专利名称：基于免疫毛细管电泳-激光诱导荧光的基因组dna整体甲基化水平分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学检测技术领域，具体是一种基于免疫毛细管电泳-激光诱导荧光技术的 DNA整体甲基化水平高效、快速检测方法。
背景技术：
DNA甲基化是脊椎动物最重要的表观遗传修饰形式之一，对于哺乳动物胚胎的正常发育 具有重要作用，与基因表达调控、雌性个体X染色体的失活、遗传印迹等密切相关。异常 DNA甲基化可以对基因组产生负面的影响，与人类许多疾病相关，是癌症的重要标识。其中， 基因组整体低甲基化状态作为异常的DNA甲基化形式之一，在多种癌细胞中均可检测到， 可以影响染色体结构、增加染色体重组和突变的频率以及使原癌基因激活等，是癌症发生的 一个重要机制。
近年来随着DNA甲基化检测技术的快速发展，DNA甲基化与人类疾病的研究不断深入。 对基因组DNA整体甲基化水平的检测可以实现对癌症等疾病的诊断，研究各种环境污染物 的致癌机理等。近来DNA整体甲基化分析主要依靠高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE) 等检测手段，将基因组DNA酶解为单个核苷或碱基，检测甲基化胞嘧徒占总胞嘧啶的比例， 以此分析基因组DNA的整体甲基化水平。在这些检测方法中毛细管电泳-激光诱导荧光 (CE-LIF)具有灵敏度高，DNA用量少等优点，但样品制4过程中DNA酶解操作繁琐，且 需要对核苷进行化学修饰，限制了其对大规模以及特殊样品的分析。
本发明将毛细管电泳-激光诱导荧光技术的快速、高灵敏度等优势与免疫学方法的特异性、 准确性相结合，克服了传统检测方法的缺陷，实现对DNA整体甲基化水平的高效、快速检 测，适用于环境污染物对DNA甲基化影响的快速筛选及癌症等疾病的表观遗传学评估。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用免疫毛细管电泳-激光诱导荧光技术(immuno-CE-LIF)进 行DNA整体甲基化水平的检测方法。
本发明提供的DNA整体甲基化水平检测原理如图1所示，其具体检测方法依次包括以下 步骤
1) 待检测DNA与抗体结合反应；
2) 免疫毛细管电泳-激光诱导荧光技术分离检测DNA-抗体免疫复合物；3)对DNA-抗体免疫复合物进行定量分析，确定待测DNA中整体甲基化水平。
步骤l)所述抗体可以特异性识别甲基化胞嘧啶并与之结合，荧光染料可以标记于一抗， 也可以使用可与一抗结合的荧光标记二抗。
利用免疫毛细管电泳-激光诱导荧光技术进行DNA整体甲基化水平的检测方法为DNA 与抗体反应混合物进入毛细管，在电泳运行缓冲液中得以分离；荧光标记经过毛细管检测窗 口被激发光激发，产生的荧光信号由PMT检测，经过信号转换在色谱工作站中处理为毛细管 电泳谱图。若待检测DNA中没有甲基化胞嘧啶，则只能检测到荧光标记的抗体(或抗体复 合物)信号，在毛细管电泳谱图中只有抗体峰产生；若待检测DNA中含有甲基化胞啼捉， 则能够检测到抗体(或抗体复合物)信号以及DNA-抗体兔疫复合物信号，在电泳谱图中分 别显示抗体峰和DNA-抗体免疫复合物峰。
