专利名称：双拷贝β-甘露聚糖酶的基因工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及双拷贝e -甘露聚糖酶的基因工程菌及其应用。
背景技术：
甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，由3 -1, 4-D吡喃甘露糖连接而成的线状 多糖。甘露聚糖具有高亲水性，在单胃动物的消化道内大量吸水，增加了消化道内 容物的粘度，抵抗胃肠的蠕动，直接影响动物对营养物质的消化和吸收。近年来， 随着豆类产品(豆粕等)在动物词粮中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养作用也越来 越受到重视。2005年，我国大豆产量1800万吨，进口量为2300万吨，其中，80% 以上用于饲料。豆粕中甘露聚糖的含量在2%以上。其降解主要依靠添加e-甘露聚 糖酶。近年来，随着豆类产品(豆粕等)在词粮中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养 问题也越来越受到重视，在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途径。甘露聚 糖的完全酶解需要e-甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、葡糖苷酶、a-半乳糖苷酶 和脱乙酰酶的协同作用，其中0-甘露聚糖酶在饲料中的应用比较广泛。甘露聚 糖酶是一类能水解甘露聚糖的半纤维素酶类，广泛存在于动植物和微生物中。有报 道，在大猪饲料中添加e-甘露聚糖酶，可以提高平均日增重10%以上；在肉鸡饲料 中添加0-甘露聚糖酶可以提高饲料的转化率4%~6%，提高鸡的抗病力，改善肉用鸡 的健康状况。
发明内容
本发明的目的是提供一种双拷贝3 -甘露聚糖酶的基因工程菌及其应用。
本发明所提供的双拷贝甘露聚糖酶的基因工程菌，命名为GS115-PIC-MA丽， 是将两个拷贝的0 -甘露聚糖酶基因导入酵母菌中获得的重组菌。
其中，所述P-甘露聚糖酶基因的核苷酸序列为GenBank DQ464114。所述酵母 菌为毕赤酵母GS115。
巴氏毕赤酵母。ic力fspasfan^) GS115-PIC-MA腿已于2009年04月23日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市 朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.3031。
本发明的另一个目的是提供一种生产P -甘露聚糖酶的方法。本发明所提供的生产0 -甘露聚糖酶的方法，是用所述的重组菌发酵生产0 -甘 露聚糖酶。
其中，所述的发酵培养基可为任何适合酵母生长的培养基，如BMGY培养基。 所述发酵过程中溶解氧饱和度第一次为100%时，流加25% (质量百分含量)甘 油。所述发酵过程中溶解氧饱和度第二次为100%时，流加甘油与甲醇的混合物。所 述发酵过程中溶解氧饱和度为30%以上流加甘油与甲醇混合物；所述发酵过程中溶 解氧饱和度为30%以下，流加甘油。所述甘油与甲醇的混合物中，甘油与甲醇的的 质量比为(6-9) :1。
本发明的方法生产的e-甘露聚糖酶具有比活性高、酸稳定性好、催化pH值范 围广等优点，适于用作猪、鸡等单胃动物的添加剂。
图i为pcr扩增e -甘露聚糖酶基因。
图2为10 L发酵罐中GS115-PIC-MA丽经甲醇诱导不同时间表达的e-甘露聚 糖酶SDS-PAGE电泳。
图3为10 L发酵罐中菌体浓度和P -甘露聚糖酶活性变化。
具体实施例方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径 获得。
实施例1、 GS115-PIC-MANM生产P -甘露聚糖酶 一、表达e-甘露聚糖酶的GS115-PIC-MANM的构建 1、硫色曲霉的药配及其总RNA的提取
将硫色曲霉"wer^777M 5Wp力wre^，保藏号CGMCC No. 0608)接种到其 生长培养基(用400mL自来水溶解85g麦麸、10 g豆饼粉、0. 2 g KH2P04、 0. 3 g NaCl 和10g蔗糖，12rC蒸煮30min，过滤取上清，分装后再高压灭菌)中，3(TC摇床 培养48 h。培养结束后，5000 r/min离心l min收集菌体，置于液^中研磨。取 100 mg研磨后的菌体，置于1. 5 mL离心管中，加入500 |nL RNA抽提缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl， pH8. 0， 1% SDS， 200 ramol/L NaCl， 5 mmol/L EDTA)，再加入500 |iL 酚/仿(l:l)， 4°C、 12000 r/min离心5 min，上清加入等体积4 mol/L LiCl， 4°C 沉淀4h，然后12000 r/min离心15 min，弃上清，将沉淀用70%的乙醇洗两次， 真空抽干，溶于20 pl DEPC处理的ddH20中，得到目的菌株的总RNA。
