作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的吡啶和嘧啶衍生物的制作方法

专利名称：：作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的吡啶和嘧啶衍生物的制作方法作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的吡啶和嘧啶衍生物本发明涉及具有组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制酶活性的化合物。还涉及它们的制备、含有它们的组合物以及它们在体外和体内抑制HDAC的用途和作为药物的用途，例如用作抑制例如癌症和牛皮痺的增殖病症的药物。已知细胞核组蛋白是负责调节基因转录和其它DNA模制过程(例如复制、修复、重组和染色体分离)的组织的整合和动力成分。其用于转译后的修饰，包括乙酰化、磷酸化、曱基化、遍在蛋白化和ADP-核糖基化。组蛋白脱乙酰基酶在此称为"HDAC",是催化除去蛋白质赖氨酸残基上的乙酰基修饰的酶，包括核心核小体组蛋白H2A、H2B、H3和H4。HDAC与在此称为"HAT"的组蛋白转乙酰酶一起调节组蛋白乙酰化的水平。核小体组蛋白乙酰化的平衡在许多基因的转录中起重要作用。组蛋白的低乙酰化与凝聚染色质结构有关，导致基因转录的抑制，而乙酰化的组蛋白与更多开放的染色质结构和转录的活化有关。已知十一种结构上相关的HDAC,并将其分为两类。I类HDAC由HADC1、2、3、8和11组成，而II类HADC由HDAC4、5、6、7、9和10组成。第三类HDAC在结构上与I类和II类HDAC不相关。I/II类HDAC按照锌-依赖的机理起作用，而III类HDAC是NAD-依赖的。除组蛋白之外，其它的蛋白质也是乙酰化的底物，特别是转录因子，例如p53、GATA-1和E2F;核受体，例如糖皮质激素受体、甲状腺受体、雌激素受体；和细胞-周期调节蛋白质，例如pRb。乙酰化的蛋白质已经与蛋白质稳定相联，如p53稳定、辅因子的补充和增强的DNA结合。p53是肿瘤抑制基因，可根据许多应力信号(例如DNA损伤)诱导细胞周期停滞或细胞程序死亡。对于p53诱导的细胞周期停滞，主要的靶标似乎是p21基因。除了被p53活化，已经通过p21与细胞周期蛋白/依赖细胞周期蛋白的激酶配合物的结合证明其导致细胞周期停滞在G1和G2相，在衰老期间向上调节，以及与增殖细胞核抗原相互作用。HDAC抑制剂的研究指出其在细胞周期停滞、细胞分化、细胞程序死亡和转化的显型的反转中起重要作用。例如，抑制剂TrichostatinA(TSA)导致细胞周期停滞在Gl和G2相、恢复不同细l包系的转化的显型和诱导Friend白血病细胞的分4b等。已经报道了TSA(和辛二酰基苯胺异羟肟酸SAHA)抑制细胞生长、诱导终末分化和阻止小鼠体内肿瘤的形成(Finninetal.,Nature,401:188-193，1999)。还报道了TrichostatinA用于纤维化的治疗，例如肝脏纤维4^和肝硬:化(Geertsetal.,欧洲专利申请EP0827742,1998年3月11日7>开)。HDAC抑制剂的药效基团由与HDAC的含锌活性位点相互作用的金属结合区、连接区和与活性点边缘上的残基相互作用的表面识別区或封端区组成。还报道过HDAC的抑制剂诱导p21基因表达。通过染色质重制，然后乙酰化在p21启动子区域中的组蛋白H3和H4，促进了借助这些抑制剂的p21基因转录激活。这种p21的活化以不依赖p53的方式发生，因此HDAC抑制剂在具有突变的p53基因的细胞中起作用，突变的p53基因是许多肿瘤的^^险标记。此外，HDAC抑制剂可以具有间接的活性，例如增加宿主的免疫应答和抑制肺瘤的血管生成，因此可以抑制原发肿瘤的生长和阻碍转移(Maietal.,MedicinalResearchReviews,25:261-309,2005)。鉴于如上所述，HDAC抑制剂在细胞增殖疾病或病症(包4舌具有突变p53基因的肿瘤)的治疗中可能具有巨大的潜能。2003年8月14日公开的专利申请EP1472216公开了作为組蛋白脱乙酰基酶抑制剂的双环异鞋月亏酸盐(bicyclichydroxamate)。此外，在2003年9月18日公开的专利中请EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370、EP1485378中公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的取代的哌溱基嘧啶基异羟肟酸类，而EP1485365乂>开了R306465。在2003年10月9日公开的专利申请EP1492534公开了作为HDAC抑制剂的含有哌。秦连接基团的氨基甲酸化合物。在2003年10月23日公开的专利申请EP1495002公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的取代的哌。秦基苯基苯曱酰胺化合物。2003年11月13日公开的专利申请EP1501508公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的苯酰胺类。2004年1月29日公开的专利申请WO04/009536公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的衍生物，在芳基基团和异羟肟酸之间含有烷基连接基。2004年2月12日公开的专利申请EP1525199公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的(杂)芳基烯基取代的双环异羟肟酸类。2004年6月24日公开的专利申请EP1572626公开了作为药理学试剂的亚芳基羧酸(2-氨基-苯基)-酰胺衍生物。2004年7月29日公开的专利申请EP1581484公开了具有抗炎和抗胂瘤活性的N-羟基-苯甲酰胺衍生物。2004年7月29日公开的专利申请EP1585735公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的取代芳基异羟肟酸盐衍生物。2004年8月19日公开的专利申请EP1592667公开了作为药理学试剂的单-酰化的O-苯乙胺衍生物。2004年8月19日公开的专利申请EP1590340公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的二氨基次苯基衍生物。2004年8月26日公开的专利申请EP1592665公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的苯曱酰胺衍生物。2004年8月26日公开的专利申请WO04/072047公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的吲咮类、苯并咪唑类和萘并咪唑类。2004年9月30日公开的专利申请EP1608628公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的非芳香杂环系统连接的异羟肟酸盐。2004年10月14日/:开的专利申请EP1613622^A开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的將衍生物。2004年10月28日/厶开的专利申请EP1611088^^开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的异鞋將酸盐衍生物。脱乙酰基酶抑制剂的苯并咪唑类。2005年4月7日公开的专利申请WO05/030704和W005/030705公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的苯甲酰胺类。2005年5月6日公开了专利申请WO05/040101公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的酰基脲连接的和磺酰脲连接的异羟將酸类。2005年5月6日公开的专利申请WO05/040161公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的联芳基连接的异羟酸类。2005年8月18日公开的专利申请WO05/075469公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的p塞唑基异羟肟酸类和噻二唑基异羟肟酸类。2005年9月22日公开的专利申请WO05/086898公开了作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的杂戊环异羟肟酸类。2005年10月6日公开的专利申请WO05/092899公开了作为组蛋白脱乙酰基酶烯基苯酰胺类。本发明的化合物在结构上、药理学活性和/或药理学效价方面与先有技术不同。要解决的问题是提供具有高酶催化活性和细胞活性的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，其具有提高的生物利用度和/或体内效价。本发明的新化合物解决了上述问题。本发明的化合物显示了优良的抑制酶和细胞活性的组蛋白脱乙酰基酶。它们对活化p21基因具有很高的能力。它们具有所希望的药物代谢动力学分布图和对P450酶的低亲合性，这降低了药物-药物相互作用的风险，并具有较宽的安全界限。本发明化合物的有利性质可以是代谢稳定性、溶解性和/或p21诱导性能。本发明涉及式(I)化合物其N-氧化物形式、药学可接受的加成盐和立体化学异构形式，其中n是O或l,并且当n是0时，表示直接4建；p是O或l,条件是当p是O时n是O,-(CH2)n-(NR3)p-是直接键并且Y是N;各X独立地是N或CH;各Y独立地是O、N、NH、CH或CH2，并且当Y是N或CH时所述的取代基连接到所述环结构的所述Y原子；R"是羟基或式(a-l)的基团其中R"是羟基或-NH2;RS是氢、噻吩基、呋喃基或苯基，并且各噻吩基、呋喃基或苯基可任选被以下基团取代卣代、氨基、硝基、氰基、羟基、苯基、Cw烷基、(二Cw烷基)氨基、Cw烷基氧基、苯基d-6烷基氧基、羟基Cw烷基、Cw烷基氧基羰基、羟基羰基、d-6烷基羰基、多卣代d-6烷基氧基、多卤代Cw烷基、d-6烷基磺酰基、羟基羰基d-6烷基、Cw烷基羰基氨基、氨基磺酰基、氨基磺酰基Cw烷基、异"恶唑基、氨基羰基、苯基C2-6烯基、苯基C3-6炔基或吡啶基C3_6炔基；R6、R7和R8各自独立地是氢、-NH2、硝基、呋喃基、卣代、d-6烷基、CL6烷基氧基、三氟曱基、噻吩基、苯基、d—6烷基羰基氨基、氨基羰基d-6烷基或-OC-CH2-R^其中W是氢、d—6烷基、羟基、氨基或d-6烷基氧基；R2是CH20H、CH2CH(OH)-CH20H、CH2OCH3或CH2OCH2CH3;W是氢、Cw烷基、Cw环烷基、Cw烷基羰基或CL6烷基磺酰基；和Z是下式的基团<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(b-l)(b-2)(b-3)(b-4)(b-6)(b-7)其中R"是氬、d-6烷基、C3.7环烷基或苯基磺酰基；和R"是氢、羟基、氨基、卤代、Cw烷基、多卤代d-6烷基、Cw烷基羰基、羟基羰基、d-6烷基羰基氨基、氰基、d-6烷氧基或者单-或二(Ci-6烷基)氨基。从取代基画到所述的二环环系统的线表示该键可以连接到该二环环系统的任何适宜的环原子。术语"组蛋白脱乙酰基酶抑制剂"或"组蛋白脱乙酰基酶的抑制剂"用来表示能够与组蛋白脱乙酰基酶相互作用并抑制其活性，更具体地讲是抑制其酶活性的化合物。抑制组蛋白脱乙酰基酶酶活性意味着降低组蛋白脱乙酰基酶从组蛋白除去乙酰基的能力。优选的，此抑制是特定的，即，所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂在一定浓度下降低组蛋白脱乙酰基酶从组蛋白除去乙酰基的能力，所述的浓度低于该抑制剂产生其它不相关生物步丈应的浓度。