专利名称：一种靶向冠状病毒蛋白酶的药物筛选模型及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程类检测产品及其应用。
背景技术：
冠状病毒是导致呼吸道感染的主要病毒之一。目前引起人类呼吸道感染的冠状 病毒已达五种，229E，OC43，SARS-CoV, NL63和HKU1。人类呼吸道感染中约30% 由229E和OC43两种冠状病毒引起；SARS-CoV是2003年初新出现的引起人类急性呼吸 道综合症(SARS)的一种高致病性呼吸道病原，感染死亡率约9%，是目前感染性和致病 性最强的一种新发人类冠状病毒。随后的三年内又从呼吸道感染病人中相继发现了两种 人类新型冠状病毒NL63(2004年)和11尺111(2005年)。可以预测，许多不明原因的呼吸 道感染可能是由其他未发现的人类新型冠状病毒引起。目前，临床上还没有治疗冠状病毒引起呼吸道感染的特异性治疗药物，针对个 别冠状病毒的疫苗研究(如SARS灭活疫苗)仅在进行中。冠状病毒引起的呼吸道感染尤 其儿童呼吸道感染是一种常年(春秋季为主)频发性传染病，对人类健康构成巨大威胁， 严重影响生活质量，对医疗卫生和疾病防治工作形成巨大压力。特异性抗冠状病毒病毒 药物具有巨大市场应用潜力。蛋白酶在冠状病毒复制周期中具有重要功能，是抗冠状病毒药物研究的重要靶 蛋白。冠状病毒感染细胞后，基因组(+)RNA首先翻译形成la/labdab由Ia经-1移 码翻译形成)多聚蛋白(polyprotein)。Ia蛋白含有木瓜样蛋白酶(papain-like protease, PLP)和3CLpro蛋白酶。Ia(Iab)蛋白在PLP和3CLpro病毒蛋白酶作用下，加工裂解成 16个非结构蛋白(nspl_nspl6)。nspl nspl6主要定位于细胞内质网膜(ER膜)中，与 ER膜相互作用形成病毒复制酶复合体(Replicase Complex，RC)，参与病毒基因组复制和 亚基因组RNA (subgenomic RNA, sgRNA)转录。最后，由病毒SgRNA翻译形成的结构 蛋白(S，M，N，HE)和基因组复制形成的子代基因组RNA，组装成新生病毒粒子，完 成病毒复制周期。从冠状病毒复制过程可以发现，病毒蛋白酶PLP和3CLpro在冠病毒 复制酶复合体(RC)形成和病毒RNA复制和转录过程中具有重要作用，是冠状病毒完成 复制周期的关键蛋白，是目前最受关注的一种重要抗冠状病毒药物靶标。药物筛选模型是抗冠状病毒药物研究的关键技术之一。目前的研究现状是，首 先，在靶标选择上主要集中在冠状病毒的3CLpro蛋白酶。其次，药物筛选模型主要有两 种。一是基于3CLpro蛋白酶对冠状病毒复制酶多聚蛋白的裂解特性，建立的体外分子水 平筛选模型；这种模型仅能反映病毒蛋白酶体外活性。二是病毒感染的细胞模型作为药 物筛选模型。病毒感染的细胞模型，对SARS-CoV等高致病性病毒必需使用BSL3实验 室，对实验人员危险性大，操作不方便，且有病毒泄漏的危险。
发明内容
本发明的目的是提供基于细胞(Cell-based assay)的靶向冠状病毒蛋白酶新型药物筛选模型。冠状病毒多聚蛋白Ia(Iab)加工产物中nsp3，nsp4和nSp6含有转膜(TM) 结构域，这些转膜结构域可介导蛋白质定位于细胞内质网(ER)膜上。本发明利用nSp3， nsp4和nsp6含有转膜结构域和在细胞内定位等特征，使用分泌性报告基因，构建由冠状 病毒蛋白酶-蛋白酶识别位点-分泌性报告基因组成的真核表达DNA构建体，转染细胞 后既可用于抗冠状病毒药物的筛选。
具体的说，本发明构建了一种靶向冠状病毒PLP蛋白酶的药物筛选模型克隆 冠状病毒的PLP-TM片段到真核表达载体中，在PLP的N段带上PLP识别的nsp2/3位点 氨基酸序列-FTKLAG丨GK-，再把分泌型报告基因克隆到真核表达载体中PLP-TM片段 的5’端，获得冠状病毒蛋白酶-蛋白酶识别位点-分泌性报告基因组成的真核表达DNA 构建体，将该DNA重组质粒转染细胞，既可用于筛选靶向冠状病毒PLP蛋白酶的药物。
