专利名称：一种抗持留状态结核分枝杆菌的药物筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种药物的筛选方法，具体地，涉及抗持留状态结核 分枝杆菌药物的筛选方法。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌^6ercw/a^)引起的一 种严重危害人类健康的慢性传染性疾病。长期以来，人们对抗结核病 的主要手段就是运用抗生素进行化学治疗，这种治疗手段一度有效地 控制了结核病在世界范围内的传播和蔓延。然而近年来，原本已被有 效控制的结核病大有卷土重来之势，其发病率和死亡率均明显回升， 已成为与艾滋病、疟疾并称的传染病。结核病死灰复燃的原因很多， 包括人口流动性加大、HIV感染者增多以及多重耐药菌不断出现等。 除此之外，结核病难以彻底治愈、容易复发，还与结核分枝杆菌能够 以"持留"状态长期存在有密切关系。
感染人体的病原菌根据其与宿主细胞的关系可以分为胞外感染 菌和胞内感染菌两类，结核分枝杆菌就属于后者。当其入侵机体后， 巨嗡细胞可以将其吞噬并形成"吞噬体"。 一般说来，吞P藍体形成后 会与溶酶体迅速融合，由溶酶体产生的各种酶将其消化。而结核分枝
杆菌在被巨噬细胞吞噬后，可以通过自身产生并分泌的一些物质，阻 止吞噬体的成熟及其与溶酶体的融合，从而使其自身免遭转运至溶酶 体最终被降解的命运，而在巨噬细胞内长期存留下来。此时的结核分 技杆菌，代谢活动降至最低，生长繁殖几乎停止，不易被抗菌药物杀 灭，这种类似于休眠的长期存活状态被定义为"持留"状态，这种状 态的结核分枝杆菌被称之为持留菌，这是结核分枝杆菌逃避宿主免疫 系统的进攻和抵抗药物作用的一种手段。当机体免疫力下降，如被 HIV感染、服用抗炎药物或免疫抑制剂后，持留状态的细菌又可恢复结核杆菌之所以可以形成持留状态长 期存活，其原因是复杂的，涉及多方面的机制。近年来的研究表明，
这种状态的形成和维持，与其产生的蛋白激酶G(PknG)---种丝氨
酸/苏氨酸蛋白激酶有密切关系。
结核分枝杆菌基因组共编码11种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分别 命名为PknA B、 PknD L。它们与真核生物的丝氨酸/苏氨酸蛋白激 酶一样可以催化底物蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化。其中， PknG可以介导结核菌持留状态的形成和维持。巨噬细胞在吞噬外来 的病原微生物后形成初级吞噬体，初级吞噬体经过与胞内其他囊泡的 一系列融合过程，特别是与溶酶体融合后，最终形成吞噬溶酶体，通 过其中的水解酶类将吞入的病原菌消化，这一系列过程称为吞噬体的 成熟。吞噬体的成熟过程涉及巨噬细胞内的多条信号传导通路，每条 通路都受到胞质内的一些酶或者蛋白因子调控。PknG通过使胞质内 某些与吞噬体成熟有关的关键蛋白质磷酸化来阻断吞噬体的成熟过 程，从而使被吞入的结核菌免遭降解的命运，在巨噬细胞内长期存活 下来，而;^2G基因突变的菌株则不能以持留状态在宿主细胞内存活。
鉴于PknG对于结核分枝杆菌持留状态的形成和维持有如此重要 的作用，若能找到针对PknG特异而有效的抑制剂，则可以抑制结核 分枝杆菌的持留，从而为解决结核长期潜伏性感染这一难题打下基 础。
发明内容
本发明的目的是提供一种筛选抗持留状态结核分枝杆菌 药物的方法，具体地讲是一种以PknG为靶点，通过体外筛选 PknG抑制剂来筛选抗持留状态的结核分枝杆菌药物的方法。
本发明通过将待测样品与PknG接触，筛选能够抑制PknG 活性的待测样品，即为抗持留状态结核分枝杆菌的药物。
具体地说，将待测样品适当稀释后加入到如下反应体系中作为样反应物
Hepes
ATP
PEP
NADH
PknG
丙酮酸激酶 乳酸脱氢酶
终浓度
50 150mM
25 75mM
0.5 1.5mM
0.5~1.5mM
l 3(ig/100(al