在上述定义和在下文中所用的囟代是一般指氟代、氯代、溴代和碘代；CL6烷基是指直链或支链的饱和烃基团，其具有1至6个碳原子，例如曱基、乙基、丙基、丁基、l-甲基乙基、2-甲基丙基、戊基、2-曱基-丁基、己基、2-曱基戊基等；(:2-6烯基表示含一个双键的直链和支链的烃基团并具有2到6个碳原子，例如例如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-曱基-2-丁烯基等；C3-6炔基是指含一个三键的直链和支链烃基并具有3到6个碳原子，例如例如2-丙炔基、3-丁炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、3-己炔基等；多卤代d-6烷基表示含有三个相同或不同卣代取代基，例如三氟甲基；以及(:3-7环烷基包括具有3到6个碳的环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基等。药学可接受的加成盐包括药学可接受的酸加成盐和药学可4妻受的碱加成盐。在上文提到的药学可接受的酸加成盐是指包括式(I)化合物能形成的治疗活性的无毒的酸加成盐形式。具有碱性的式(I)化合物可以通过将所述碱形式用合适的酸处理转化为它们的药学可接受的酸加成盐。合适的酸包4舌例如无才几酸，如氢卣酸，例如盐酸或氢溴酸；；琉酸；硝酸；4,酸等酸；或有冲几酸，例如乙酸、三氟醋酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即，丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、曱烷磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、对曱苯磺酸、环拉酸、水杨酸、对氨基水杨酸、朴酸等酸。具有酸性的式(I)化合物通过将所述酸形式用合适的有机或无机碱处理可转化为它们药学可接受的碱加成盐。合适的碱盐形式包括例如铵盐、碱金属盐和碱土碱金属盐(例如锂盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐等)、与有机碱形成的盐(例如千星青霉素盐、N-曱基-D-葡萄糖胺盐、海巴胺盐(hydrabaminesalts))以及与例如精氨酸、赖氨酸等氨基酸形成的盐。术语"酸或碱加成盐"还包括式(I)化合物能形成的水合物和溶剂加成形式。这类形式的实例例如是水合物、醇化物等。这里使用的术语"式(I)化合物的立体化学异构形式"定义为所有式(I)化合物可能具有的、由相同原子以相同键序组成但是具有不同的不可互换的三维结构的可能的化合物。除非另作说明或指示，化合物的化学命名包括所述化合物可能具有的所有可能的立体化学异构形式的混合物。所述混合物可能含所述化合物基本分子结构的所有非对应异构体和/或对映异构体。式(I)化合物的所有立体化学异构形式的纯净形式或彼此混合形式均包括在本发明的范围内。式(I)化合物的N-氧化物形式包括那些式(I)化合物，其中一个或多个氮原子被氧化成所谓的N-氧化物，特別是其中哌啶基、哌嗪基或哒。秦基的一个或多个氮被氧化的那些N-氧化物。一些式(I)化合物可能还以其互变异构形式存在。尽管这类形式未在上式中明确指出，但是也包括在本发明范围内。在下文中无论何时使用，术语"式(I)化合物"还包括药学可接受的加成盐和所有的立体异构形成。这里使用的术语"组蛋白脱乙酰基酶，，和"HDAC，，用于表示从在组蛋白N-末端的赖氨酸残基的s-氨基除去乙酰基的一系列酶的任何一种。除非上下文另有说明，术语"组蛋白"用于表示来自任何物种的任4可组蛋白蛋白质，包4舌H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。人HDAC蛋白质或基因产品非限制性地包括HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC画6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC國10和HDAC國11。所述组蛋白脱乙酰基酶还可来自原生动物或真菌来源。第一组感兴趣的化合物包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物a)各X是N;b)各Y是N或CH;c)W是羟基;d)R2是CH2OH或CH2CH(OH)-CH2OH，e)113是氢或C^烷基；f)R"是氳或苯基磺酰基；和g)Rn是氢。第二组感兴趣的化合物包括被下列条件限定的那些第一组化合物a)R^是苯基磺酰基；第三组感兴趣的化合物包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物或者上述组的那些化合物a)p是l;b)各Y独立地是O、CH或CH2;b)W是羟基；和c)R3是d—6烷基羰基或d.6烷基磺酰基。第四组感兴趣的化合物包括被下列一个或多个条件限定的那些式(I)化合物a)各X是N;b)各Y是N;c)R/是羟基;d)R2ACH2OH;e)R3是氲;f)A是式(b-3)或(b-6)的基团；和g)R"是氢。优选化合物的组包括那些式(I)化合物，其中，各X是N;各Y是N或CH;W是羟基；112是CH2OH、CH2CH(OH)-CH2OH;113是氬或Cw烷基；R"是氬或苯基磺酰基；和R"是氲。更优选化合物的组包括那些式(I)化合物，其中，各X是N;各Y是N;W是羟基；R2是CH20H;R3是氢；A式(b-3)或(b-6)的基团；和RU是氢。更优选化合物是化合物No.l和化合物No.2。0HO、人^&HU丄、人o丫、OH0HO、1^3^、OH,0,9C2HF30^1,14H20;化合物No,l0,86C2HF3O20.74H20;化合物No.2式(I)化合物、其药学可接受的盐以及其N-氧化物和立体化学异构形式可以以常规方式制备。起始物质和一些中间体是已知的化合物，并且是商业可得的，或者可以根据本领域公知的常规反应操作或发专利中请EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370和EP1485378中所述制备。一些制备方法将在下文更详细描述。获得最终式(I)化合物的其它方法描述于实施例。式(I)异羟肟酸(其中W是羟基，在此称为式(I-a)化合物)可以通过将式(II)中间体与适宜的酸例如三氟乙酸反应来制备。所述反应是在适宜的溶剂例如曱醇或二氯甲烷中进行的。(NR3)p(CMZ(n)CF3COOHHO、(I-a)式(I)化合物(其中W是式(a-1)的基团并且R^是-NH2，在此称为式(I-b)化合物)可以通过将式(III)中间体(其中M表示氢或钠或锂或碱金属阳离子例如钠)与式(XIV)中间体在适宜的试剂例如苯并三唑-l-基氧基三(吡咯烷并)磷镞六氟磷酸酯(PyBOP)存在下反应来制备。所述反应可在石成例如三乙胺存在下在适宜的溶剂例如二氯曱烷和四氲呋喃的混合物中进行。(III)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(XIV)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(I扁b)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式(I-b)化合物也可通过将式(IV)中间体与适宜的酸例如三氟乙酸反应来制备。所述反应在适宜的溶剂例如甲醇或二氯曱烷中反应。式(I)化合物(其中W是式(a-l)的基团并且W是羟基，在此称为式(I-c)化合物)可通过将式(V)中间体与氟化四丁基铵在适宜的溶剂例如四氬呋喃中反应来制备。式(V)中间体中的TBDMS表示叔丁基(二曱基)曱硅烷基。式(II)中间体可通过将式(III)中间体与与式(VII)中间体在适<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(V)宜的试剂例如N，-(乙基碳亚氨基)-N,N-二甲基-l，3-丙烷二胺一盐酸盐(EDC)和l-羟基-lH-苯并三唑(HOBT)存在下反应来制备。该反应可在碱例如三乙胺存在下在适宜的溶剂例如二氯甲烷和四氢^^喃的混合物中进4亍。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(III)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(VII)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(II)在另选的方法中，式(II)中间体(其中！^是-CH20H并且n和p均为0以及Y是N,在此称为式(II-a)中间体)可以以单个的步骤通过将式(VIII)中间体与1,4-二喁烷-2,5-二醇和适宜的式(IX)的硼酸在适合的溶剂例如醇如乙醇中反应来制备。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>(IX)式(II)中间体(其中RS是-CH20H-CH20H并且n和p均为0以及Y是N,在此称为式(II-b)中间体)可以以单个的步骤通过将式(VIII)中间体与式(XI)中间体和适宜的式(IX)的硼酸在适合的溶剂例如醇如乙醇中反应来制备。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(IX)式(IV)中间体可以通过将式(VI)中间体与适宜的叔丁氧基羰基(Boc)保护的式(XV)的苯胺在苯并三唑-l-基氧基三(二甲基氨基)磷镞六氟磷酸酯(BOP)和氢化钠存在下反应来制备。所述反应可在适宜的溶剂例如p比咬中进行。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(VI)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(xv)式(v)中间体可以通过将式(VI)中间体与适宜的叔丁基(二甲基)甲硅烷基(TBDMS)保护的式(XVI)的苯胺在苯并三唑-l-基氧基三(二曱基氨基)磷镞六氟磷酸酯(BOP)和三乙胺存在下反应来制备。所述反应可在适宜的溶剂例如N,N-二甲基曱酰胺中进行。(CH2)n/"飞式(VI)中间体可以通过将式(XVII)中间体与适宜的酸性溶液例如盐酸或石咸性溶液例如氬氧化4里或氲氧^i钠在适宜的溶剂例如醇如乙酸或丙醇或者二噹烷中反应来制备。Ci々烷基、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>(XVII)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>(VI)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>式(XVII)中间体(其中112是-012011并且p为1,在此称为式(XVn-a)中间体)可以以单个的步骤通过将式(XII)中间体与1,4-二噹烷-2,5-二醇和适宜的式(IX)的硼酸在适合的溶剂例如醇如乙醇中反应来制备。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>式(XVII)中间体(其中R2是-CH20H-CH20H并且p为1,在此称为式(xvn-b)中间体)可以以单个的步骤通过将式(XII)中间体与式(XI)中间体和适宜的式(IX)的硼酸在适合的溶剂例如醇如乙醇中反应来制备。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>(XVII-b)式(vin)中间体可以通过将式(xvin)中间体与p底p定在适宜的溶剂例如二氯曱烷在反应来制备。