本发明还构建了一种靶向冠状病毒3CLpro蛋白酶的药物筛选模型克隆冠状病 毒的nsp4-nsp5 (3CLpro)或nsp5 (3CLpro) _nsp6片段到真核表达载体中，在nsp5的N端 或C端带上3CLpro识别位点氨基酸序列-GVNLQ丨SGKVI-，再把分泌型报告基因克隆 到真核表达载体中nsp4-nsp5 (3CLpro)或nsp5 (3CLpro) _nsp6片段的3，端或5，端，获 得冠状病毒3CLpro蛋白酶-蛋白酶识别位点-分泌性报告基因，将该DNA重组质粒转染 细胞，既可用于筛选靶向冠状病毒3CLpro蛋白酶的药物。
本发明还构建了一种靶向冠状病毒PLP和3CLpro蛋白酶的双靶标(dual-targets) 药物筛选模型将冠状病毒PLP蛋白酶-蛋白酶识别位点-分泌性报告基因DNA构建体 和冠状病毒3CLpro蛋白酶-蛋白酶识别位点-分泌性报告基因DNA构建体共转染Hela 细胞，既可用于筛选靶向两种蛋白酶的药物。
发明中使用的分泌性报告基因可以是任何具有分泌性表达性能的报告基因，如 碱性磷酸酶SEAP报告基因和分泌性荧光素酶报告基因等。在本发明提供的一个实施例 中，利用碱性磷酸酶SEAP报告基因实现了发明目的，在检测该活性产物时不需要制备细 胞裂解物，只要收聚细胞培养液上清即可。
本发明的另一目的是提供基于该模型的药物筛选方法在转染后得到的细胞模 型中加入不同浓度的待筛选化合物，于不同时间点收聚上清，用化学发光技术检测上清 中的报告基因活性，计算给药后报告基因活性变化，判断待测化合物抑制蛋白酶(抑制 其中一种或同时抑制两种)活性效果，选择出候选药物。通过多时间点收集细胞培养上 清可以动态检测冠状病毒蛋白酶活性，用多孔板(96或384孔板)形式可以实现冠状病毒 蛋白酶活性的高通量检测。该方法原理是利用转染细胞中的冠状病毒蛋白酶切割活性， 释放报告基因表达产物并分泌到细胞上清中，通过细胞上清中报告基因活性来检测冠状 病毒蛋白酶活性，用于冠状病毒药物筛选。
本发明的优点表现在(1)特异性基于病毒蛋白酶酶解机制；(2)真实性 细胞水平上的筛选模型；(3)高通量以分泌性报告基因作为筛选标记，可以实现高通 量快速、动态筛选；(4)安全性对SARS-CoV等高感染性病毒，避免了接触活病毒和 使用BSL3实验室引起病毒感染的危险。
图1为NL63冠状病毒nsp3，nsp4和nsp6蛋白的转膜(TM)结构域。PLPl和PLP2指木瓜样蛋白酶的两个酶活性功能结构域，TM指蛋白转膜结构域。图2为靶向冠状病毒PLP蛋白酶的药物筛选模型。SEAP指分泌性报告基因，PLP2为木瓜样蛋白酶，TM指蛋白转膜结构域图3为靶向冠状病毒3CLpro蛋白酶的药物筛选模型。Nsp4指冠状病毒非结构 蛋白，3CLpro指冠状病毒3CLpro蛋白酶，SEAP指分泌性报告基因。图4为本模型中SEAP活性高通量检测实验流程。图5为靶向冠状病毒蛋白酶的双靶标药物筛选模型。图6为靶向冠状病毒蛋白酶的药物筛选模型验证。
具体实施例方式1.靶向冠状病毒PLP蛋白酶的药物筛选模型克隆NL63的PLP2-TM片段到载 体 pcDNA3.1-V5/His B 中(Xho I and Apa I)。在 PLP2 的 N 段带上 PLP2 识别的 nsp2/3 位点氨基酸序列-FTKLAG丨GK-。 以SEAP-basic vector (Clontech)为模板，PCR获得 SEAP片段(5，端带上EcoR I和Kozak序列以及SEAP的ATG，3，端带上XhoI)，克隆 到 pcDNA-V5/HisB 中 PLP2-TM 片段的 5，端，获得 5，-SEAP-PLP2-TM-3，DNA 构建 体(pcDNA-SEAP-PLP2-TM)。将该DNA重组质粒转染Hela细胞，在转染后12h，24h， 36h，48h和60h各时间点收聚50μ1上清。