0.5 1.5U/100(xl
0.5~1.5U/100|il
同时以不添加待测样品组作为阴性对照，与阴性对照组相比单位 时间内OD34o值的变化越小，则对PknG的抑制率越高。待测样品的 终浓度可以是25 75mg/ml，可以根据具体的检测对象稀释到不同的 浓度，例如可以设置多个浓度梯度来考察待测样品对PknG的抑制。
优选的所述反应体系如下
反应物终浓度
lOOmM
ATP50mM
PEPImM
NADHImM
PknG2吗/100(xl
丙酮酸激酶lU/lOO^l
乳酸脱氢酶lU/100|il 。
步设置阳性对照组，所述阳性对照组添加等体积的ddH20代替PknG,抑制率设为100%。
待测样品对PknG的抑制率可通过如下方法计算:
抑制率IR =
△N-AS AN-AP
Xl00%:
其中，AN是阴性对照平均每分钟吸光值的变化量；AP是阳性对 照平均每分钟吸光值的变化量；AS是样品平均每分钟吸光值的变化 量。
本发明具体可通过如下步骤进行筛选由遗传工程大肠杆菌生产 重组PknG —对重组PknG酶活性进行检测—PknG抑制剂的筛选1. 由遗传工程大肠杆菌生产重组PknG:
(1) 将结核分技杆菌编码蛋白激酶G的基因/ &G克隆到 原核表达质粒pET30a中，构建重组质粒pET-;^"G，测序确定 所构建的质粒基因序列和插入方向的正确性；
(2) 用质粒pET-;^7G转化大肠杆菌B121(入DE3),筛选可 以通过IPTG诱导高效表达重组PknG的工程菌株；
(3) 对步骤(2)筛选得到的工程菌株进行大量培养，裂解 培养物，釆用Ni +亲和层析柱，通过亲和层析的方法纯化目的 蛋白得到重组PknG的纯酶。
2. 对步骤1得到的重组PknG酶活性进行检测
(1) 检测的原理 由于PknG具有自我嫌酸化的功能，可以催化将ATP上的嫌
酸基团添加到自身的丝氨酸/苏氨酸残基使之嫌酸化，因此检
测其催化活性时无需加入外源的底物蛋白，反应式如下
① 未磷酸化的PknG + ATP歸 > 磷酸化的PknG + ADP
② 后续检测步骤如下
ADP +辚酸烯醇式丙酮酸目1^, >ATP +丙酮酸 丙酮酸+ NADH + lT乳酸脱氢酶> NAD、乳酸
伴随着NADH到NAD +这一反应的进行，反应体系在
340nm波长下的光吸收值会不断降低，其数值可通过分光光
度计或酶标仪测得。因此本实验通过检测反应体系在340nm
波长下的光吸收值变化来反映体系中ADP的生成量，进而反
映出PknG的催化活性大小。
(2) 酶活测定的具体反应体系及步骤
酶活测定体系
反应物 终浓度
H印es ' 100mM ATP 50mM PEP lmM
7NADH ImM PknG 2|ig/100jal 丙酮酸激酶 lU/lOOjul 乳酸脱氢酶 lU/100^1
具体步骤如下
①酶活测定体系中的各组分混合后加入96孔板中，每孔反应体系总 体积为lOOpl (不足100pl用ddH20补足);阳性对照组不加酶，以相 同体积的ddH20代替。
1 96孔板置于酶标仪中，在25"C状态下测定各孔在340nm处光吸 收值，每隔2min测定一次，连续测定20次(即反应40min)。 (3)结果分析
反应结東后，分别计算实验组(加酶)与阳性对照组(不加酶)在单位 时间(如lmin)内OD34o变化量，计算式如下 AOQWmii^(反应结東时的OE^o值-反应开始时的OE^o值)/反应时间 阳性对照组由于未加PknG,其反应体系中ATP转化为ADP的 量极少，所以其光吸收值变化量也很小。通过比较实验组(加酶)与阳 性对照组(不加酶)AOD34。/min值相差的倍数可以反映出PknG酶活 性的大小，相差倍数越多说明PknG酶活性越强。 3. PknG抑制剂的筛选流程 (1)样品制备
① 化合物纯品取纯品化合物溶到DMSO中，加DMSO倍比稀 释，取稀释液作用于检测。
② 发酵液样品菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物种入盛有 发酵培养基的瓶中，摇床培养4-5曰。所得发酵液可直接用于检测， 亦可取发酵液用丙酮抽提，挥干后，用DMSO溶解。取溶液加DMSO 倍比稀释，再取稀释液作用于检测。