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(XVIII)中间体可通过将式(X)中间体与式(VII)中间体在适宜的试剂例如N，-(乙基碳亚氨基)-N,N-二甲基-l,3-丙烷二胺一盐酸盐(EDC)和l-羟基-lH-苯并三唑(HOBT)存在下反应来制备。该反应可在石咸例如三乙胺存在下在适宜的溶剂例如二氯甲*克和四氬吹喃的混合物中进4亍。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>式(X)中间体可以通过将式(XIX)中间体首先与氢氧化钠在适宜的溶剂例如四氬呋喃中反应，接着用盐酸中和，然后将所得酸与式(XX)中间体和碳酸钠反应来制备。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>式(XII)中间体(其中p是1并且定义如上文^f旦氬除外)可以通过将相应的式(XII)化合物(其中R"是氢)与适宜的用于引入所述适宜的R基团的官能团试剂反应来制备。例如当W是d—6烷基或Cw环烷基时，该试剂是适宜的烷基化试剂例如适宜的烷基卣化物如氯化物，该反应在碱性条件下例如使用三乙胺在适宜的溶剂例如二甲基甲酰胺中完成。当rs是CL6烷基磺酰基时，该试剂是适宜的磺酰化试剂例如磺酰基卣化物如氯化物，该反应在常规条件下完成。本发明还涉及式(II)、(Ha)、(II-b)、(VI)、(XVn)、(XVn曙a)和(XVII-b)的中间体(其涉及所有的这样的式(A)化合物，即，其中Q是羟基羰基或四氢吡喃基氧基氨基羰基，并且n、p、X、Y、Z、R和rS如式(i)所定义)，以及其n-氧化物形式、药学可接受的加成盐和立体化学异构形式。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula>根据对式(I)化合物定义的组，对于以上中间体可以确定感兴趣的、优选的、更优选的和最优选的4匕合物的组。式(I)化合物和一些中间体可能在其结构中具有至少一个立体中心。该立体中心可以R或S构象存在。在上述方法中制备的式(I)化合物通常是对映异构体的外消旋混合物，所述对映异构体可用本领域已知的拆分方法彼此分离。式(I)的外随后分离所述非对映体盐形式，例如通过选择结晶或分级结晶，然后用碱释出对映异构体。分离式(I)化合物对映异构体形式的另一种方法涉及用手性固定相的液相色谱。所述纯立体化学异构形式还可从合适原料的相应纯立体化学异构形式获得，条件是反应立体选择性地发生。如果需要特定的立体异构体，优选通过立体有择的制备方法合成所述化合物。这些方法使用对映异构纯的原料是有利的。式(I)化合物、其药学可接受的酸加成盐和立体异构形式具有有价值的药理学特性，因为它们具有组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制效果。本发明提供了一种通过给予有效量的本发明化合物抑制细胞(包括转化的细胞)异常生长的方法。细胞的异常生长指的是不受正常调节机制(例如接触抑制丧失)支配的细胞生长。这包括肿瘤生长的抑制，通过导致癌细胞生长停滞、终末分化和/或细胞程序死亡而直接抑制，以及抑制肿瘤的新血管形成而间接抑制。本发明还提供一种通过给受试者给予有效量的本发明化合物抑制肺瘤生长的方法，该受试者例如是需要这类治疗的哺乳动物(特别是人)。特别是，本发明提供了一种通过给予有效量的本发明化合物抑制肿瘤生长的方法。可抑制的肿瘤的实例包括但不限于肺癌(例如腺癌，并且包括非小细胞肺癌)、胰癌(例如，胰腺癌，例如外分泌胰腺的癌)、结肠癌(例如，结肠直肠癌，例如结肠腺癌和结肠&良瘤)、前列腺癌(包括前期病变)、淋巴系统的造血肿瘤(例如，急性淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤)、骨髓性白血病(例如，急性髓性白血病(AML))、曱状腺小嚢癌、脊髓发育不良综合症(MDS)、间质源性肺瘤(例如，纤维内瘤和一黄紋月几肉瘤)、黑素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、皮肤良性肺瘤(例如，角化l束皮瘤)、乳房癌(例如，前期乳腺癌)、肾癌、卵巢癌、膀胱癌和表皮癌。才艮据本发明的化合物可以用于其它的治疗目的，例如a)在用于治疗癌症的对肿瘤放射照射之前、期间或之后通过给予本发明化合物促进肿瘤对放射疗法的敏感性；b)治疗关节病和骨病理学病症，如类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年关节炎、痛风、多发性关节炎、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎和系统性红斑狼疮；C)抑制平滑肌细胞增殖，包括血管增殖病症、动脉粥样硬化和再狭窄；d)治疗炎症和与皮肤病症，如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、过每文性鼻炎、移植物抗宿主疾病(graftvs.hostdisease)、结膜炎、哮喘、ARDS、贝切特氏病、移植排斥反应、荨麻疹、过^:性皮炎、斑秃、硬皮病、皮瘆、湿渗、皮肌炎、痤疮、糖尿病、全身性红斑狼痴、川崎病、多发性硬化、肺气肿、嚢性纤维化和慢性支气管炎；e)治疗子宫内膜异位、子宫平滑肌瘤、功能障碍性子宫出血和子宫内膜增生；f)治疗眼的血管化，包括侵袭视网膜和脉络膜血管的血管病变；g)治疗心脏功能紊乱；h)抑制免疫抑制症状，如治疗HIV感染；i)治疗肾功能紊乱；j)抑制内分泌异常；k)抑制葡萄糖异生作用的功能紊乱；l)治疗神经病，如帕金森氏症，或治疗导致认知异常的神经病，例如阿尔茨海默氏病或与神经元疾病相关的聚谷氨酰胺病(polyglutamine);m)治疗精神错乱，例如精神分裂症、双相型障碍、抑郁症、焦虑和精神异常；n)抑制神经肌肉的病变，例如肌萎缩性侧索硬化；o)治疗脊髓性肌萎缩；p)治疗其它的受基因加强表达治疗作用的病症；q)加强基因疗法；r)抑制脂肪生成；s)治疗寄生虫病，如疟疾。因此，本发明公开了用作药物的式(I)化合物，以及这些式(I)化合物在制备治疗一种或多种上述病症的药物中的用途。式(I)化合物、其药学可接受的酸加成盐和其立体异构形式具有有价值的诊断特性，因为它们可用于测定或确定生物样品中的HDAC,包4舌;险测或测定在标记4t;合物和HDAC之间配合物的形成。所述检测或确定方法可以使用用标记试剂标记的化合物，标记试剂例如是放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。放射性同位素的实例包括心1251、1311、3H和14。酶通常通过合适底物的结合，接着催化可检测反应来检测酶。酶的实例包括例如P-半乳糖苷酶、p-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶，优选辣根过氧化酶。发光物质包括例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、水母发光蛋白和萤光素酶。生物样品可以定义为身体组织或体液。体液的例子是脑脊液、血液、血浆、血清、尿，痰液、唾液等。考虑到本发明化合物有用的药理学特性，其可配制到多种药物形式中用于给药。为了制备本发明的药物组合物，有效量特定的化合物以碱或酸加成盐的形式作为活性成分与药学可接受的载体完全混合，载体可以采用多种形式，取决于希望给药的制剂的形式。这些药物组合物理想地是适合的单元剂型，优选用于口服、直肠给药、经皮给药或肠道外注射。例如，在口服剂型组合物的制备中，可使用任何常用的药物介质，例如，例如在口月l液体药剂例如悬浮液、糖浆剂、酏剂和溶液的情况下，使用水、二醇、油、醇等；在粉末、丸、胶嚢和片的情况下使用固体载体如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于给药容易，片剂和胶嚢是最有利的口服单位剂型，在这样的情况下，显然使用的是固体药物载体。对于肠道外给药的组合物，虽然可以包括其它成分，例如助溶成分，但是载体通常含有无菌水，至少占大部分。例如，可制备可注射的溶液，其中载体包括生理盐水、葡萄糖溶液或生理盐水和葡萄糖溶液的混合物。也可制备可注射的悬浮液，在这样的情况下，可使用合适的液体载体、助悬剂等。在适用于经皮给药的组合物中，载体任选含有渗透增强剂和/或合适的润湿剂，任选与比例较小的任何性质的合适添加剂结合，添加剂对皮肤不产生显著的有害影响。所述添加剂可促进对皮肤的给药和/或有助于制备所需组合物。这些组合物可以多种方式给药，例如作为透过皮肤起作用的贴片、作为点滴剂(spot-on)或作为專欠膏。以剂量单元形式配制上述药物组合物对于方便给药和用量的一致性是特别有益的。在说明书和权利要求中所用的单位剂型指的是物理上地不连续的、合适作为单位剂量的单位，每个单位含有预定量的活性成分，适于产生所需的治疗效果，并与需要的药物载体结合。这样的单位剂型的例子是片剂(包括划痕片剂或包衣片剂)、胶嚢、丸剂、粉剂包、扁嚢剂(wafers)、可注射的溶液或悬浮液、茶匙剂、汤匙剂等，及其分隔开的多重剂量组合。从在下文中提供的测试结果，本领域技术人员可以容易地确定有效量。通常，治疗有效量可以从0.005mg/kg体重到100mg/kg体重，特别是从0.005mg/kg体重到10mg/kg体重。在一天内将需要的剂量分成两个、三个、四个或更多个小剂量以合适的间隔给药可能是适当的。所述小剂量可以配制成单元剂量形式，例如每个单元剂量形式含有含0.5-500mg、特别是10mg-500mg的活性成分。作为本发明的另一个方面，提出了HDAC-抑制剂与另一抗癌剂组合，特别是用作药物，更准确地i兌是在癌症或相关疾病的治疗中。对于上述病症的治疗，本发明的化合物可有利地与一种或多种其它药剂联合使用，更具体地讲是与其它的抗癌剂联合使用。抗癌剂的实例是-钼配^f立化合物，例如顺柏、卡铂或奥沙利辆；-紫杉烷化合物，如紫杉醇(紫杉醇)或多西紫杉醇；-拓朴异构酶I抑制剂，如喜树碱化合物，例如伊立替康或托泊替康；-拓朴异构酶n抑制剂，如抗肿瘤鬼臼毒素书f生物，例如依托泊苷或替尼泊苷；-抗胂瘤长春花生物碱，例如长春碱、长春新^咸或长春瑞滨；-抗肺瘤核苷衍生物，例如5—氟尿嘧啶、吉西他滨或卡培他滨；-烷基化剂，如氮芥或亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀或洛莫司汀；-抗肿瘤蒽环素(anthracycline)衍生物，例如柔红霉素、多柔比星、伊达比星或米托蒽醌；画HER2抗体，例如曲妥单抗(曲妥单抗)；-雌激素受体拮抗剂或选择性的雌激素受体调节剂，例如他莫昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、氟维司群(faslodex)或雷洛昔芬；-芳香酶(芳香酶)抑制剂，如依西美坦、阿那曲唑、来曲唑(letrazole)和伏氯唑；-分化剂，如类视黄醇、维生素D和维曱酸代谢作用阻滞剂(RAMBA),例如异维生素A酸(accutane);-DNA转甲基酶抑制剂，例如氮胞苷；-激酶抑制剂，如flavoperidol、甲磺酸4尹马替尼或吉非*#尼(gefitinib);-法尼基转化酶(farnesyltransferase)抑制剂；-其它的HDAC抑制剂；國泛素國蛋白酶体途径抑制剂，例如万珂(Velcade);或-yondelis。在此所用的术语"柏配位化合物，，表示任何抑制肿瘤细胞生长的铂配位化合物，其提供离子形式的铂。术语"紫杉烷化合物"表示具有紫杉烷环系的一类化合物，其与紫杉属(Taxus)某些树种的萃取物相关或由所述萃取物衍生。术语"拓朴异构酶抑制剂"用于表示能够改变真核细胞内DNA拓朴结构的酶。它们对于重要的细胞功能和细胞增殖很关键。在真核细胞中有两种类型的拓朴异构酶，即I型和II型。拓朴异构酶I是大约100,000分子量的单体酶。所述酶与DNA结合并引入一个暂时性单链缺口，解开双螺旋(或使其解开)，然后经缺口再次封闭，之后从DNA链上分离。