42、 甘露聚糖酶基因cDNA片段的克隆
对GenBank中公布的刺孢曲霉(GenBank登录号L35487)和瑞氏木霉(GenBank 登录号L25310) e-甘露聚糖酶基因的mRNA序列进行分析，分析结果表明在中间 段有一段高度同源的核苷酸序列，根据这一高度保守的核苷酸序列设计一对简并引 物，引物序列如下
Pl (上游引物)5, -TTCAACGACGTCAACAC-3，；
P2 (下游引物):5， -A(T/C)CCAGCC(G/A)TTGCCCCA-3，
以步骤1提取的硫色曲霉总RNA为模板，用M-MLV反转录酶(Promega)合成 其第一链cDNA。再以反转录合成的第一链cDNA为模板，在引物1和引物2的引导 下进行PCR扩增，50 PCR反应体系为10XPCR缓冲液5 (iL、引物P1和P2各 1 )iL (20 )iM) 、 Taq酶1 fiL (5|V|iL) 、 dNTPs 1 pL (2.5 mM)、模板cDNA 1 jiL、 H20 40|iL; PCR反应条件为首先94。C预变性3min;然后94。C预变性45 s， 49°C 退火45 s， 72'C延伸1 min，共35个循环；最后72。C延伸10 min。反应结束后， 对PCR扩增产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测，回收长度约600bp的目的片段并对 其进行纯化，将回收片段克隆到载体pUCm-T (上海生工生物工程有限公司)中，得 到含有回收片段的重组质粒，对其进行测序，测序结果表明扩增片段含有上述高度 保守的核苷酸序列，长度为608bp。
3、 P-甘露聚糖酶基因cDNA的3' UTR (非翻译区)的克隆
根据步骤2获得的P -甘露聚糖酶基因的部分cDNA序列，设计出3， -RACE扩 增特弓I物MAN-3-2: 5， -TACCCGTACCAATTCGC-3，。然后以总RNA为模板，用3 ， -Ful 1 RACE试剂盒(TaKaRa公司)扩增e-甘露聚糖酶基因cDNA的3'末端片段，反应体 系及反应条件参照试剂盒说明书。反应结束后，对PCR产物进行1X琼脂糖凝胶电 泳检测，回收并纯化长度约600bp的扩增片段，将其克隆到载体pUCm-T，得到含有 回收片段的重组质粒，对其进行测序，测序结果表明扩增的甘露聚糖酶基因 cDNA的3， UTR片段长度为151bp。
4、 0 -甘露聚糖酶基因cDNA的5， UTR的克隆
根据步骤2获得的P -甘露聚糖酶基因的部分cDNA序列，设计出5' -RACE扩 增特引物Race-1、 Race-2、 Race-3、 Race-4和RT-P，引物序列如下 Race-1: 5' -GTATTTGCGTGGGAGTTGGC-3'; Race-2: 5， -TACCCGTACCAATTCGCCGA-3，；Race-3: 5，-TGCAATCTGCGTATCAGACG-3，； Race-4: 5' -ACGAGACGGATTTCTATACC-3，； RT-P: 5' -CCAACTCCCACGCAA-3'。
然后以硫色曲霉总RNA为模板，用5' -Full RACE试剂盒(TaKaRa公司)扩增 P-甘露聚糖酶基因cDNA的5'末端片段，反应体系及反应条件参照试剂盒说明书。 应结束后，对PCR产物进行1X琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化长度约500bp的 扩增片段，将其克隆到载体pUCm-T上，得到含有回收片段的重组质粒，对其进行 测序，测序结果表明扩增的3-甘露聚糖酶基因cDNA的5'UTR片段长度为24bp。
5、 P-甘露聚糖酶基因全长cDNA序列的获得
根据步骤3和4获得的P -甘露聚糖酶基因的5'和3'末端序列设计一对引物， 引物序列如下
Fl (上游弓l物)5-cggaattcatgaagctctccagctc-3; F2 (下游弓l物)5-cccaagcttttaggcgctatcaatagc-3
以硫色曲霉总RNA为模板，在引物F1和F2的引导下，PCR扩增e-甘露聚糖 酶基因的全长cDNA， 10XPCR buffer 5 (iL、引物(Fl/F2)各1 (20 、 Taq酶1 pL (5ji/nL) 、 dNTPs 1 pL (2.5 mM)、模板cDNA 1 jiL、 H20 40 /iL'总 反应体系50 pL，反应程序为94t:预变性3 min，然后按以下循环参数进行扩增反 应94。C预变性45 s, 49 °C退火45 s， 72 °。延伸1 min， 35个循环，最后72 °C 延伸10min。