在色谱工作站中进行数据处理，对DNA-抗体免疫复合物峰面积进行积分，根据积分所 得峰面积确定待测DNA的整体甲基化水平。
本发明所提供的DNA整体甲基化水平的检测方法，具有DNA用量少，检测灵敏度高， 高效快速等优点，克服了传统检测方法DNA操作繁琐，检测时间长等缺陷，具有广泛的应 用前景。本发明可以应用于各种细胞、组织DNA的整体甲基化水平检测，天然产物、合成 药物、中草药中有效成分的筛选，环境污染物对生物体DNA整体甲基化水平影响的快速筛 选以及癌症等人类疾病的表观遗传学评估。
图l为immuno-CE-LIF技术检测DNA整体甲基化水平原理图2为对mM)NA中整体甲基化水平检测的immuno-CE-LIF电泳图3为不同浓度>DNA和m入DNA的immuno-CE-LIF检测结果；
图4为总XDNA中mXDNA比例不同时的immuno-CE-LIF检测结果；
图5为A549细胞基因组DNA整体甲基化水平immuno-CE-LIF电泳图6为不同浓度A549细胞基因组DNA的检测结果；
图7为A549细胞和HepG2细胞经不同浓度5-Aza-dC暴露后基因组DNA整体甲基化水平检 测结果。
具体实施方式
' 本发明的具体实施方法包括以下几个步骤
1、 DNA与抗体反应
将待测DNA与荧光标记的甲基化胞嘧啶特异性抗体反应，或待测DNA与甲基化胞嘧啶 特异性抗体和荧光标记的二抗反应，使待测DNA中甲基化胞嘧啶与抗体特异性结合，并带 有荧光标记。
2、 CE-LIFP分离检测DNA-抗体免疫复合物
反应混合物通过CE-LIF装置进行immuno-CE-LIF分析。DNA与抗体反应混合物进入毛 细管，在电泳运行缓冲液中进行分离。荧光标记经过毛细管检测窗口被激发光激发，PMT检 测到激发产生的荧光信号，经过信号转换在色谱工作站中处理为毛细管电泳谱图。
若待检测DNA中含有甲基化胞嘧啶，则能够检测在毛细管电泳过程中分离的抗体(或 抗体复合物)信号及DNA-抗体免疫复合物信号，电泳谱图中显示为两个峰，分别为抗体(或 抗体复合物)峰和DNA-抗体免疫复合物峰；若待检测DNA中没有甲基化胞嘧啶，则只能检 测到荧光标记的抗体(或抗体复合物)信号，电泳谱图中仅显示抗体峰。
3、 对DNA-抗体免疫复合物进行定量分析，分析待测DNA中整体甲基化水平
在色谱工作站中确定抗体(或抗体复合物)峰和DNA-抗体免疫复合物峰，对DNA-抗体 免疫复合物峰面积进行积分，根据目标免疫复合物的峰面积确定基因组DNA中整体甲基化 水平。 ，
下述实例中所用的DNA甲基化处理、细胞暴露及细胞基因组DNA提取方法均为常规实 验方法。
下述实例中采用甲基化处理的WDNA (m XDNA)是利用细菌来源的DNA甲基转移酶 M. I处理XDNA，使5J)NA中CpG位点的胞嘧啶完全甲基化，甲基化处理效果通过限制 性内切酶UI对入DNA进行酶切验证。
细胞暴露实验为利用不同浓度5-aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-dC)对A549细胞和HepG2 细胞进行72 h暴露，5-Aza-dC暴露浓度分别为0.01 ^M， 0. 1 一， 1 pM， 5 和10 jiM。
暴露结束后用基因组DNA提取试剂盒提取细胞基因组DNA，紫外分光光度计测定基因组 DNA浓度及纯度。 .