拓朴异构酶II具有类似的作用机理，包括引入DNA链的缺口或形成自由基。术语"喜树碱化合物"用于表示与母体喜树碱化合物相关或由其衍生的4^合物，母体喜4对石咸^i合物是/人中国树种Camptothecinacuminata和印度树种Nothapodytesfoetida获得的不溶于水的生物石咸。术语"鬼臼霉素化合物"用于表示与母体鬼臼霉素有关或由其衍生的化合物，鬼臼霉素萃取自曼德拉草植物(mandrake)。术语"抗肺瘤长春花生物碱"用于表示与长春花植物(Vincarosea)的萃取物有关或由其衍生的化合物。术语"烷基化剂"包括不同类的化学试剂，其具有共同的特性，即，其具有在生理条件下给生物学生命大分子(例如DNA)提供烷基的能力。对于大多数更重要的试剂，例如氮芥类和亚硝基脲类，在复杂的降解反应之后在体内生成活性的烷基化片断，其中一些降解反应是酶催化的。烷基化剂最重要的药理作用是干扰涉及细胞增殖基本进程，特别是DNA合成和细胞分裂。烷基化剂能够干扰迅速增殖的组织中DNA功能和完整性，这提供为其治疗应用和其许多的毒性提供了基础。术语"抗月中瘤蒽环素衍生物，，包括从真菌Strep,peuticusvar.caesius获得的抗生素及其衍生物，其特征在于具有四环素环结构，通过糖苷键连接一个特殊的糖氨基糖柔胺(daunosamine)。已经指出在原发性乳房癌中人表皮生长因子受体2蛋白质(HER2)的扩增与某些患者的不良临床预后结果有关。曲妥单抗是一种高度纯化重组DNA-衍生的人化单克隆IgGl-K抗体，其高亲合性和高特异性地与HER2受体的胞外域结合。许多乳腺癌具有雌激素受体，雌激素可促进这些肿瘤的生长。术语"雌激素受体拮抗剂"和"选择性雌激素受体调节剂"用来表示与雌激素受体(ER)结合的雌二醇的竟争性抑制物。选择性的雌激素受体调节剂与ER结合时，导致受体的三维形状改变，调节其与雌激素效应元件(ERE)在DNA上的结合。在绝经后妇女中，循环的雌激素的主要来源是肾上腺和卵巢雄激素(雄烯二酮和睾丸激素)在周围组织中通过芳香酶酶转化为雌激素(雌甾酮和雌二醇)。通过芳香酶抑制或钝化导致雌激素损失对于一些患有激素依赖性乳腺癌的绝经后患者是有效的和选择性的治疗。在此使用的术语"抗雌激素剂"不但包括雌激素受体拮抗剂和选择性雌激素受体调节剂，而且包括如上所述的芳香酶抑制剂。术语"分化剂"包括可以多种方式抑制细胞增殖和诱导分化的化合物。已知在多种正常和恶性细胞类型的生长调节和分化中，维生素D和类视黄醇起了重要的作用。维甲酸代谢阻滞剂(RAMBA's)通过抑制维曱酸的细胞色素P450-介导的分解代谢提高内源性维甲酸的水平。DNA甲基化变化属于人类肺瘤形成中最常见的异常。在选择的基因的启动子中，高曱基化通常与所涉及基因的钝化有关。术语"DNA曱基转移酶抑制剂，，用来表示通过DNA转曱基酶的药理学抑制和肺瘤抑制基因表达的再活化起作用的化合物。术语"激酶抑制剂"包括激酶的有效抑制剂，起涉及细胞周期发展和细力包程序死亡(编程性细力包死亡)。术语"法尼基转移酶抑制剂"用来表示被设计用于阻止Ras和其它细胞内蛋白质的法尼基化的化合物。它们已经显示出对恶性细胞增殖和存活有效。术语"其它的HDAC抑制剂"包括但不限于-羧酸酯类，例如丁酸酯、肉桂酸、4-苯基丁酸酯或丙戊酸；-异羟肟酸类，例如辛二酰基苯胺异羟肟酸(SAHA)、含哌。秦的SAHA类似物、联芳基异羟肟酸A-161906及其咔哇基醚-、四氢吡"定-和四氲萘酮-类似物、双环芳基-N-羟基羧酰胺类、pyroxamide、CG-1521、PXD-lOl、石黄酰胺异羟肟酸、LAQ-824、LBH-589、曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)、oxamflatin、scriptaid、与scriptaid相关的三环分子、间-羧基肉桂酸二异羟肟酸(CBHA)、CBHA样异羟肟酸类、trapoxin-异羟肟酸类似物、CRA-024781、R306465和苯曱酰基-和杂芳基-相关的异羟肟酸类、氨基辛二酸酯和丙二酰基二酰胺；國环;l大四月太类,"f列长口trapoxin、apidicin、纟宿盼酉臾月大(depsipeptide)、spiruchostatin-相关的化合物、RedFK-228、含巯基的环状四肽类(SCOPs)、含异羟肝酸的环状四肽类(CHAPs)、TAN-174s和-苯曱酰胺为，例如MS-275或CI-994,或-depudecin。术语"泛素-蛋白酶体通道抑制剂"用于表示抑制蛋白酶体内细i包蛋白质(包括细胞周期调节蛋白质)的靶向破坏的化合物。为了治疗癌症，根据本发明的化合物可如上所述与放射联合给药于患者。放射的意思是指电离辐射，并且特别是伽马辐射，尤其是通过直线加速器或通过现在通用的放射性核素发射的射线。通过放射性核素对肺瘤辐照可以是外部的或内部的。本发明还涉及抗癌剂和本发明的HDAC抑制剂的根据本发明的组合物。本发明还涉及根据本发明的组合物，其用于医药治疗，例如抑制肿瘤细力包的生长。本发明还涉及#4居本发明的组合物，其用于抑制肿瘤细胞的生长。本发明还涉及抑制人受试者内肿瘤细胞生长的方法，其包括给所述受试者给予有效量的本发明组合物。本发明进一步提供了一种抑制细胞异常生长的方法，包括通过给予有效量本发明组合物转化细胞。其它的药剂和HDAC抑制剂可以同时(例如，以分离的或单一的组合物)或以任一顺序相继给药。就后一种情况而言，两种化合物可在一定周期内以足够保证实现有益效果或协同效应的量和方式给药。应理解，优选的给药方法和顺序以及该组合物中各个成分的各自剂量和给药方案取决于所给予的特定的其它药剂和HDAC抑制剂、它们的给药途径、所治疗的特定肿瘤和,皮治疗的特定宿主。最'除当的给药方法和顺序以及剂量和给药方案可容易地由本领域技术人员用常^L方法并考虑在此所列出的信息确定。賴配位化合物有利地以每个疗程每平方米体表面积1-500mg(mg/m2)的剂量给药，例如50-400mg/m2,特别地，顺氯氨铂剂量为约75mg/m2，卡铂剂量为约300mg/m2。紫杉烷化合物有利地以每个疗程每平方米体表面积50-400mg(mg/m2)的剂量给药，例如75-250mg/m2,特別地，紫杉醇剂量为约175-250mg/m2,多西紫杉醇剂量为约75-150mg/m2。(mg/m)的剂量给药，例如1-300mg/m2,特别地，伊立替康剂量为约100-350mg/m2，托泊替康剂量为约1-2mg/m2。抗胂瘤鬼臼毒素衍生物有利地以每个疗程每平方米体表面积30-300mg(mg/m2)的剂量给药，例如50-250mg/m2,特别地，依托泊苷剂量为约35-100mg/m2，替尼泊苷剂量为约50-250mg/m2。抗肿瘤长春花生物石咸有利地以每个疗程每平方米体表面积2-30mg(mg/m2)的剂量给药，特别地，长春碱剂量为约3-12mg/m2,长春新碱剂量为约l-2mg/m2，长春瑞滨剂量为约10-30mg/m2。mg(mg/m)的剂量症合药，例如700-1500mg/m2,特别地，5-氟尿嘧咬剂量为200-500mg/m2,吉西他滨剂量为约800-1200mg/m2,卡培他滨剂量为约1000-2500mg/m2。烷基化剂如氮芥或亚硝基脲有利地以每个疗程每平方米体表面积100-500mg(mg/m2)的剂量给药，例如120-200mg/m2,特别地，环磷酰胺剂量为约100-500mg/m2,苯丁酸氮齐剂量为约0.1-0.2mg/kg,卡莫司汀剂量为约150-200mg/m2,洛莫司汀剂量为约100-150mg/m2。抗肿瘤蒽环素书卞生物有利地以每个疗程每平方米体表面积10-75mg(mg/m2)的剂量给药，例如15-60mg/m2,特别地，多柔比星剂量为40-75mg/m2，柔红霉素剂量为约25-45mg/m2,伊达比星剂量为约10-15mg/m。曲妥单抗有利地以每个疗程每平方米体表面积1-5mg(mg/m2)的剂量给药，特别是2-4mg/m2。根据特定的药剂和-故治疗的症状，抗雌激素药剂有利地以每天约l-100mg的剂量给药。他莫昔芬有利地以5-50mg的剂量口服给药，优选10-20mg每天两次，连续治疗足够的时间以实现和保持治疗^:果。托瑞米芬有利地以约60mg的剂量一天一次经口给药，连续治疗足够的时间以实现和保持治疗效果。阿那曲唑有利地以约1mg的剂量一天一次经口给药。屈洛昔芬有利地以约20-100mg的剂量一天一次经口给药。雷洛昔芬有利地以约60mg的剂量一天一次经口给药。依西美坦有利地以约25mg的剂量一天一次经口给药。这些剂量可以每疗程例如一次、两次或多次^会药，其可例如每隔7天、14天、21天或28天重复。考虑到它们的有用的药理学特性，本发明组合物的成分，即所述的其它药剂和所述的HDAC抑制剂可以被配制成用于给药目的的各种药物形式。所述成分可分别地配制在单一的药物组合物中，或配制在含有这两种成分的整体药物组合物中。本发明因此还涉及药物组合物，其含有所述的其它药剂和所述的HDAC抑制剂以及一种或多种药物载体。本发明还涉及药物组合物形式的根据本发明的组合物，其含有抗癌剂和才艮据本发明的HDAC抑制剂以及一种或多种药物载体。本发明进一步涉及根据本发明的组合物在生产抑制肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途。本发明进一步涉及一种产品，其含有作为第一活性成分的根据本发明的HDAC抑制剂和作为第二活性成分的抗癌剂，所述产品为组合的制剂，用于同时、单独或相继用于治疗罹患癌症的患者。实验部分以下实施例说明本发明。在下文中，"EDC，，定义为N，-(乙基碳亚氨基)-^1,:^-二甲基-1,3-丙烷二胺一盐酸盐，"DCM"定义为二氯甲烷，"DIPE"定义为二异丙基醚，"EtOAc，，定义为乙酸乙酯，"EtOH"定义为乙醇，"HOBt"定义为l-羟基-lH-苯并三唑，"MeOH"定义为甲醇，"TFA，，定义为三氟乙酸以及"THF'定义为四氩吹喃。A、制备中间体化合物实施例Ala)制备中间体1将2-(l-哌。秦基)-5-嘧啶曱酸乙酯(0.059mol)在THF(300ml)和1N氬氧化钠(300ml)中的混合物在室温下静置过夜，然后搅拌。加入IN盐酸(300ml),再将该混合物搅拌10min。加入碳酸钠(0.178mol),再将所得混合物在室温下搅拌10min,然后以小份加入1-[[(9H-药一9_基曱氧基)羰基]氧基]-2,5-吡咯烷二酮(0.059mol),再将该反应混合物在室温下搅拌15小时。将该混合物用浓盐酸酸化，滤出沉淀物，干燥(真空)，得到22.5g(90。/。)的中间体l,熔点218.5-221.2°C。b)制备中间体2将三乙胺(0.069mol)、然后是EDC(0.0303mol)和HOBt(0.0303mol)、接着是O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0303mol)加至中间体1(0.0233mol)在DCM/THF(500ml)中的混合物中，再将该反应混合物在室温下搅拌18小时。将该混合物用DCM稀释，再用水洗涤。将有机层分离，再用10%碳酸钠溶液洗涤。将分离的有机层干燥(MgS04),过滤，蒸发溶剂。将残余物通过柱色谱法经硅胶(洗脱液DCM/MeOH100/0至97.5/2.5，在100min内)纯化。收集产物级分，再蒸发溶剂，得到8.4g(68%)的中间体2。c)制备中间体3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage35</formula>将中间体2(0.016mol)在哌咬(0.040mol)和DCM(200ml)中的混合物在室温下搅拌过夜，再将反应混合物用水萃取，然后将水层浓缩，再与乙腈共蒸发。将残余物(3.5g)通过柱色谱法经硅胶(洗脱液DCM/(MeOH/NH3)95/5)纯化。收集产物级分，再蒸发溶剂，得到2.5g(50。/o)的中间体3，熔点70.8-93.9°C。