反应结束后，对PCR产物进行1X琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化 长度约1152 bp的扩增片段，将其克隆到载体pUCm-T上，得到含有回收片段的重 组质粒，用M13+z-引物对其进行测序，测序结果表明硫色曲霉e-甘露聚糖酶基因 全长cDNA具有序列表中SEQ ID Na: 2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID Na: 2 由1327个碱基组成，编码序列为自5'端第25-1176位碱基，编码具有序列表中 SEQIDNq: 1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5'端第1-24位碱基为5'端非翻译 区，自5'端第25-87位碱基为信号肽编码序列，自5，端第88-1176位碱基为成 熟蛋白编码序列，自5'端第613-621位碱基编码典型的甘露聚糖酶保守序列，自 5，端第1177-1327位碱基为3，端非翻译区。序列表中的SEQ ID N2: 1由383个 氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第l-21位氨基酸残基为信号肽，自氨基端第 22-383位氨基酸残基为成熟蛋白，自氨基端第205-207位氨基酸残基为典型的甘露 聚糖酶保守序列。硫色曲霉e-甘露聚糖酶成熟蛋白的分子量为41 kDa。将克隆的硫色曲霉0 -甘露聚糖酶基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列与GenBank 中的序列进行同源性比对，比对结果表明该酶与刺孢曲霉3 -甘露聚糖酶的亲缘关 系最近，核苷酸序列相似性达71%，氨基酸序列相似性达72%。
6、 硫色曲霉e-甘露聚糖酶成熟蛋白基因的合成
在不改变氨基酸序列的前提下，仅将硫色曲霉e-甘露聚糖酶基因中编码成熟 蛋白的密码子替换为毕赤酵母的偏爱密码子，从而得到另外一条硫色曲霉0 -甘露 聚糖酶基因的核苷酸序列，即序列表中的SEQ ID Na: 3，序列表中的SEQ ID N2: 3由1327个碱基组成，编码序列为自5'端第25-1176位碱基，编码具有序列表中 SEQIDNq: 1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5'端第1-24位碱基为5'端非翻译 区，自5'端第25-87位碱基为信号肽编码序列，自5'端第88-1176位碱基为成 熟蛋白编码序列，自5'端第613-621位碱基编码典型的甘露聚糖酶保守序列，自 5'端第1177-1327位碱基为3'端非翻译区。然后人工合成SEQ ID Na: 3中编码 硫色曲霉e-甘露聚糖酶成熟蛋白的基因片段(SEQIDNa: 3中自5'端第88-1176 位碱基)，并在5'和3'末端分别添加限制性内切fcoW I和JAa I酶切位点。
7、 硫色曲霉e-甘露聚糖酶基因毕赤酵母表达载体的获得 用限制性内切^bo7 I和J力a I对步骤1合成的基因进行双酶切后，将其连入
经相同酶双酶切的载体pPICzaA (Invitrogen)中a因子序列的下游，得到硫色 曲霉P-甘露聚糖酶基因的毕赤酵母表达载体，命名为pPIC-Mann。
8、 表达P-甘露聚糖酶的GS115-PIC-MA丽的构建
根据硫色曲霉e -甘露聚糖酶基因的核苷酸序列设计引物
mann-opt-F(5， -CCGGAATTCTTGCCAAAGGCTTC-3，,下划线为EcoRI酶切位点)和 mann-opt-Rn: (5， -ATAAGAATGCGGCCGCTTAAGCAGAATCAATAGCAG-3，，下划线为Not I 酶切位点)，以pPIC-manM为模板，按以下条件进行PCR反应95°C 5 min， 35 个循环(94°C 30 s， 55°C 30 s， 72°C 1 min)，最后72。C延伸10 min。反应结 束后，取PCR产物(5 uL)进行1%琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物(图l)。 图1中M:分子量标准；l和2: PCR扩增产物。回收PCR产物，用EcoRI/NotI双 酶切，纯化后与同样双酶切的表达载体pPIC9k连接，连接产物化学法转化大肠杆 菌Topl0感受态细胞，经过卡那霉素筛选获得重组表达载体pPIC9k-mann。
挑取酵母单菌落，接种至含有5mLYPD培养基试管中，28-30°C， 250-300 rpm 培养过夜。取50 PL的培养物接种至含有50 mL新鲜培养基的500 mL三角瓶中，
728-30°C， 250-300 rpm培养过夜，至0D600值达到1. 3-1. 5。将细胞培养物于4。C， 1500 g离心5 min，用500 mL冰预冷的灭菌水将菌体沉淀重悬。4°C， 1500 g离心 5 min，用250 mL冰预冷的灭菌水将菌体沉淀重悬。4°C， 1500 g离心5 min，用 20 mL冰预冷的l mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。4°C， 1500 g离心5 min， 用1 raL冰预冷的1 mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1. 5 mL。