用化学发光技术(ChemiluminescentAssay)(试 剂为 Great EscAPe SEAP Chemiluminescent andFluorescence Detection Kits，Clontech 公司) 检测上清中的SEAP活性。为了证实PLP2发挥活性时能将SEAP释放到上清中，将 pcDNA-SEAP-PLP2-TM DNA中PLP2蛋白酶催化性关键氨基酸进行突变(C1678A)。将 野生型和突变体分别转染Hela细胞，在转染后12h，24h，36h，48h和60h各时间点收聚 50 μ 1上清，按上述方法检测SEAP活性。2.靶向冠状病毒3CLpro蛋白酶的药物筛选模型克隆NL63的 nsp4-nsp5 (3CLpro)片段到 pcDNA3.1_V5/His B 中(5，端带上 EcoR I 和 Kozak 序 列以及ATG，3’端带上Xho I)。 在nsp5的C段带上3CLpro识别位点氨基酸 序列-GVNLQ I SGKVI-。 以 SEAP-basic vector (Clontech)为模板，PCR 获 得SEAP片段(5，端带上XhoI，3，端带上ApaI)，克隆到pcDNA_V5/HisB中 nsp4-nsp5(3CLpro)片段的 3，端，获得 5，-nsp4-nsp5 (3CLpro) -SEAP 3' DNA 构建体 (pcDNA-nsp4-nsp5-SEAP)。将该DNA重组质粒转染Hela细胞，在转染后12h，24h， 36h，48h和60h各时间点收聚50μ1上清。用化学发光技术(ChemiluminescentAssay)(试 齐Ll为 GreatEscAPe SEAP Chemiluminescent and Fluorescence Detection Kits，Clontech 公司) 检测上清中的SEAP活性。为了证实3CLpro发挥活性时能将SEAP释放到上清中，将 pcDNA-nsp4-nsp5 (3CLpro)-SEAP DNA 中 3CLpro 蛋白酶(nsp5)的催化性关键氨基酸进 行突变(H41A)。将野生型和突变体分别转染Hela细胞，在转染后12h，24h，36h，48h 和60h各时间点收聚50 μ 1上清，按上述方法检测SEAP活性。3.靶向冠状病毒PLpro和3CLpro蛋白酶的双靶标(dual-targets)药物筛选模型 将 DNA 重组质粒 pcDNA-SEAP_PLP2-TM 和 pcDNA-nsp4_nsp5 (3CLpro) -SEAP 共转染Hela细胞，在转染后12h，24h，36h，4Sh和60h各时间点收聚50 μ 1上清。应用于药 物筛选时，在转染后加入不同浓度的待筛选化合物，在转染后12h，24h，36h，4Sh和 60h各时间点收聚50 μ 1上清。用化学发光技术(Chemiluminescent Assay)(试剂为Great EscAPe SEAP Chemiluminescent andFluorescence Detection Kits, Clontech 公司)检测上清 中的SEAP活性，计算给药后SEAP活性变化，判断待测化合物抑制蛋白酶(抑制其中一 种或同时抑制两种)活性效果。然后再应用上面( 和(3)中的单靶标药物筛选模型证 实待测化合物对哪种蛋白酶(或两种)具有特异性抑制作用。
4.模型验证
蛋白酶活性验证时， 将pcDNA-SEAP_PLP2-TM和 pcDNA-nsp4-nsp5 (3CLpro) -SEAP以及相应的突变体转染Hela细胞，48小时后收聚上清，制备细胞裂解液。用Western Blotting对上清和细胞裂解液中的前体蛋白和蛋白酶 加工产物进行检测。对nsp4和nsp5检测，我们已制备了针对这两种产物的兔多克隆抗 体。由于所有重组体蛋白的C端与V5短肽融合，C端加工产物可以用商用抗V5抗体 (Invitrogen)进行检测。