d)制备中间体4将中间体3(0.0016mol)、1-萘基-硼酸(0.0016mol)和1,4-二贷恶烷-2,5-二醇(0.0018mol)在EtOH(20ml)中的混合物在室温下搅拌48小时，倾入到水中，再用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgS04),过滤，再蒸发溶剂。将残余物通过柱色谱法经硅胶(5|nm)(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH99/1/0.5至92/8/0.4)纯化。收集纯级分，蒸发溶剂，得到0.18g(23。/。)的中间体4。实施例A2制备中间体5将中间体3(0.0016mol)、苯并[b]噻吩-2-基-硼酸(0.0016mol)和1,4-二噹烷-2,5-二醇(0.0018mol)在EtOH(20ml)中的混合物在室温下搅拌48小时，倾入到水中，再用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgS04),过滤，再蒸发溶剂。将残余物通过柱色谱法经硅胶(5|Lim)(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH99/1/0.5至92/8/0.4)纯化。收集纯级分，蒸发溶剂，得到0.195g(79%)的中间体5。实施例A3制备中间体6将1,4-二終恶烷-2,5-二醇(0.003mol)，然后将2-(l-哌。秦基)陽5-嘧咬曱酸乙酯(0.003mol)加至[l-(苯基磺酰基)-lH-吲哚-3-基]-硼酸(0.003mol)在EtOH(50ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌48小时，然后过滤。蒸发滤液。将残余物置于EtOAc中。将有机层用水洗涤，然后用饱和氯化钠洗涤，干燥(MgS04),过滤，再蒸发溶剂。将残余物(1.7g)通过柱色i普法经硅月交(15-40)Lim)(洗脱液DCM/MeOH98/2)纯化。收集纯级分，蒸发溶剂，得到1.2g(71%)的中间体6。b)制备中间体7将中间体6(0.0015mol)在3N盐酸(30ml)和二狩恶烷(10ml)中的混合物在100。C下搅拌24小时。蒸发二嚅烷。加入水(30ml)。将该混合物用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgS04)，过滤，再蒸发溶剂，得到0.57g(67%)的中间体7。c)制备中间体8将EDC(0.0015mol)和HOBt(0.0015mol)在室温下加至中间体7(0.001mol)、O-(四氩-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0015mol)和三乙胺(0.0047mol)在DCM/THF50/50(60ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌48小时，倾入到水中，再用DCM萃取。分离有才几层，干燥(MgS04),过滤，再蒸发溶剂。将残余物(0.82g)通过柱色谱法经硅胶(5(am)(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH98/2/0.2至92/8/0.8)纯化。收集纯级分，蒸发溶剂，得到0.19g(31%)的中间体8。实施例A4a)制备中间体9将2-[4誦(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶曱酸乙酯(0.0114mol)、乙醛(0.0227mol)和Pd/C(0.6g)在MeOH(300ml)中的混合物在室温和3bar压力下氢化48小时，然后经硅藻土过滤。石圭藻土用Me〇H/DCM洗涤。蒸发滤液。将残余物(3.6g)通过柱色谱法经石圭月交(15-40)nm)(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH90/10/0.5)纯化。收集纯级分，蒸发溶剂，得到0.75g(230/0)的中间体9。b)制备中间体10将中间体9(0.0022mol)、2-苯并吹喃基-硼酸(0.0022mol)和1,4-二哺烷-2,5-二醇(0.0024mol)在EtOH(30ml)中的混合物在室温下搅拌48小时，倾入到水中，再用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgS04)，过滤，再蒸发溶剂。将残余物(lg)通过柱色谱法经硅胶(15-40pm)(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH98.5/1.5/0.1)纯化。收集纯级分，蒸发溶剂，得到0.22g(22%)的中间体10。c)制备中间体11将中间体10(0.0004mol)和氬氧化钠(0.0009mol)在EtOH(40ml)中的混合物在60。C搅拌6小时，然后冷却至室温，再蒸发至干燥，得到0.22g(100%)的中间体ll。d)制备中间体12将EDC(0.0007mol)和HOBt(0.0007mol)在室温和N2流下加至中间体11(0.0004mol)在DCM(30ml)和THF(30ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0009mol)。将该混合物在室温下搅拌96小时，倾入到水中，再用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgSOj,过滤，再蒸发溶剂。将残余物(0.7g)通过柱色^普法经珪胶(5)iim)(洗脱液DCM/MeOH/NH4OH99/1/0.5至96/4/0.2)纯化。收集纯级分，蒸发溶剂，得到0.108g(42%)的中间体12。实施例A5a)制备中间体13<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>、[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]-硼酸(0.0016mol)和2，3-二羟基-丙醛(0.0032mol)在EtOH(60ml)中的混合物在60。C下反应90小时，然后将该粗品通过柱色i普法经硅胶(NP)(梯度洗脱液DCM/MeOH100/0至96.5/3.5,在100分钟内)纯化。收集产物级分，再蒸发溶剂。将残余物从乙腈中结晶，然后将所得沉淀物滤出，干燥(真空)，得到0.14g(15%)的中间体13,熔点209。C。实施例A6a)制备中间体14<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>将2-(l-哌。秦基)-5-嘧啶曱酸乙酯(0.018mol)、[4-(1,1-二曱基乙基)苯基]-硼酸(0.018mol)和2,3-二羟基-丙醛(0.036mol)在EtOH(150ml)中的混合物在60。C下反应18小时。将所得沉淀物滤出，干燥，得到5,3g(66%)。将残余物通过色谱法在ChimlcelOJ(10)iim)上(洗脱液MeOH100)纯化。收集两个产物级分，蒸发溶剂，获得两个对映体。将对映体A从乙腈中结晶，然后将所得沉淀物滤出，干燥(真空)，得到2,lg中间体14,熔点190。C。b)制备中间体15<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>将中间体14(0.0015mol)在IN氬氧化钠(40ml)和THF(40ml)中的混合物在室温下搅拌24小时。加入lN盐酸(40ml)。蒸发THF。将所得沉淀物滤出，干燥，得到1.9g(100%)的中间体15。c)制备中间体16<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>将EDC(0.0065mol)和HOBt(0.065mol)在室温下加至中间体15(0.0043mol)、O-(四氢-2H-他喃-2誦基)-羟胺(0.065mol)和三乙胺(0.013mol)在DCM/THF50/50(200ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌48小时，倾入到水中，再用DCM萃取。分离有机层，干燥(MgS04),过滤，再蒸发溶剂，然后将该粗品通过柱色谱法经硅胶(NP)(梯度洗脱液DCM/MeOH100/0至94/6)纯化。收集产物级分，再蒸发溶剂，得到0,76g(34%)的中间体16，熔点173°C。B、制备最终化合物实施例Bl制备化合物1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>将中间体4(0.0003mol)在TFA(1ml)和MeOH(20ml)中的混合物在室温下搅拌48小时，然后蒸发。将残余物从乙醚/乙腈中结晶。将沉淀物过滤，干燥，得到0.125g(64%)的化合物1,熔点136。C。实施例B2制备化合物20.86C2HF3O20.74H20将中间体5(0.0004mol)在TFA(1ml)和MeOH(20ml)中的混合物在室温下搅拌48小时，然后蒸发。将残余物从乙醚/乙腈中结晶。将沉淀物过滤，干燥，得到0.153g(75%)的化合物2，熔点165。C。实施例B3制备化合物3在5。C下将TFA(0.8ml)滴加至中间体8(0.0002mol)在MeOH(16ml)中的溶液中。将该混合物在室温下搅拌48小时，然后蒸发至干燥。将残余物从乙醚/MeOH中结晶。滤出沉淀物，用乙醚洗涤，干燥，得到0.135g(82%)的化合物3,熔点206°C。实施例B4制备化合物4将中间体12(0.0002mol)在TFA(0.5ml)和MeOH(10ml)中的混合物在室温下搅拌30小时，然后蒸发至干燥。将残余物从乙醚/乙腈中结晶。滤出沉淀物，干燥。将残余物(0.058g)通过柱色谱法经涂渍氨基的硅月交(洗脱液DCM/MeOH/水90/10/1)纯化。收集纯级分，.0.76C2HF3020.66H20蒸发溶剂，得到0.05g(56%)的化合物4，熔点9(TC。实施例B5制备化合物5.C2HF302将中间体13(0.000243mol)和TFA(1ml)在MeOH(20ml)中的混合物搅拌48小时，然后在<40"下蒸发溶剂。将残余物混悬于DIPE中，再滤出需要的产物，干燥(真空)，得到0.096g(73%)的化合物5,熔点138-154°C。实施例B6制备化合物6将中间体16(0.0015mol)和TFA(5ml)在MeOH(100ml)中的混合物搅拌72小时，然后在〈4(TC下蒸发溶剂。将残余物混悬于DIPE中，再滤出需要的产物，干燥(真空)，得到0.66g(76%)的化合物6，熔点163-171°C。表F-1列出了根据以上实施例之一制备的化合物。表F-1<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>C、药理学实施例对于抑制组蛋白脱乙酰基酶的体外试验(参见实施例C.l)测定了由式(I)化合物获得的HDAC酶活性的抑制作用。式(I)化合物的细胞活性在A2780肿瘤细l包上用测定细胞毒性或存活率的比色试马全确定(MosmannTim,JournalofImmunologicalMethods65:55-63,1983)(参见实施例C.2)。化合物的溶解度测定的是化合物保持在溶液中的能力。在首先的两种方法中，测定化合物在稀释时保留在水溶液中的能力(参见实施例C.3.a和C.3.b)。DMSO-储备溶液在不同的连续步骤中用单一的含水緩冲剂溶剂稀释。在第一方法(参见C.3.a)中，用浊度计测定的浊度。在第二方法(C.3.b)中，然后^"对出现的沉淀物在BDGentest溶解度扫描仪上扫描混合物。在第三方法中，用化学发光氮气检测器可测定化合物在不同pH值的溶解度(参见实施例C.3.c)。药物渗透性表示其从一种介质进入或通过另一种介质的能力。具体而言，是其穿过肠膜进入和/或从血流进入靶体的能力。