将10 Pg用Sacl线性化的pPIC9K-mann溶解在5-10叱灭菌双蒸水中，与80 PL 的毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2 cm冰预冷的电转化杯中，将电转化 杯冰浴5 min后进行电击，电击条件为2.0kV、 5ms。电击完毕后，加入1 mL冰 预冷的l mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，转至50 mL离心管中，28。C温育2 h。 将菌体悬液涂布于MDS (0.67 g/100ml YNB， 1 g/100ml葡萄糖，1 mol/L山梨醇， 2 g/100ml琼脂)平板上，每100-200叱涂布一块平板，于3(TC培养2-3d，直至 长出清晰的菌落，获得的菌株命名为GS115/PICmann。
将10 Pg的线性化pPIC-manM溶解在5-10 ML灭菌双蒸水中，与80化的 GS115/PIQnann感受态细胞混匀，转至0. 2 cm冰预冷的电转化杯中，将电转化杯冰 浴5 min后进行电击。电击完毕后，加入l mL冰预冷的l mol/L的山梨醇溶液将 菌体混匀，转至50 mL离心管中，28'C温育2 h。将菌体悬液涂布于YPDS平板上 (lg/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖，1 mol/L山梨醇, 2g/100ml琼脂、100 Pg/mL Zeocin)，每100-200叱涂布一块平板，于30。C培养 2-3 d,直至长出清晰的菌落，获得的菌株命名为GS115-PIC-MANM。
GS115-PIC-MANM已于2009年04月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物 研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 3031。
二、 10升发酵罐发酵生产e-甘露聚糖酶
配制3LBMGY培养基(lg/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，1. 34g/100ml YNB， 4X10—5g/100mlbiotin， lml/100ml甘油，100 mM p朋.0磷酸盐缓冲液)，在 10 L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至28. 5°C。按10ml/100ml接种量将种子液(种 子液挑取GS115-PIC-MANM CGMCC No. 3031单克隆接入BMGY培养基摇瓶培养)加 入到装3L发酵培养基BMGY的10L发酵罐中，进行阶段培养，用氨水和磷酸调pH 至5.0，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于30%，发酵温度为28.(TC。当接入 种子液24 h后，甘油消耗完全(溶氧标记为100%)，进入流加25% (质量百分含量)甘油阶段，流速为60 mL/h。流加4-6 h后，将甘油消耗完全后(溶氧标记为 100%)，待湿菌重达到200 g/L时加入甲醇，开始诱导。进入甘油与甲醇混合流加 阶段，混合比例为9:1，流速为12 mL/h。通过调节转速、空气流量和甲醇速度控 制溶氧为30%以上，如不能保持在30%以上则停止甲醇添加，直至溶氧回升。12 h 后，将甘油与甲醇比例调至8:1。再过12h，比例调至6:1，并保持到最后，控制 溶氧为30%以上。在不同时间取样测定菌体量、酶活和蛋白含量，并对表达蛋白进 行12% SDS-PAGE电泳分析。甘露聚糖酶酶活的测定方法采用DNS法，在pH2. 4 和5(TC条件下，每分钟从底物半乳甘露聚糖(Sigma公司，货号G0753)中水解 产生l Wnol/L的甘露糖的所需的酶量定义为1个酶活单位，用U表示。蛋白质定 量采用BCA蛋白分析试剂盒(美国Pierce公司)进行。
12%SDS-PAGE电泳分析结果如图2所示，图2中M:蛋白质分子量标准；卜8: 重组菌株诱导0 h、 12 h、 24 h、 36 h、 48 h、 60 h、 72 h、 78 h和84 h的表达 产物。
10 L发酵罐中GS115-PIC-MA醒CGMCC No. 3031菌体浓度和P -甘露聚糖酶活 性变化如图3所示，图3中，a:甘油培养阶段；b:甘油补料培养阶段；C:甘油 和甲醇混合诱导阶段；(■):湿菌重；(▲) : 0-甘露聚糖酶活力，表明重组 菌GS115-PIC-MA醒CGMCC No. 3031 10升发酵罐的发酵活力最高可达到2300 U/mL， 蛋白表达量达到6 mg/mL，适合用于动物饲料添加剂使用。序列表
<110> 中国农业大学