(2)样品活性检测 依照步骤2(2)中的反应体系配制，分为阴性对照组、阳性对照组 和实验组① 阳性对照组反应体系中不加PknG，以等体积的ddH20代之。 抑制率设为100%,该组表征PknG的活性被完全抑制。
②
阴性对照组加DMSO代替样品于反应体系中，该组表征PknG 的正常催化反应过程。
③C、样品实验组加待筛选的样品于反应体系中，该组表征 待筛选样品对PknG活性的抑制程度。 将上述各组反应体系分别混匀后加入同 一块96孔板中，置于25 'C下反应。每隔2分钟在酶标仪检测各孔反应体系在340nm波长处
的吸光值OD34o(若酶标仪本身具备控温功能，可直接在酶标仪内进行
反应)，连续检测々0min。 (3)检测结果的分析
结果分析方法与步骤2(3)的"结果分析"相同，计算各反应孔
的△ OD340/min。
抑制率计算抑制率1仗==><100%
△N-AP
其中
AN是阴性对照孔平均每分钟吸光值的变化量。 AP是阳性对照孔平均每分钟吸光值的变化量。 AS是样品孔平均每分钟吸光值的变化量。
本发明方法通过考察样品对PknG的抑制作用来筛选获得抗持留 状态的结核分枝杆菌药物。结果表明，利用本发明方法筛选得到的 16株阳性菌株，其发酵液样品均对PknG具有抑制作用物质。筛选还 得到阳性化合物1个，IMB2036F2对PknG的抑制率达64.0%其对 BCG在巨噬细胞内持留作用具有一定的抑制作用。。
图1为实施例1中构建的原核表达质粒pET-; ^G。下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。这些实施例仅用于 说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。实施例1原核表达质粒的构建以结核分枝杆菌綺co6"c^7^m ^&n^/a^ H3 7Rv基因组DNA 为模板，用PCR法扩增p^G基因全序列。引物序列为上游引物5，TGGACATATGGCCAAAGCGTCAGAG 3;下游引物5' TCGCTCGAGATAGAACGTGCTGG 3，(下划线所示为Ndel和Xhol的酶切位点)。PCR反应体系如下5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) 10|aldNTP Mixture (各2.5mM) 一Forward Primer (20pM) 1 (ilReverse Primer (20pM) 1模板(70ng&l) 1^1PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5U/jal) 0，无菌ddH20 32.5nl总体积 50^1PCR反应程序如下 98 °C变性 10s 60°C复性 15s 「35个循环 72 °C延伸 3min 」扩增产物经验证后，插入到原核表达载体pET30a (Novagen)的多克隆位点(Ndel和Xhol)，得到质粒pET-pknG,测序验证所构建质粒的正确性。实施例2 ;^:"G基因的诱导表达将实施例1中构建的重组质粒pET卞^G转化大肠杆菌 B121(XDE3)感受态细胞。将含有pET-;^nG的大肠杆菌B121接种于含 50吗/ml Kan的LB培养基中，37°C 200rpm振荡培养至培养液变浑浊10后，按1: 100的比例将上述培养物转接于含50|ig/ml Kan的新鲜LB培养基中，37°C 200rpm振荡培养至OD60()=0.6左右。向培养物中加入IPTG至终浓度为lmM，转入28。C 200rpm继续振荡培养3-5h,离心收获诱导表达后的菌体。实施例3 PknG蛋白的分离纯化将实施例2中收获的菌体用裂解缓冲液震荡重悬，以400W功率 超声波裂解菌体，15000g离心30min以除去细胞碎片等杂质。