渗透性(参见实施例C.4)可以通过形成滤过固定的人工膜磷脂双层测定。在滤过固定的人工膜试验中，用96孔微滴定板和96孔滤板形成"夹心，，，从而每个组成的孔^皮分成双室，供体溶液在底部，受体溶液在上部，用涂J文了2%(wt/v)二油酰基磷脂酰基-胆碱的十二烷溶液的125|Lim微过滤片(孔径0.45ium微米)分隔，当该体系接触含水緩冲溶液时，滤片通道内部形成多层双分子层。化合物通过该人工膜的渗透性按cm/s计量。目的在于寻找在4.0和7.4两个不同的pH值通过平行人工膜的药物的渗透性。用UV-分光光度法在250和500nm之间的最佳波长4企测化合物。药物的代谢作用是指脂溶性的异生化合物或生物内生的化合物经酶催化转化成极性、水溶性的和可排泄的代谢产物。药物代谢的主要器官是肝脏。代谢产物往往比母体药物活性小或是非活性的。但是，一些代谢产物可能具有增强的活性或毒性作用。因此，药物代谢可包括"解毒"和"中毒，，两种过程。确定生物处理药物和化学试剂能力的主要酶系之一代表性的是细胞色素P450单氧化酶，其为NADPH依赖的酶。化合物的代谢稳定性可以在体外借助于亚细胞的人类组织(见实施例C.5.a)确定。此时，化合物的代谢稳定性可以表示为这些化合物与微粒体培养15分钟后代谢的药物的百分比。化合物的定量通过LC-MS分析确定。化合物的代谢稳定性还可通过计算在大鼠肝细胞中的半衰期(halflive)来确(参见实施例C.5.b.)。已经表明多种抗肺瘤剂活化p21蛋白质，包括DNA损伤剂和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂。DNA损伤剂通过胂瘤抑制基因p53活化p21基因，而组蛋白脱乙酰基酶抑制剂经转录因子Spl转录性地活化p21基因。因此，DNA损伤剂通过p53效应元件活化p21启动子，而组蛋白脱乙酰基酶抑制剂通过spl位点(位于相对于TATAbox的-60bp至+40bp区域)活化p21启动子，导致p21蛋白质的表达提高。当细胞中的p21启动子由未含有p53效应元件的p211300bp启动子片l殳组成时，其相应地对DNA损伤剂没有响应。可以多种方式评价化合物i秀导p21的性能。第一种方法是用感兴趣的化合物处理肿瘤细胞，细胞溶胞后用p21酶标记免疫分析法(WAF1ELISAofOncogene)测定p21的诱导作用。所述p21试验是使用小鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的"夹心"酶免疫分析法。对于人p21蛋白质特异性的兔多克隆抗体已经固定到试剂盒提供的塑料孔板的表面上。分析样品中存在的任何p21会与捕捉抗体结合。生物素化的检测单克隆抗体还可识别人p21蛋白质，并且与已经一皮捕l足抗体保留的任何p21结合。所述检测抗体接着通过辣根过氧化酶共轭的抗生蛋白链菌素结合。辣根过氧化酶催化显色底物四曱基联苯胺从无色溶液到蓝色溶液的转化(或加入停止试剂后转为黄色)，颜色的强度与和板结合的p21蛋白质的量成正比。用分光光度计测定显色反应产物。通过用已知浓度的p21(以冷冻干燥物提供)制作标准曲线进行定量。该试验可以测定p21诱导作用是DNA损伤的结果或是组蛋白脱乙酰基酶抑制的结果(参见实施例C.6.a)。另一种方法测试化合物在细胞水平抑制HDAC的结果由此确定其应元件的表达载体稳定转染口，由其中与对照水^相比提高的报道基因表达确定化合物具有p21诱导性能。报道基因是荧光蛋白质，报道基因的表达以发射的荧光的量测定(参见实施例C.6.b)。最后一种方法是体内方法，其中使用小鼠筛选化合物的药物活性。可以将上述稳定转化的肿瘤细胞以足够引起肿瘤产生的量施用给小鼠。在肿瘤细胞有充足的时间形成肿瘤后，将有潜力的活性化合物施用给所述动物，通过测定报道基因的表达评价所述化合物对肺瘤细胞的作用。与药物活性化合物一起培养会导致与对照水平相比提高了的报道基因表达(参见实施例C.6.C)。特定的HDAC抑制剂不应抑制其它的酶，例如大量的CYPP450蛋白质。CYPP450(大肠杆菌表达的)蛋白质3A4、2D6en2C9将其特定的底物转化为荧光分子。CYP3A4蛋白质将7-苄氧基-三氟曱基香豆素(BFC)转化为7-羟基-三氟甲基香豆素。CYP2D6蛋白质将3-[2-(N,N-二乙基-N-曱基氨基)乙基]-7-甲氧基-4-曱基香豆素(AMMC)转化为3-[2-(N,N-二乙基氨基)乙基]-7-羟基-4-曱基香豆素盐酸盐，CYP2C9蛋白质将7-曱氧基-4-三氟曱基香豆素(MFC)转化为7-羟基-三氟甲基香豆素。化合物抑制所述的酶促反应将导致荧光信号的降低(参见实施例C.7)。实施例C丄抑制组蛋白脱乙酰基酶的体外试-验使用Biomol(cat.No:AK-500-0001)的HDAC荧光活性试-睑/药物发现试剂盒。HDAC荧光活性试验基于FluordeLys(荧光基因组蛋白脱乙酰基酶赖氨酰((FluorogenicHistonedeAcetvlaseLvsvl))底物和显影剂组合物。FluordeLys底物含有乙酰化赖氨酸侧链。底物的脱乙酰作用使所速底物具有感光性，从而在第二个步骤中，用FluordeLys显影剂处理生成荧光团。HeLa细胞核萃取物(供应商Biomol)以60|ug/ml量与75(iM的底物一起培养。将FluordeLys底物加入到緩冲剂中，所述緩冲剂含25mMTris、137mMNaCl、2.7mMKC1和1mMMgCl2*6H20,pH值7.4。30分钟后，加入l体积显影剂。用355nm光激发荧光团，在荧光板检测器上纟企测发射光(450nm)。对于每个试-验，对照(含HeLa细胞核萃取物和緩冲剂)、空白培养(含緩冲剂，但是不含HeLa细胞核萃取物)和样品(含溶于DMSO并进一步在緩冲剂中稀释的化合物和HeLa细胞核萃取物)平行进行。在第一种情况下，化合物在10^M的浓度测试。当所述化合物在10-5M显示活性时，产生浓度-响应曲线，其中化合物在10-5M和10-9M之间的浓度测试。所有样品测试4次。在每个测试中，从对照和样品数值扣除空白值。对照样品表示底物100%脱乙酰化。对于每个样品，荧光表示为对照平均值的百分比。如果合适，IC50-值(将代谢产物的量降低至对照的50%所需的药物的浓度)用对已分级数据的概率分析计算。在此，测试化合物的作用表示为pIC5Q(IC50-值200780003016.6说明书第39/48页的负对数值)(参见表F-2)。实施例C.2:在A2780细胞上测定抗增殖活性将测试的所有化合物溶于DMSO并进一步用培养液稀释。在细i包增殖试验中，最终的DMSO浓度从不超过0.1%(v/v)。对照样品含A2780细胞和DMSO,不含化合物；空白样品含DMSO,但是不含细胞。MTT以5mg/ml溶于PBS。制备由O.IM甘氨酸和0.1MNaCl组成的甘氨酸緩冲剂，用NaOH(1N)緩冲到pH10.5(所有试剂来自于Merck)。人A2780卵巢癌细胞(T.C.Hamilton博士[FoxChaseCancerCentre,Pennsylvania,USA]热心捐赠)在补充了2mML-谷氨酸盐、50|Lig/ml庆大霉素和10%胎牛血清的RPMI1640介质中培养。在37。C、湿润的5%C02气氛中将细胞常规保持为单层培养物。细胞用胰蛋白酶/EDTA溶液以1:40的分流比每周传代一次。所有介质和添加剂/人LifeTechnologies获得。用Gen-Probe类茵质体组织培养试剂盒(供应商BioMerieux)确定细月包无支原体污染。将细胞接种到NUNC96-孔培养皿(供应商LifeTechnologies)中，使其附着在塑料板上过夜。接种密度为每孔1500个细胞，介质总体积为200|ul。在细胞粘到所述的板以后，介质,皮改变，加入药物和/或溶剂得到最终体积200iLi1。然后培养四天，用200iul新鲜介质替代介质，用基于MTT的试验评价细胞密度和活力。向每个孔中加入25|ul的MTT溶液，在37。C进一步培养所述细胞2小时。然后小心地吸出所述介质，加入25iul甘氨酸緩冲液，然后加入100iul的DMSO将蓝色MTI-曱腊(formazan)产物溶解。在微板振荡器上振动微量培养板10分钟，用Emax96-孔分光光度计(供应商Sopachem)在540nm测定吸光度。在一个试验中，每次试验条件的结果为3个平行测定孔的平均值。出于最初的筛选目的，化合物在单一固定的10—SM浓度测试。对于活性化合物，重复实验以建立完整的浓度-响应曲线。对于每个试验，对照样(不含药物)和空白样(不含细胞或药物)的培养平行进行。从所有的对照和样本数值减去空白试验值。对于每个样本，细胞生长的平均值(以吸收度单位)表示为对照样细胞生长平均值的百分比。如果合适，。IC5o-值(将代谢产物的量降低至对照的50%所需的药物的浓度)用对已分级数据的概率分析计算(Finney,DJ.,ProbitAnalyses,2ndEd.Chapter10,GradedResponses,CambridgeUniversityPress,Cambridge1962)。在此，测试化合物的作用表示为pIC50(IC5o-值的负对数值)(参见表F-2)。实施例C.3:溶解度/稳定性C.3.a.在含水介质中的动态溶解度在第一稀释步骤中，将溶解在DMSO(5mM)中的活性化合物浓缩储备溶液10|ul加入到pH7.4的100fil磷酸盐4宁檬酸盐緩冲液中并混合。在第二稀释步骤中，第一稀释步骤的等分样品(20pl)进一步溶于100pi的pH7.4的磷酸盐柠檬酸盐緩冲液中并混合。最后，在第三稀释步骤中，第二稀释步骤的样品(20)iil)进一步在pH7.4的100iul磷酸盐柠檬酸盐緩冲液中稀释并混合。所有稀释在96孔板中进行。在最后的稀释步骤后立即用浊度计测定所述三个连续稀释步骤的浊度。对于每种化合物进行一式三份的稀释以免偶然误差。基于所述浊度测定进行三级分类排序。具有高溶解度的化合物得3分，对于这类化合物的第一次稀释物为澄清的。具有中等溶解度的化合物得2分。对于这类化合物的第一次稀释物不澄清，第二次稀释物为澄清的。具有低溶解度的化合物得l分，对于这些化合物第一次和第二次得稀释物不澄清(见表F-2)。C.3.b.在含水介质中的动态溶解度5000-9.8jiM(1/2稀释)的DMSO-储备溶液是在96孔储备溶液板(每孔200pl)中在DMSO中制备的。每次稀释后将样品混合。然后将等份的此DMSO溶液(2iul)转移到2个另外的96孔緩沖溶液板中，该板每孔含有200fil緩冲溶液。每一緩冲溶液板既含有pH7.4的含水緩冲溶液又含有pH4.0的含水緩冲溶液。在最后稀释之后，将緩冲溶液板混合，并使样品在室温下稳定1/2小时。对于每种化合物进行一式二份的稀释以免偶然误差。然后在BDGentest溶解度扫描仪上对形成的沉淀物扫描。基于该混合物中不存在/存在沉淀物，通过插值计算动态溶解度。分级成3级。具有高溶解度的化合物得3分并具有高于或等于50的溶解度。具有中等溶解度的化合物得2分并具有高于20|aM且低于50pM的溶解度。具有低溶解度的化合物得1分，对于这些化合物溶解度低于或等于10^iM(参见表F-2)。C.3.c.在不同pH下，化合物的溶解度还可以使用化学发光的氮气检测测定(参见表F-2)。实施例C.4:平4亍人工膜渗透性分析将储备液样品(10]ul的5mM储备液的等分样品在100%DMSo中)稀释于含有2ml的pH4或pH7.4的含水緩冲系统(PSR4系统溶液浓缩物(pION)的深孔板或预混合板中。在样品加入到所述参比板前，将150|ul的緩冲液加入到孔中，测定空白样的UV。此后，弃去所述H沖液，该板用作参比板。所有测定在抗UV-板(供应商Costar或Greiner)中进行。在参比板的空白测定之后，将150|ul的稀释样品加到该参比板，将稀释的样品200|ul加入到供体板1。将受体滤板1(供应商Millipore,型号MAIPN45)用4)ul人工膜形成溶液(1,2-二油酰基-sn-Glycer-3-磷酸胆碱在十二烷中，含0.1%2,6-二叔丁基-4-甲酚)涂敷，置于供体板1的上部形成"夹心"。