<i2o>双拷贝e -甘露聚糖酶的基因工程菌及其应用
<160> 3
<210> 1
<211> 383
〈212〉 PRT
〈213〉 硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)
<400> 1
Met Lys Leu Ser Ser Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ser Leu Ala Leu Ala
15 10 15
Asn Leu Ser Thr Ala Leu Pro Lys Ala Ser Pro Ala Pro Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Ala Ser Thr Ser Phe Ala Ser Thr Ser Gly Leu Gin Phe
35 40 45
Thr lie Asp Gly Glu Thr Gly Tyr Phe Ala Gly Thr Asn Ser Tyr Trp
50 55 60
lie Gly Phe Leu Thr Asp Asp Ser Asp Val Asp Leu Val Met Ser His 65 70 75 80
Leu Lys Ser Ser Gly Leu Lys lie Leu Arg Val Trp Gly Phe Asn Asp
85 90 95
Val Thr Thr Gin Pro Ser Ser Gly Thr Val Trp Tyr Gin Leu His Gin
100 105 110
Asp Gly Lys Ser Thr lie Asn Thr Gly Ala Asp Gly Leu Gin Arg Leu115
Val Val Ser Ser
Asp Tyr 130
Asn Phe Val Asn Tyr 145
Ser Ala Tyr Gly Gly 165 Tyr
Trp 150
Ser
Ala 135 Thr
120
Glu Gin His Gly
125
Lys Leu lie lie
Met Gin Ser Ala 180
Ser Ala Val Phe
Asp Tyr Gly Asp Glu Thr Gin Thr Tyr
lie 140
Met Ser Ala Tyr
Gly 155
Phe Tyr Thr Ser
Asp 170
Lys Thr Val Val
Ser Asn Ser 195 Ser
Cys
Cys Pro 210 Ser Lys 225
Asp Glu Gly Phe
Asp
Phe lie Lys
Ala 200 Val
lie 185
Trp Glu Leu Ala
Glu 190 Glu
Asp 175 Arg
Pro
Leu
Thr Thr 215
Gly Leu Asp Ala 230
Leu Asn Thr Asp
Tyr Asp
Gly 245
Gly Leu Asn Phe
Asp
His 235 Asp
Trp 220 Met
Val
Cys
Gly Ser Tyr
Gin Phe Ala Glu 260
Ala Thr Leu His
Ser 250
Met Asn Leu Gly
lie Asp Phe 275 Trp
Thr 265
Tyr Pro Asp Ser
Asp Asp 290 Ala Ala Gly 305
His Cys Ser Val
Gly Asn Gly Lys
Pro
Cys 310 Ser
Trp 295 Leu
Pro
Leu 280
lie Ser Ala His
Gly 300
Gly Val Thr Ser
Glu 325
Asp Leu Phe
Leu Glu Glu Tyr 315
Thr Ala Leu Asn
Trp Trp
Gin
Gin 330 Tyr
Gly Val Ser Ala Asp Leu Phe Trp Gin 340 345 Gly Glu Ser Pro Asp Asp Gly Asn Thr lie
Thr 335 Ser
Val 160 Thr
Tyr
Arg
Asn 205
lie Glu Lys Thr
lie
Pro 255 Asp
Gly 240 Tyr
Thr
lie 270
Gly Thr Ser
Trp 285
Ala Ala Cys Lys
Asn 320 Thr
Thr
Gly Asp Asp Leu 350
Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp355 360 365
Tyr Glu Cys Leu Val Thr Asp His Val Ala Ala lie Asp Ser Ala 370 375 380
〈210> 2
<211> 1327
<212> 腿
<213〉 硫色曲霉(Aspergillus Sulphureus)
<400> 2
aatacagcca3gca肌cc3Cctctccagctccctcctcaccctggccagc60