实施例1、 XDNA中整体甲基化水平的immuno-CE-LIF检测本实例采用一抗为鼠来源的5-甲基胞嘧啶单克隆抗体，可特异性识别单链DNA中的5-甲基胞嘧啶(5mC)并与之结合；Alexa Fluor 546荧光标记的Fc特异性抗IgGl的F (ab，) 片段为本实例用的二抗。待测ADNA经过95 。C处理5min,双链DNA变性为单链，冰上放 置10min以防止单链DNA复性，与上述一抗、二抗4'C过夜反应，形成DNA-抗体免疫复合 物。DNA与抗体的反应体系为20 pL，其中一抗和二抗浓度分别为1 pg/mL和2 ng/mL。
反应混合物通过在CE-LIF装置中进行分离，激发波长为543.5nm，检测波长为575nm。 本实例采用未涂敷的熔融石英毛细管，内径25pm，外径150nm，有效长度21 cm，总长27cm。 电泳运行缓冲液为lxTG(Tris30mM，甘氨酸160 mM， PH8.5)，样品缓冲液为2xTGA (Tris 14mM，甘氨酸108mM，醋酸10mM，PH 7.5)。CE-LIF分析的进样电压和时间分别为15 KV、 5 s，电泳分离电压为20KV。反应混合物进入毛细管电泳后，抗体复合物与DNA-抗体免疫 复合物在电泳运行缓冲液中得以分离；二抗所带的Alexa Fluor 546荧光标记经过毛细管检测 窗口被543.5 nm激发光激发，产生的荧光信号由光电倍增管(PMT)检测后经过信号转换在 色谱工作站中显示为电泳谱图。
3 ng/mL的m XDNA与抗体在4 。C过夜反应后，按上述条件进行immuno-CE-LIF分析。 附图2中谱图1、2和3分别为对抗体混合物，双链m XDNA-抗体反应混合物和单链m人DNA-抗体反应混合物的immuno-CE-LIF检测。谱图1显示峰1为抗体复合物峰，峰2由于可以 通过脱盐处理除去，认为主要是从二抗上脱落的荧光染料，比较谱图2和3，抗体只能与单 链DNA中的5mC反应，在谱图3中有明显的DNA-抗体免疫复合物生成(峰2)，但与染料 脱落峰有所重叠；而抗体与双链DNA反应则没有明显免疫复合物的生成，其电泳谱图与单 纯抗体相同，证明本实例所用抗体能识别单链DNA中5mC并与之结合形成免疫复合物。
改变与抗体反应的m XDNA浓度，按上述方法进行immuno-CE-LIF检测，同时以未甲基 化处理的XDNA作为阴性对照，检测未甲基化DNA与抗体是否存在交叉反应。mXDNA浓 度选择0 pg/mL, 0.1 pg/mL， 0.5 ng/mL， 1吗/mL， 2 ng/mL， 5 (ag/mL， lOpg/mL和25 pg/mL,以入 DNA浓度对应DNA-抗体免疫复合物峰面积作图，附图3显示随m X)NA浓度的升高，免疫 复合物峰面积增大，且mXDNA浓度在O.l pg/mL时即可检测到免疫复合物的存在，mXDNA 浓度为10pg/mL时检测到免疫复合物的量达到平台期，证明甲基化胞嘧啶与以一抗结合达到 饱和。与之相对应未甲基化JiDNA浓度达25ng/mL时仍没有明显的免疫复合物形成，证明本 发明所选用的一抗能特异性与甲基化胞嘧啶结合，与未甲基化胞嘧啶几乎不存在交叉反应。
改变m入DNA占总人DNA的比例，m J)NA/ (m J)NA+XDNA)分别为0%， 25%， 50%, 75%和100%，确定总XDNA浓度为1 ng/mL与抗体过夜反应，进行immuno-CE-LIF检测。附图4显示，mXDNA的比例与复合物峰面积存在较好的线性关系(R2=0.99)。
本实例证明immuno-CE-LIF实验可以有效地用于DNA整体甲基化水平的检测，具有 DNA用量少，灵敏度高，操作简便等优点。 '
实施例2、 A549细胞基因组DNA整体甲基化水平的immuno-CE-LIF检测