由于 诱导表达的重组PknG带有His-tag,因此用HisTrap HP镍离子亲 和层析柱作为纯化介质，通过AKTA explorer系统对PknG蛋白进行 分离纯化。纯化后的蛋白经脱盐后于-8(TC冻存。 实施例4 样品制备化合物样品10mg纯品化合物溶到lml DMSO中，取10|ul加 10plDMSO倍比稀释，取l)il作用于lOOjul反应体系，使其终浓度为 50|ig/ml。发酵液样品菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物种入盛有 50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28°C、 l卯转/分旋转摇床培养 4天。取10ml发酵液用10ml的丙酮抽提，挥干后，用lml的DMSO 溶解。取10pl加10pl DMSO倍比稀释，取lpl作用于100pl反应体系。实施例5 样品活性检测配制如下反应体系(每孔反应体系总体积为lOOpl)反应物终浓度lOOmM50mMNADHPknG丙酮酸激酶 乳酸脱氢酶2|ig/100(allU/100^1lU/100(il按以下分组向反应体系中添加组分A. 阴性对照组加入lplDMSO(若筛选发酵液样品，此处以lyl抽提后的发酵培养基代之，抽提过程同"样 品制备"中的发酵液样品抽提过程)B. 阳性对照组添加等体积的ddH20代替PknG。C. 样品实验组加入lpl待测样品 将上述各组反应体系分别混匀后加入同一块96孔板中，置于BMG公司的Polarstar酶标仪内，开启温控为25。C进行反应。以反应 起始时间为0时刻，每隔2分钟检测一次各孔反应体系在340nm波 长处的吸光值OD34。，连续检测40min(20次)。结果分析分别计算各孔的△ OD34Q/min，再依公式抑制率IR= ^^xl00%计算各孔的抑制率。AN-AP筛选结果为从组合化学库、微生物次级代谢产物库以及天然产 物库中共筛选4820个样品，其中2300个化合物，2520个发酵液样品， 初筛阳性率63/4820=1.3%,复筛阳性率16/4820=0.3%。(以抑制率大 于50%为筛选阳性标准。初筛和复筛均釆用上述方法，初筛筛选出全 部具有抑制作用的化合物，复筛以抑制率大于50%的为阳性。)活性 化合物1个为IMB2036F2,抑制率为64.0%。实施例6抗持留状态的结核分枝杆菌药物检验(1)人单核巨噬细胞系THP-1的培养及诱导分化THP-1细胞复苏后，在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基 中，于37。C 5。/。C02的培养箱中培养。传至2-3代后，取对数生长期 生长状态良好的细胞，调整细胞浓度为5xl()S个/m1,接种于24孔培 养板中，每孔0.5ml。加入终浓度为100ng/ml的佛波酯(PMA)诱导24h， 24h后可见细胞由悬浮状态转变为贴壁状态，细胞有伪足伸出，表明(2) 卡介苗(BCG)的培养及菌悬液制备BCG在含有0.05% Tween-80的7H9液体培养基中，于37°C 200rpm培养至对数生长期。离心收集菌体，加少量含0.05%Tween-80 的无菌生理盐水，用研钵适度研磨使聚集生长的菌体分散，再加RPMI 1640培养基稀释成菌悬液，计算细菌浓度。(3) BCG感染THP-1细胞按照细菌数细胞数=50: l的比例，向诱导分化后的THP-1细 胞中添加BCG菌悬液，于37。C 5。/。C02的培养箱中培养，使BCG感 染巨嗟细胞。感染4h后，弃去细胞培养基，并用无菌PBS洗涤细胞 3遍，更换新鲜培养基并加入终浓度为100pg/ml的卡那霉素(此时设 为感染Oh)作用4h以除去未被吞噬的细菌。之后更换为含30(ig/ml 卡那霉素的培养基，并加入实施例5中筛选得到的阳性化合物或发酵 液样品，继续培养。同时，以等量的DMSO代替样品作为阴性对照。(4) BCG在THP-1细胞内存活状况的检测分别于感染24h、 48h,以1%的Triton X-100裂解细胞10min。 