ctggcgctggccaacctctccacggccctgcccaaagcctctcctgcacc￡L3gC3CC￡lgC120
3gcagcagcgcctccacctccttcgccagcacctcgggcctccaattcaccatcgacggc180
gaaaccggctacttcgccggaacgaacagttactggatcggtttcctgaccgacgactcc240
gatgtcgacctggtgatgagccacctgaagtcatccggcctcaaaatcctccgcgtatgg300
ggcttcaacgacgtcaccacgcagccctcttccggcacagtctggtaccaactgcaccag360
g3CggC3肌tcaaccatcaacactggcgccgacggtctccagcgcctcgactacgtcgtc420
tcctccgccg朋cagcacggcatcaaactcatcatcaacttcgtcaactactggaccgac■
tacggcggtatgtccgcgtacgtg3gcgceitatggcggatCCg3Cg3g3Cggatttctat540
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agtaactcctctgcggtatttgcgtggg站ttggcgaatgagccgagatgtcctagttgt660
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<210〉 3
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〈213> 硫色曲霉(A印ergillus Sulphureus)
〈400〉 3
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gaagaata_cggtgttacttctaaccattgttctgttgaat ctccatggca acaaactgct1020
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1、重组菌，是将两个拷贝的β-甘露聚糖酶基因导入酵母菌中获得的重组菌。
2、 根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于所述P-甘露聚糖酶基因的核苷 酸序列为GenBank DQ464114。
3、 根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于:所述酵母菌为毕赤酵母GS115。
4、 根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于所述重组菌的保藏编号为CGMCC No. 3031。
5、 一种生产e-甘露聚糖酶的方法，是用权利要求1至4中任一所述的重组菌发酵生产e-甘露聚糖酶。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述发酵培养基为BMGY培养基。
7、 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述发酵过程中溶解氧饱和 度第一次为100%时，流加甘油；所述发酵过程中溶解氧饱和度第二次为100%时，流 加甘油与甲醇的混合物。
8、 根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述甘油为质量百分含量25%的甘 油；所述甘油流加速度为6ml/h L;所述甘油与甲醇的混合物的流加速度为1. 2ml/ h * L。
9、 根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述发酵过程中溶解氧饱和度为 30%以上流加甘油与甲醇混合物；所述发酵过程中溶解氧饱和度为30%以下，流加甘油。
10、 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述甘油与甲醇的混合物中，甘 油与甲醇的的质量比为(6-9) :1。
全文摘要
本发明公开了一种双拷贝β-甘露聚糖酶的基因工程菌及其应用。该基因工程菌是将两个拷贝的β-甘露聚糖酶基因导入酵母菌中获得的重组菌。本发明还公开了生产β-甘露聚糖酶的方法，是用所述的重组菌发酵生产β-甘露聚糖酶。本发明的方法生产的β-甘露聚糖酶具有比活性高、酸稳定性好、催化pH值范围广等优点，适于用作猪、鸡等单胃动物的添加剂。
文档编号C12N1/19GK101560476SQ20091008328
公开日2009年10月21日 申请日期2009年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者曹云鹤, 李一航, 李德发, 王春林, 陆文清 申请人:中国农业大学