50 jig/mL的A549细胞基因组DNA变性为单链DNA，与5-甲基胞嘧啶单克隆抗体和荧光 标记二抗在4 。C过夜反应，按实例1所述条件进行immuno-CE-LIF分析。附图5为对A549 细胞整体甲基化水平的检测结果，电泳峰型与检测m XDNA的峰型相似，表明A549细胞基 因组DNA能够与抗体反应形成明显的DNA-抗体免疫复合物。附图6显示A549细胞基因组 DNA浓度在0-50 ng/mL范围内时进行CE-LIFP检测，DNA-抗体免疫复合物的量与DNA浓 度呈现较好的线性关系(R2=0.99)，实例表明本发明能够用于培养细胞基因组DNA整体甲基 化的检测。
实施例3、 CE-LIF检测5-Aza-dC对细胞基因组DNA整体甲基化水平的影响
不同浓度的5-Aza-dC对A549细胞和HepG2细胞暴露72 h后，分别其提取基因组DNA， 50pg/mL的细胞基因组DNA与抗体过夜反应，按上述方法进行immuno-CE-LIF检测。附图 7显示不同浓度5-Aza-dC对A549细胞和HepG2细胞基因组DNA整体甲基化水平的影响， 随着5-Aza-dC浓度的升高，细胞DNA整体甲基化水平呈下降趋势。在最高暴露浓度(IO pM) 下A549细胞和HepG2细胞基因组DNA整体甲基化水平分别下降64%和46%，且5-Aza-dC 暴露浓度为0.01 时对DNA整体甲基化水平的抑制(10。/p-20c/。)即可通过本发明检测得到， 进一步证明了本发明可以应用于基因组DNA整体甲基化水平的快速检测，实现各种药物中 有效成分的筛选及环境污染物对生物体DNA整体甲基化水平影响的快速分析。
权利要求
1、一种DNA整体甲基化水平的高效快速检测方法，其特征在于利用免疫毛细管电泳-激光诱导荧光技术进行检测。
2、 基于权利要求l所述，其检测依次包括以下步骤1) 待测DNA中甲基化DNA与抗体反应的选择性荧光标记；2) 免疫毛细管电泳-激光诱导荧光技术分离检测DNA-抗体免疫复合物；3) 对DNA-抗体免疫复合物进行定量分析，确定待测DNA中整体甲基化水平。
3、 基于权利2，甲基化DNA的抗体选择性标记包括两种方式1) 采用荧光标记的二级抗体标记可特异性识别甲基化DNA的一级抗体；2) 将可特异性识别甲基化DNA的一级抗体直接与反应性荧光染料反应，实现一级抗体 的直接荧光标记。
4、 基于权利3，其特征在于 一级抗体和二级抗体的荧光标记包括有机荧光染料、量子 点、荧光珠、稀土荧光分子等有荧光特性的材料。
5、 基于权利要求2所述，待测DNA包括1) 人和动物各种组织DNA，包括血液、心、肺、肝、肾、膀胱、消化道、脑、脊髓液、 精液等；2) 各种细胞DNA;3) 细菌DNA;4) 各种病人组织DNA。
6、 基于权利l所述的方法，其特征在于本发明可以用于DNA整体甲基化水平检测试 剂盒的发展。
7、 基于权利l、 2、 3、 4、 5和6所述的方法，其特征在于本发明可应用于天然产物、 合成药物、中草药中有效成分的筛选。 '
8、 基于权利l、 2、 3、 4、 5和6所述的方法，其特征在于本发明可应用于环境污染物 对生物体DNA整体甲基化水平影响的快速筛选；应用于癌症等人类疾病的表观遗传学快速 评估。
全文摘要
本发明涉及一种DNA整体甲基化水平的高效快速检测方法。本发明利用免疫毛细管电泳-激光诱导荧光技术实现对DNA-抗体免疫复合物的分离与检测，以此定量分析待测DNA中整体甲基化水平。本发明与传统DNA整体甲基化水平检测方法相比，无需重亚硫酸盐处理、DNA酶解及PCR扩增等步骤，具有操作简便快速、DNA用量少、检测灵敏度高等优势，可以实现对DNA整体甲基化水平的高效、快速检测，适用于各种生物样品的检测，环境污染物对DNA甲基化影响的快速筛选及对癌症等疾病的表观遗传学评估。
文档编号C12Q1/68GK101638689SQ20091009231
公开日2010年2月3日 申请日期2009年9月10日 优先权日2009年9月10日
发明者汪海林, 王晓利 申请人:中国科学院生态环境研究中心