EasyVector购自Promega公司，PET膜载片和E卯endorf黏性收 集管购自基因有限公司，其他均为国产分析纯试剂。
1. 2染色体标本制备 1. 2. 1取材及预处理。取种子在温水中浸泡6 12h，然后置于消毒过的湿沙中 3(TC暗培养，待根长至1 2cm时，截取根尖于2. 5X10—5g L_l的放线菌酮中，2(TC处理lh 30min。将预处理过的根尖置于卡诺固定液中固定10min后，立即移入70X乙醇中于4t:保 存待用。 1. 2. 2前低渗。用滴管缓缓滴加无菌双蒸水小心冲洗固定过的根尖2次后，4t:蒸 馏水中前低渗15 20min。 1. 2. 3酶解。切取前低渗过的根尖2 3mm于混合酶解液中(含4%的纤维素酶 0nazukaR-10和lX的果胶酶Pectolyase Y_23， 75mmol/L KC1和7. 5mmol/L EDTA缓冲液 配制，pH4. 0，过滤除菌)，37。C酶解45min。 1. 2. 4后低渗。用吸管小心吸除酶解液后，用滴管缓缓滴加无菌双蒸水小心冲洗根 尖2次后，4t:蒸馏水中后低渗15 20min。 1. 2. 5染色及压片。将后低渗过的根尖移置于盖玻片上，去除根冠保留生长区，滴 加10 ii L卡宝品红染色5min，轻轻捣碎后反转覆于固定于支架上的膜载片上，轻压即可，立 即放于-2(TC中保存。 1. 2. 6揭盖片。取出-20°〇保存的制片，稍停后直接揭盖片，601:烘烤膜载片lh，立
即使用或者4t:保存备用。
1. 3染色体的显微分离 将制备好的染色体标本放到Cell Cut Plus激光显微切割仪载物台上，在低倍 镜下找到目标染色体，然后转至40倍或IOO倍镜下进行切割。切割后的染色体用黏性的 E卯endorf管盖粘附收集，然后加入含10 y L 50ng y L—1蛋白酶K溶液(1XT4DNA连接酶缓 冲液配制，用于LA-PCR)的0. 2mL黏性E卯endorf管中，高速离心数秒钟，-2(TC存放备用。
1. 4Sau 3A接头的制备及染色体片段的体外扩增 采用Sau 3A连接接头PCR(Linker-adaptor PCR， LA-PCR)的方法扩增微分离得 到的染色体，Sau 3A接头是由23碱基和19碱基的两个寡核苷酸片段形成。23碱基的寡 核苷酸碱基序列为5' -GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3' ， 19碱基的寡核苷酸碱基序列为 5' -GGGTCGAATTCG AGCTCAG-3'，均由上海生工公司合成。接头的制备、染色体片段的蛋白 酶K消化、接头连接及两轮PCR扩增反应参照Albani (1993)和Chen (1995)的方法进行并 略加改动。为了避免外源DNA的污染，整个单染色体体外扩增操作过程均在无菌条件下进 行，并设立严格的不含染色体DNA的阴性对照和以10pg基因组DNA为模板的阳性对照。
1. 4. ISau 3A人工接头的制备。 制备接头按照Albani (1993)和Chen (1995)方法进行，用稀释缓冲液(1XT4连接 酶缓冲液，20mmo1 L—^TP)将接头稀释至5ng yL—M寺用。 1. 4. 2蛋白酶K的解离。将上述含单条目标染色体的O. 2mLE卯ondorf管置于37。C 下2h，5(TC下2h，蛋白酶K充分消化去蛋白，然后置于75°CT 20min灭活蛋白酶K。
1. 4. 3单染色体体外扩增。在上述去蛋白处理的E卯endorf管中加入2ii LSau 3A， 37。C酶切染色体DNA 3h，70。C 20min使酶失活。加入制备好的接头2 y L(5ng y L—0 ， T4DNA 连接酶0. 5 ii L (3U ii L—0 ，连接反应最终体积为24. 5 ii L。 16。C连接过夜后，70°C 20min失活 连接酶。 PCR扩增分二轮进行。第一轮扩增在上述同一Eppendorf管中进行，除原先的反 应物外，再加入lOXTaq酶缓冲液10iiL，10mmo1 L—MNTPs 2 ii L， 19mer引物liiL(250ng ii L—0 ， Taq DNA聚合酶0. 5 y L(4U y L—0 ，紫外线照射过的超纯水补至体积100 y L，混匀， 覆盖一滴灭菌的石蜡油。然后94t:预变性5min ;进行94" lmin、5(TC 1. 5min、72°C 3min循 环35圈；最后72"延伸15min，4t:保温。 第二轮PCR扩增以第一轮扩增产物5 ii L为模板，其它反应成分不变；PCR反应程 序基本同上，只是将35个循环降至25个循环。 上述过程设两种严格对照阳性对照加入约10pg基因组DNA为初始底物，阴性对 照中不加任何底物，其它所有操作过程同上。
1. 5Southern杂交分析 亚洲棉石系亚1号基因组DNA的提取和纯化按照宋国立等的方法。取适量的基因 组DNA(l 3ii g)用Eco RI于37。C酶切过夜，然后与棉花第5染色体的第2轮LA-PCR扩 增产物一起，在8g L—4京脂糖凝胶上电泳。之后，按照奥斯伯等的方法自上向下毛细管转移 法进行转膜。紫外交联后，用Eco RI酶切并经Dig标记的石系亚l号棉花基因组DNA为探 针进行Southern杂交。具体过程参考Dig DNA Labeling andDetection Kit (Boehringer Mannheim)说明。
1. 6荧光原位杂交分析