将緩冲液(200pi)分配到上方的受体孔中。夹心用盖板覆盖，在室温下在暗处储藏18小时。受体板2的空白测定是通过在孔中加入150的緩冲液然后进行UV测定进行的。在受体板2空白测定之后，弃去緩冲液，将150]iil的受体溶液从受体滤板1转移到受体板2。然后除去受体滤板1形成夹心。在供体板2的空白测定之后(参见上文)，将150|Lil的供体溶液从供体板1转移到供体板2。扫描(使用SpectraMAX190)供体板2、受体板2和参比板孔的紫外光谱。用PSR4pCommand软件处理所有光谱以计算渗透性。所有化合物计算三次。在每次试验中使用卡马西平、灰黄霉素、阿昔洛韦、阿替洛尔、呋塞米和氯噻。秦作为标准。化合物分为3个等级的类别，即，具有低渗透率(平均效果〈0.5x10—6cm/s;分数1)、中渗透率(lxl0-6cm/s〉平均效果^0.5xl0-6cm/s;分数2)或高渗透率($1xl(r6cm/s;分数3)。实施例C.5:代谢稳定性实施例C.5.a.根据Gorrod等人(Xenobiotica5:453-462，1975)在机械均化组织之后通过离心分离制备亚细胞组织制剂。肝脏组织在水冷的0.1MTris-HCl(pH7.4)緩冲液中漂洗以洗涤过量的血液。然后吸干组织、称重和用手术剪粗粗地切^淬。组织碎片用装配了Teflon扦的Potter-S(Braun,意大利)或者SorvallOmni-混合匀浆器在3体积水冷的0.1M磷酸盐緩沖液(pH7.4)中均化7xl0秒。在两种情况下，容器在所述均化步骤期间#皮保存在冰上/冰内。在4。C下将组织匀浆用Sorvall离心机或Beckman超离心机以9000xg离心20分钟。得到的上层清液在-8(TC储藏并标记为'S9'。S9级分可以用Beckman超离心机以100.000xg进一步离心60分钟(4°C)。得到的上层清液^皮小心地吸出，等分并标记为'细胞溶质'。将所述颗粒(pellet)重新悬浮在O.IM磷酸盐緩冲液(pH7.4)中，每0.5g原始组织重量最终体积为lml,标记为嗜i粒体'。所有亚细胞部分一皮等分试样，立即在液氮中水冻，在-8(TC-賭藏直到使用。对于要测试的样品，培养混合物含有PBS(0.1M)、化合物(5|uM)、微粒体(1mg/ml)和NADPH-生成系统(0.8mM葡萄糖-6-磷酸、0.8mM氯化镁和0.8单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)。对照样品含相同物质，但是所述微粒体被加热失活(在95摄氏度下IO分钟)的微粒体替代。在对照样品中化合物的回收率的总是100%。将混合物在37摄氏度预培养5分钟。反应在0时间点(t=0)通过添加0.8mMNADP启动，样品培养15分钟(t=15)。通过加入2体积的DMSO终止反应。然后样品以900xg离心IO分钟，在分析前，上层清液在室温下储藏不超过24小时。所有培养^皮在duplo中进行。上层清液的分析用LC-MS分析仪进行。样品的洗脱在XterraMSC18(50x4.6mm,5|um,Waters,US)上进行。使用Alliance2790(供应商Waters,US)HPLC系统。用緩冲液A(在H20/乙腈(95/5)中25mM的乙酸铵(pH5.2))、溶剂B乙腈和溶剂C甲醇以2.4毫升/分钟的流速洗脱。使用的梯度是以线性方式在5分钟内有机相浓度从0%提高至50%B和50%C,在1分钟内提高到100%B,有机相浓度再保持稳定1.5分钟。样品的总注射体积是25pl。4吏用酉己备了ESI源的Quattro(供应商Micromass,Manchester,UK)三重四极质谱4义作为纟全测器。所述源和脱溶剂温度分别设定在120200780003016.6和350。C,用氮气作为雾化剂和干燥气体。以正扫描方式(单一离子反应)方式获取数据。锥体电压设定在10V，停留时间l秒。代谢稳定性可以表示为在活性微粒体(E(活性的))存在下培养15分钟之后的化合物％代谢t=15时，E(活性的)的总离子电流(TIC)(%代谢=100%-(-)x100)。t=0时，E(活性的)的TIC具有t=0时E(活性的)的TIC百分代谢小于20%的化合物定义为高代谢稳定的。具有20-70%代谢的化合物定义为中等稳定的，显示百分代谢高于70%的化合物定义为低代谢稳定的。当进行代谢稳定性筛选时，总是包括三个参比化合物。维拉帕米作为具有低代谢稳定性(％代谢=73%)的化合物被包括在内。西沙比利作为中等代谢稳定性(％代谢=45%)的化合物被包括在内，丙醇作为中等至高代谢稳定性(25%代谢)的化合物被包括在内。这些参比化合物用来确认所述的代谢稳定性试验。试验了八个化合物，其中的3个为高代谢稳定的，3个显示中等代谢稳定性，2个化合物为低代谢稳定性。C.5.b:用大鼠肝细胞培养物测定代谢稳定性从雄性SpragueDowley大鼠分离大鼠肝细胞。化合物溶于100%DMSO中形成5mM储备溶液，在jliM的最后浓度和大鼠肝细胞细胞培养物(0.5百万活细胞/0.5ml)用24孔板培养0、15、30、60和120分钟。通过添加2体积的DMSO制备用于LC-MS的样品。将所述样品充分振动，随后以900g离心IO分钟(室温)。所有试-险进行一式三卞分。得到的上层清液50用LC-MS分析。对于LC隱MS,在HypersilBDSC18柱(50x4.6mm,5|um,Thermohypersil,UK)上进行样品的洗脱。HPLC系统包括Surveyor输送系统(SurveyorInc.,SanJose,US),装备了Surveyor自动取样器装置。使用緩冲液A(在H20/乙腈(95:5)中的10mM乙酸4妄(pH6.9))和溶剂B(乙腈)以1.2ml/min的流速洗脱。使用的梯度为开始条件下0.5mm溶剂A,然后以线性方式提高有机相浓度，用2分钟从0%B提高到95%B。该相再保持稳定2min,然后在0.5min内再次降低到0%B。样品的总注射体积为50iliL。柱加热炉的温度保持在40°C。分离LC流用于MS检测，O.lml进入所述源。配备了ESI源的三重四极质谱仪TSQQuantum(Thermofinnigan,LaJolla,USA)质镨仪用于才全测。源电压设定在3800伏，毛细管温度在300。C。为了定量评价，质i普仪以阳离子模式在调节到M+H质量的SIM中操作，扫描宽度1Da。仪器控制、数据收录和处理用Xcalibur软件(ThermOFinnigan，San.lose,CA,U.S.A)进行。在大鼠肝细胞中化合物的代谢稳定性可以以体外半衰期来表示。实施例C.6:p21i秀导性能实施例C.6.a:p21酶联免疫吸附试-验用以下方法在人A2780卵巢癌细胞中确定p21蛋白质表达水平。将A2780细胞(20000细胞/180|ul)接种到96孩i孔滴定板的RPMI1640介质中，所述的RPMI1640介质补充了2mML-谷氨酸盐、50]ug/ml庆大霉素和10%胎牛血清。在细胞溶胞前24小时，以IO-5、l(T6、10-7和10-8M的最后浓度加入化合物。将所有一皮测试的化合物溶于DMSO,用培养液进一步稀释。在加入化合物后24小时，从细胞上去掉上层清液。细胞用200|al水冷的PBS洗涤。吸清所述孔，加入30的溶胞緩冲液(50mM的Tris.HCl(pH7.6)、150mM的NaCl、1%的Nonidetp40和10%的甘油)。所述板在-70。C培养过夜。将适合数量的微滴定孔从金属箔包装中取出，置入空孔固定器中。制备洗涤緩沖液(20x分析板洗涤浓缩液100mlPBS和表面活性剂的20倍浓溶液。含2%的氯乙酰胺)的工作溶液(lx)。冷冻干燥的p21WAF标准物用蒸馏水复原，用样品稀释剂(在所述试剂盒中提供)进一步稀释。通过在样品稀释剂中以1:4的比例稀释制备样品。样品(100和p21WAFI标准物(100|Lil)用移液管移入合适的孔并在室温下培养2小时。用lx洗涤緩冲液洗涤所述孔3次，然后将100pl的检-验抗体试剂(生物素化的单克隆p21WAF1抗体的溶液)用移液管移入每个孔。将所述孔在室温下培养1小时，然后用lx洗涤緩沖液洗涤3次。稀释400x共轭物(过氧化物酶抗生物素共轭物400倍浓溶液)，再将100|ul的lx溶液加入到所述孔。所述孔在室温下培养30分钟，然后用lx洗涤緩冲液洗涤3次，用蒸馏水洗涤1次。底物溶液(显色底物)(100pi)加入到所述孔中，在室温下在黑暗中培养所述孔30分钟。按早先加入底物溶液的相同的顺序将停止溶液加入到每个孔。用分光光度计板计数器在450/595nm双波长测定每个孔的吸光度。对于每个试^验，对照样(不含药物)和空白样(不含细胞或药物)的培养平行运行。从所有的对照和样本数值扣除空白试-验值。对于每一样品，p21WAF1诱导作用(以吸光度为单位)可以表示为对照样p21WAF1值的百分比。诱导百分比高于130%定义为具有显著诱导作用。测试三个化合物，均显示出显著的诱导作用。实施例C.6.b.细月包方法在37。C下在5%C02的湿润培养箱中，将A2780细胞(ATCC)在RPMI1640介质中培养，所述RPMI1640介质补充了10%FCS、2mM的L-谷氨酸盐和庆大霉素。所有细力包培养溶液由Gibco-BRL(Gaithersburg,MD)提供。其它材料由Nunc提供。从增殖的A2780细胞提取基因组DNA,用作p21启动子的巢床PCR分离的模板。第一次扩增用低聚核苷酸对GAGGGCGCGGTGCTTGG和TGCCGCCGCTCTCTCACC,以基因组DNA为模板，在55。C韦刃化温度(annealingtemperature)进行20个周期。得到的4.5kb片段包含相对于TATA盒的-4551至+88的片段，该片段用低聚核苷酸TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC在88。C韧化温度再扩增20个周期，得到4.5kb片段，随后用低聚核苷酸对TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC在88。C韧化温度扩增20个周期，得到包含相对于TATA盒的-1300至+88片段的1.3kb片段。存在于低聚核苦酸(加下划线的序列)中的限制酶切位点Xhol和Kpnl用于亚克隆。从pGL3-basic去掉荧光素酶指针，在Kpnl和Xbal限制酶切位点用ZsGreen指针(来自pZsGreen1—Nl质粒)替代。通过将上述人p21启动子区域的1.3kb片段在Xhol和Kpnl位点插入pGL3-basic-ZsGreenp构成GL3-basic-ZsGreen-1300。所有限制性内切酶由BoehringerManheim(德国)提供。将A2780细胞以2x105细胞的密度涂敷在6孔板中，培养24小时，通过4吏用Lipofectamine2000(Invitrogen,Brussels,比利时)如制造商所述用2|ug的pGL3-basic-ZsGreen-1300和0.2)ug的pSV2neo介体转染。用G418(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)选择所述转染的细胞10天，取单细胞悬浮液生长。3周后，得到单克隆。扩增A2780选择的克隆，以每孔10000细胞接种在96孔板中。接种24小时后，用化合物再处理细胞24小时(影响邻近p21启动子区域的spl位点)。随后，用4%PFA固定细胞30秒，用Hoechst染料染色。p21启动子活化导致ZsGreen产生，并因此发焚光，通过AscentFluoroskan(ThermoLabsystems,Brussels,比利时)4企测。对于每个试验，对照样(不含药物)和空白样(不含细胞或药物)的培养平行运行。从所有的对照和样本数值扣除空白试验值。对于每个样品，p21诱导值可以表示为对照样p21值的百分比。诱导百分比高于130%的定义为显著诱导。试验了10个化合物，并且显示出显著诱导。实施例C.6.c.:体内方法将选择的克隆皮下注入(107细胞/200pi)棵鼠的侧腹，12天后得到可用卡尺测量到的肿瘤。