取裂解物用PBS缓冲液以十倍梯度稀释成适当浓度，分别涂布于 7H11琼脂平板上，37'C培养20d后计数每个平板的菌落数，从而计 算细胞裂解物中的BCG的CFU。结果显示，阴性对照组24h、 48h 的细胞裂解物的CFU无明显差异；而加入阳性样品的实验组，48h 细胞裂解物的CFU明显少于24h细胞裂解物的CFU,前者约为后者 的1/4 2/3，特别是抑制率大于50%的阳性样品，前者约为后者的 1/2 3/4。由此可见，实施例5中筛选得到的阳性样品确实有抑制BCG 在巨噬细胞内持留的作用。<110〉中国医学科学院医药生物技术研究所 <120〉 一种抗持留状态结核分枝杆菌的药物筛选方法 <130> KHP09113071,2 <歸 2〈170> Patentln version 3. 5<210> 1<211〉 25〈212〉 DNA 〈213〉人工序列<400> 1tggacatatg gcc朋agcgt cagag 25<210> 2<211〉 23<212> DNA 〈213〉人工序列<400〉 2tcgctcgaga tagaacgtgc tgg 231权利要求
1、一种筛选抗持留状态结核分枝杆菌药物的方法，其特征在于，将待测样品与PknG接触，筛选能够抑制PknG活性的待测样品，即为抗持留状态结核分枝杆菌的药物。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，将待测样品适当稀 释后加入到如下反应体系中作为样品实验组反应物H6p6SATP PEP NADH PknG丙酮酸激酶 乳酸脱氢酶终浓度50 150mM25~75mM0.5 1.5mM0.5 1.5mMl 3|ig/100|il0.5~1.5U/100jil0.5~1.5U/100pl同时以不添加待测样品组作为阴性对照，与阴性对照组相比单位时间内OD34。值的变化越小，则对PknG的抑制率越高。
3、如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述反应体系如下 反应物ATP PEP NADHPknG丙酮酸激酶 乳酸脱氢酶终浓度lOOmM50mMImMImMlU/100|il
4、如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，其还设置有阳性对照组，所述阳性对照组以等体积的ddH20代替反应体系中的PknG，抑制率设为100%,待测样品对PknG的抑制率的计算方法是抑制率111=^^><100%， AN-AP其中，AN是阴性对照孔平均每分钟吸光值的变化量；AP是阳性对照孔平均每分钟吸光值的变化量；AS是样品孔平均每分钟吸光值 的变化量。
5、 如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述待测样品 的终浓度为25~75mg/ml。
6、 一种抗持留状态结核分枝杆菌的药物，其含有按照权利要求 1~5任一所述方法筛选得到的PknG抑制剂。
全文摘要
本发明公开了一种抗持留状态结核分枝杆菌药物的筛选方法，其通过将待测样品添加至酶活测定体系中，利用酶标仪检测反应体系光吸收值的变化来判断样品对蛋白激酶G活性的抑制作用，从而筛选出抗持留状态结核分枝杆菌的药物。本发明的筛选方法选择蛋白激酶G作为靶点，与以往抗结核药物主要针对于生长繁殖活跃的细菌不同，本发明针对的是以持留状态在宿主细胞内长期存在的细菌，目的是解决结核分枝杆菌长期潜伏性感染的难题。
文档编号C12Q1/48GK101643774SQ20091009216
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月3日 优先权日2009年9月3日
发明者余利岩, 山 岑, 张玉琴, 邵天舒, 彬 黄 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所