通过随机引物法用DIG(Digoxigenin-dUTP， Roche)标记第2轮LA-PCR产物作为 探针，在石系亚1号根尖有丝分裂中期染色体标本上进行原位杂交。杂交过程及杂交后的 信号检测按Zhang(2005)和王春英等(1999)的方法进行。
2试验结果 2. 1采用酶解、低渗和压片相结合的制片方法，获得了在膜载片上分散较好的中期 染色体分裂相(图l)。以Cell Cut Plus激光显微切割仪分离染色体，成功地获取了若干 条第5染色体，以单染色体形式保存于Eppendorf管中(图2)。 2. 2亚洲棉石系亚1号的第5号单染色体DNA经第一轮LA-PCR扩增后，电泳检测显 示不太明显的连续扩增带型，如图3A中所示的第2、3泳道，DNA片段长度为400 1800bp。 经第二轮LA-PCR扩增后，电泳检测显示明显的连续扩增带型，如图3B中所示的第2、3泳 道，DNA片段长度为300 2500bp，另外设立了不加任何DNA的阴性对照和lOpg基因组DNA 的阳性对照，如图3A、3B所示第1泳道为阴性对照，没有发现扩增产物，说明没有外源DNA 的污染，如图3A、3B所示第4泳道为阳性对照，亦能扩增出类似的DNA，扩增产物带略宽一 胜。 2. 3Southern杂交结果(图4)显示，目标染色体的扩增产物(第2、3泳道)与lOpg 基因组DNA的扩增产物(第4泳道)和基因组DNA的酶切的谱带(第5泳道) 一样均出现 明显的杂交信号，而阴性对照(第1泳道)没有信号，说明单染色体的扩增产物确实来自棉 花基因组。 2. 4用地高辛标记第2次LA-PCR产物做探针，在石系亚1号有丝分裂中期染色体 标本上进行荧光原位杂交，如图5所示，荧光信号较集中的分布于第5号染色体，初步证实 扩增产物来自被分离的染色体，而不是来自基因组的其他染色体。同时，在其他部分染色体 上也有较微弱。
权利要求
棉花染色体分离方法，其特征在于，包括以下步骤1)取材及预处理，取种子在温水中浸泡6～12h，然后暗培养，待根长至1～2cm时，截取根尖以放线菌酮处理，将预处理过的根尖置于卡诺固定液中固定；2)前低渗，滴加无菌双蒸水冲洗固定过的根尖，在4℃蒸馏水中前低渗15～20min；3)酶解，切取前低渗过的根尖2～3mm于混合酶解液中酶解，所述混合酶解液含4％的纤维素酶、和1％的果胶酶；4)后低渗，吸除酶解液，滴加无菌双蒸水冲洗根尖，4℃蒸馏水中后低渗15～20min；5)染色及压片；6)揭盖片；7)染色体的显微分离，找到目标染色体，然后进行切割；8)收集染色体。
2. 根据权利要求l的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述纤维素酶为纤维素酶 Onazuka R-IO。
3. 根据权利要求1的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述果胶酶为果胶酶Pectolyase Y-23。
4. 一种棉花单染色体扩增池，其特征在于，所述棉花单染色体扩增池通过以下方法制备1) 取材及预处理，取种子在温水中浸泡6 12h，然后暗培养，待根长至1 2cm时，截 取根尖以放线菌酮处理，将预处理过的根尖置于卡诺固定液中固定；2) 前低渗，滴加无菌双蒸水冲洗固定过的根尖，在fC蒸馏水中前低渗15 20min ;3) 酶解，切取前低渗过的根尖2 3mm于混合酶解液中酶解，所述混合酶解液含4%的 纤维素酶、和1%的果胶酶；4) 后低渗，吸除酶解液，滴加无菌双蒸水冲洗根尖，4t:蒸馏水中后低渗15 20min ;5) 染色及压片；6) 揭盖片;7) 染色体的显微分离，找到目标染色体，然后进行切割；8) 收集染色体；9) 采用Sau 3A连接接头PCR的方法扩增微分离得到的染色体，其中PCR扩增进行两 轮，从而获得棉花单染色体扩增池。
5. 根据权利要求4的方法，其特征在于，在步骤9)中，所述Sau 3A接头包括23bp和 19bp的两个寡核苷酸片段，所述23bp寡核苷酸序列为5'-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3'， 所述19bp寡核苷酸碱基序列为5' -GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3'。
6. 根据权利要求4的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述纤维素酶为纤维素酶 Onazuka R-IO。
7. 根据权利要求4的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述果胶酶为果胶酶Pectolyase Y-23。
全文摘要
本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及棉花染色体分离方法，所述方法包括以下步骤取材及预处理、前低渗、酶解、后低渗、染色及压片、揭盖片、染色体的显微分离以及收集染色体。根据本发明的方法采用前低渗、酶解、后低渗和压片法结合进行染色体膜制片的准备，细胞壁完全去除干净，染色体经轻压后分散良好，形态清晰，利于目标染色体的识别。
文档编号C12P19/00GK101724624SQ20091008330
公开日2010年6月9日 申请日期2009年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者刘方, 宋国立, 张香娣, 彭仁海, 王为, 王坤波, 王春英, 王玉红, 黎绍惠 申请人:中国农业科学院棉花研究所