从第12天起，在6天内对动物经口或经静脉每天施用溶剂和20-40mpk化合物(每组4-10只动物)。通过自制的自动整体成像系统(OlympusSZX12荧光立体显微镜，装备了GFP滤片，并与JAICV-M90型CCD照相才几组合，用基于来自NationalInstmments⑧的IMAQVision软件的软件包控制)以荧光评Y介肺瘤。测试了化合物6的C6c,并且可与R306465相比较。实施例C.7:P450抑制性能将所有一皮测试的化合物溶于DMSO(5mM),在乙腈中进一步稀释到5xl0"M。在试验緩冲液中制备进一步的稀释物(0.1MNaK磷酸盐緩冲液pH7.4),最终的溶剂浓度不高于2%。对CYP3A4蛋白质的分析包括每孔15pmolP450/mg蛋白质(在0.01MNaK磷酸盐緩冲液+1.15。/oKCl中)、NADPH发生系统(3.3mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氩酶、1.3mMNADP和3.3mMMgCl2'6H2〇，在分析緩冲液中)和化合物，总分析体积为100|ul。在37°C预培养5分钟后，加入在分析緩冲液中150pM的荧光探针底物BFC启动酶促反应。在室温下培养30分钟后，加入2体积乙腈终止反应。在405nm激发波长和535nm发射波长处进行萸光测定。包括酮康唑(IC50-值3X10-8M)作为该试验的参比化合物。对CYP2D6蛋白质的分析包括每孔6pmo1P450/mg蛋白质(在0.01MNaK磷酸盐缓冲液+1.15%KC1中)、NADPH发生系统(0.41mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氪酶、0.0082mMNADP和0.41mMMgCl2-6H20，在分析緩冲液中)和化合物，总分析体积100^1。在37。C预培养5分钟后，加入在分析緩沖液中的3pM的荧光探针底物AMMC启动酶促反应。在室温下培养45分钟后，加入2体积乙腈终止反应。在405nm激发波长和460nm发射波长处进行荧光测定。包括奎尼丁(IC5o-值〈5X1(T8M)作为该试验的参比化合物。对CYP2C9蛋白质的分析包括每孔15pmolP450/mg蛋白质(在0.01MNaK磷酸盐緩冲液+1.15。/oKCl中)、NADPH发生系统(3.3mM葡萄糖誦6画磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6國磷酸脱氳酶、1.3mMNADP和3.3mMMgCl2'6H20,在分析緩沖液中)和化合物，总分析体积100|Lil。在37°C预培养5分钟后，加入在分析緩冲液中200|uM的荧光探针底物MFC启动酶促反应。在室温下培养30分钟后，加入2体积乙腈终止反应。在405nm激发波长和535nm发射波长处进行荧光测定。包括磺胺苯吡唑(IC5。-值二6.8X1(T7M)作为该试'验的参比化合物。为了初步筛选的目的，化合物在单一固定的浓度的lxlO^M测试。对于活性化合物，重复试验建立完整的浓度-响应曲线。对于每个试验，对照样(不含药物)和空白培养(不含酶或药物)平行运行。所有化合物一式四份分析。从所有的对照和样本数值减去空白试^r值。对于每个样本，样品的P450活性平均值(以相对荧光度为单位)表示为对照样P450活性平均值的百分比。抑制百分比可以表示为100yo减去样品P450活性平均值。如果合适，计算IC,值(将P450活性降低到对照样的50%所需的药物的浓度)。表F-2:列出了根据实施例C.l、C.2、C.3.a、C.3.b和C.3.c测试的<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>D.组合物实施例包膜衣的片剂片芯的制备100g式(I)化合物、570g乳糖和200g淀粉的混合物充分混合，然后用5g十二烷基硫酸盐钠和10g聚乙烯基吡咯烷酮在约200ml水中的溶液湿润。将湿粉末混合物过筛，干燥，然后再次过筛。然后加入100g微晶纤维素和15g氩化植物油。全部混合均匀，压成片剂，得到10000片，每片含10mg的式(I)化合物。包衣向10g曱基纤维素在75ml变性乙醇中的溶液加入5g乙基纤维素在150ml二氯曱烷中的溶液。然后加入75ml的二氯曱烷和2.5ml1,2，3-丙二醇。熔融10g的聚乙二醇，溶于75ml二氯甲烷。将后一溶液加入前者，然后加入2.5g十八酸镁、5g聚乙烯吡咯烷酮和30ml浓染料悬浮液，全部材料匀浆。用这样得到的混合物在包衣设备中将片芯包衣。权利要求1.式(I)化合物及其N-氧化物形式、药学可接受的加成盐和立体化学异构形式其中n是0或1，并且当n是0时，表示直接键；p是0或1，条件是当p是0时n是0，-(CH2)n-(NR3)p-是直接键并且Y是N；各X独立地是N或CH；各Y独立地是O、N、NH、CH或CH2，并且当Y是N或CH时所述的取代基连接到所述环结构的所述Y原子；R1是羟基或式(a-1)的基团其中R4是羟基或-NH2；R5是氢、噻吩基、呋喃基或苯基，并且各噻吩基、呋喃基或苯基可任选被以下基团取代卤代、氨基、硝基、氰基、羟基、苯基、C1-6烷基、(二C1-6烷基)氨基、C1-6烷基氧基、苯基C1-6烷基氧基、羟基C1-6烷基、C1-6烷基氧基羰基、羟基羰基、C1-6烷基羰基、多卤代C1-6烷基氧基、多卤代C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、羟基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基、氨基磺酰基、氨基磺酰基C1-6烷基、异噁唑基、氨基羰基、苯基C2-6烯基、苯基C3-6炔基或吡啶基C3-6炔基；R6、R7和R8各自独立地是氢、-NH2、硝基、呋喃基、卤代、C1-6烷基、C1-6烷基氧基、三氟甲基、噻吩基、苯基、C1-6烷基羰基氨基、氨基羰基C1-6烷基或-C≡C-CH2-R9；其中R9是氢、C1-6烷基、羟基、氨基或C1-6烷基氧基；R2是CH2OH、CH2CH(OH)-CH2OH、CH2OCH3或CH2OCH2CH3；R3是氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、C1-6烷基羰基或C1-6烷基磺酰基；和Z是下式的基团其中R10是氢、C1-6烷基、C3-7环烷基或苯基磺酰基；和R11是氢、羟基、氨基、卤代、C1-6烷基、多卤代C1-6烷基、C1-6烷基羰基、氰基、羟基羰基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷氧基或者单-或二(C1-6烷基)氨基。2.根据权利要求1的化合物，其中各X是N;各Y是N或CH;R1是羟基；R2是CH2OH或CH2CH(OH)-CH2OH,R3是氢或d-6烷基；R1Q是氬或苯基磺酰基；和R11是氬。3.根据权利要求1或2的化合物，其中各X是N;各Y是N;W是羟基；R是CH20H;W是氢；A是式(b-3)或(b-6)的基团；和R"是氢。4.根据权利要求l、2或3的化合物，其中所述化合物是下式化合物No.l和化合物No.2:<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>5.—种药物组合物，包括药学可接受的载体和作为活性成分的治疗有效量的权利要求1~4所述的化合物。6.制备权利要求5所述药物组合物的方法，其中所述的药学可接受的载体与权利要求1~4所述的化合物被紧密地混合。7.用作药物的权利要求1-4任一项所述的化合物。8.权利要求14任一项所述的化合物在制备治疗增殖疾病的药物中的用途。9.抗癌剂和权利要求1~4任一项所述HDAC抑制剂的组合物。10.制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，a)将式(II)中间体与适宜的酸反应得到式(I)异羟肟酸，其中W是羟基，在此称为式(I-a)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(I-a)b)将其中的M表示氢或钠或锂或碱金属阳离子的式(III)中间体与式(XIV)中间体在适宜试剂存在下在适合的溶剂中反应，形式(I)化合物，其中W是式(a-1)的基团且W是-NH2，在此称为式(I-b)化合物,<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>C)将式(IV)中间体与适宜的酸在适合的溶剂中反应，形式式化合物，或者<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>d)将式(V)中间体，其中TBDMS表示叔丁基(二曱基)曱硅烷基，与氟化四丁基铵在适合的溶剂中反应，形成式(I)化合物，其中W是式(a-l)的基团且R"是羟基，在此称为式(I-c)化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>11.式(A)化合物，其中Q是d.2烷氧基羰基、羟基羰基或四氬p比喃基氧基氨基羰基，并且n、p、X、Y、Z、112和113如式(I)所定义,以及其N-氧化物形式、药学可接受的加成盐和立体化学异构形式。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>12.制备权利要求11所述化合物的方法，其特征在于，a)将式(VI)中间体与与中间体(VII)反应，形成其中的Q是四氲吡喃基氧基氨基羰基的由式(II)表示的式(A)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>b)将式(VIII)中间体以单个的步骤与1,4-二嗜烷-2,5-二醇和适宜的式(IX)的硼酸反应，形成式(II)化合物，其中R是-CH20H并且n和p均为0以及Y是N,在此称为式(II-a)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>c)将式(VIII)中间体以单个的步骤与式(XI)中间体和适宜的式(IX)的硼酸反应，形成式(II)化合物，其中RS是-CH20H-CH20H并且n和p均为0以及Y是N,在此称为式(II-b)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>d)将式(XVII)中间体与适宜的酸或碱溶液反应，形成其中的Q是羟基羰基的由式(VI)表示的式(A)化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>e)将式(XII)中间体以单个的步骤与1,4-二嗜烷-2,5-二醇和适宜的式(IX)的硼酸反应，形成式(A)化合物，其中Q是d-2烷氧基羰基，RS是-CH20H并且n和p均为0以及Y是N,在此称为式(XVII-a)化合物，或者<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(XVII-a)f)将式(XII)中间体以单个的步骤与式(XI)中间体和适宜的式(IX)的硼酸反应，形成式(A)化合物，其中Q是d-2烷氧基羰基，R2是-CH20H-CH20H并且n和p均为0以及Y是N,在此称为式(XVII-b)化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(XVII-b)全文摘要本发明包括具有组蛋白脱乙酰基酶抑制酶活性的新的式(I)化合物，其中R¹、R²、R³、X、Y和Z具有所定义的含义；它们制备、含有它们的组合物以及它们作为药物的用途。文档编号C07D405/12GK101370791SQ200780003016公开日2009年2月18日申请日期2007年1月16日优先权日2006年1月19日发明者B·鲁克斯,L·F·B·马康尼特-德克拉恩,P·R·安吉鲍德,S·F·A·范布兰德特申请人:詹森药业有限公司