应用阳性冠状病毒蛋白酶抑制剂验证模型时，将PLP2抑制剂应用我们基于 SARS PLPro高级结构设计的并在体外病毒感染细胞模型中证实具有明显抗病毒活性的 化合物 GRL0346。3CLpro 抑制剂使用文献报道的 Cinanserii^SQ 10，643) (Chen L.，et al.J.Virol.2005Jun ； 79(11) 7095-103)或者其他 3CLpro 抑制剂(Blanchard JE.et al.Chem Biol.20040ct ； 11(10) 1445-53)。
将pcDNA-SEAP_PLP2-TM 和 pcDNA-nsp4-nsp5_SEAP 分别或共转染 Hela 细胞，加入不同浓度的PLpro和3CLpro阳性抑制剂，同时设立熔剂(DMSO)对照。 在转染后12h，24h，36h，4Sh和60h各时间点收聚50μ1上清。用化学发光技术 (Chemiluminescent Assay)(试齐Ll 为 GreatEscAPe SEAP Chemiluminescent and Fluorescence Detection Kits, Clontech公司)检测上清中的SEAP活性。分析阳性蛋白酶抑制剂对SEAP 活性的影响。
权利要求
1.一种基于细胞的靶向冠状病毒蛋白酶的药物筛选模型，由真核表达DNA载体转染 细胞后通过细胞上清测定获得，其特征为真核表达DNA载体由冠状病毒蛋白酶-蛋白 酶识别位点_分泌性报告基因组成。
2.根据权利要求1所述的细胞筛选模型，其特征为真核表达DNA载体由冠状病毒 蛋白酶PLP和分泌型报告基因组成，蛋白酶PLP和分泌型报告基因之间带有PLP蛋白酶 识别的nsp2/3位点氨基酸序列-FTKLAG丨GK-。
3.根据权利要求1所述的细胞筛选模型，其特征为真核表达DNA载体由冠状病 毒的nsp4-nsp5 (3CLpro)或nsp5 (3CLpro) _nsp6片段和分泌型报告基因组成，nsp5的N 端或C端带有3CLpro识别位点氨基酸序列-GVNLQ丨SGKVI-，分泌型报告基因位于 nsp4-nsp5 (3CLpro)或 nsp5 (3CLpro) _nsp6 片段的 3，端或 5，端。
4.根据权利要求1所述的细胞筛选模型，其特征为由PLP蛋白酶-蛋白酶识别位 点_分泌性报告基因DNA构建体和3CLpro蛋白酶-蛋白酶识别位点_分泌性报告基因 DNA构建体，共转染细胞得到靶向冠状病毒两种蛋白酶的双靶标药物筛选模型。
5.根据权利要求1所述的细胞筛选模型，其特征为分泌性报告基因是具有分泌性 表达性能的报告基因。
6.根据权利要求1所述的细胞筛选模型，其特征为分泌性报告基因是碱性磷酸酶 SEAP和分泌性荧光素酶报告基因。
7.—种筛选靶向冠状病毒蛋白酶化合物的方法，其特征为在权利要求1 6所述细 胞模型中加入不同浓度的候选选化合物，于不同时间点收聚上清，用化学发光技术检测 上清中的报告基因活性，判断待测化合物抑制蛋白酶活性效果。
8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征为该操作过程用多孔板形式实现。
全文摘要
本发明提供一种基于细胞的靶向冠状病毒蛋白酶新型药物筛选模型。冠状病毒多聚蛋白1a(1ab)加工产物中nsp3，nsp4和nsp6含有转膜(TM)结构域，这些转膜结构域可介导蛋白质定位于细胞内质网(ER)膜上。本发明利用nsp3，nsp4和nsp6含有转膜结构域和在细胞内定位等特征，使用分泌性报告基因，构建由冠状病毒蛋白酶-蛋白酶识别位点-分泌性报告基因组成的真核表达DNA构建体。转染细胞后通过冠状病毒蛋白酶切割活性释放报告基因表达产物并分泌到细胞上清中，通过细胞上清中报告基因活性来检测冠状病毒蛋白酶活性，用于冠状病毒药物筛选。
文档编号C12R1/93GK102021145SQ20091009231
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月10日 优先权日2009年9月10日
发明者杨宇东, 邢雅玲, 陈忠斌, 陈晓娟 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所