一种超氧化物歧化酶及其制备方法

专利名称：一种超氧化物歧化酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及从梅花鹿肝脏细胞中克隆的Cu/Zn-SOD的编码序列。实施方式之一，本发明提取梅花鹿肝脏细胞的基因组DNA，通过基因组文库构建好活性筛选的方法克隆到编码Cu/Zn-SOD的全长序列。实施方式之一中，所述编码序列包含如SEQ NO.1所示的核酸序列，称之为Cu/Zn-SOD。实施方式之一中，所述编码序列是SEQ NO.1中的核苷酸1至456所示的核苷酸序列。
本发明还涉及包含所述Cu/Zn-SOD编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明Cu/Zn-SOD编码序列经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pET21a(+)载体连接，得到大肠重组表达载pET21a(+)-SOD。另一实施方式中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明Cu/Zn-SOD编码序列经XhoI和NotI双酶切后与XhoI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-SOD。
本发明还制备包含本发明Cu/Zn-SOD编码序列的细胞。实施方式之一中，所述细胞是用上述本发明重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用大肠杆菌Rosetta2(DE3)和的毕氏酵母GS115构建表达Cu/Zn-SOD的重组细胞。
本发明还提供了表达Cu/Zn-SOD的方法，包括培养前文所述本发明包含Cu/Zn-SOD编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，还可以可行性地包括纯化表达产物的步骤。实施方式之一中，本发明通过包含本发明Cu/Zn-SOD编码序列的酵母(例如毕氏酵母GS115)发酵来生产Cu/Zn-SOD，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。
SEQ NO.1为本发明的氧化物歧化酶的核苷酸序列； SEQ NO.2为本发明的氧化物歧化酶的氨基酸序列； SEQ NO.3为其他来源SOD的氨基酸序列； SEQ NO.4为其他来源SOD的氨基酸序列； 本发明利用基因工程手段制备了能够高效表达并分泌Cu/Zn-SOD的重组生产株，实现了Cu/Zn-SOD的生产产业化，并获得了优质的Cu/Zn-SOD产品。本发明通过酶学性质鉴定进行了酶的最适作用温度、最适作用pH值、pH稳定性、热稳定性及比活力等理化性质的分析，证明本发明的Cu/Zn-SOD具有很好的pH稳定性，良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力。



图1来源于梅花鹿肝脏细胞的SOD的核苷酸序列和氨基酸序列。
图2梅花鹿肝脏来源SOD与其他来源SOD(序列表中SEQ NO.3，SEQ NO.4)氨基酸序列的比较。
图3梅花鹿肝脏来源SOD在质粒pGEM-T Easy、pET21a(+)和pPIC9k上的重组子结构图。
图4毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的最适反应温度。
图5毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的最适反应pH。
图6毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的热稳定性。
图7毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的pH稳定性。
图8毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的发酵过程中的酶活力。
图9毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD发酵过程中样品的SDS-PAGE。
图10毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD的分子量。
图11毕氏酵母表达梅花鹿肝脏来源SOD对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抗性。

具体实施例方式 以下根据具体的实施例充分说明本发明。
实施例 实验材料和试剂 1.菌株和载体 大肠杆菌Rosetta2(DE3)、JM109、DH5α、XL1-Blue及表达载体pET21a(+)、

购自Novagen公司，

Easy Vector systems购自promega公司，毕氏酵母GS115及表达载体pPIC9k均购自Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA)。
2.酶类及其他生化试剂 限制性内切酶、DNAMaker、蛋白质Maker均购自Fermentas(MBI)，SOD检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其他常规试剂为上海生工或进口。
3.培养基 使用的培养基LB培养基，YPD，YPAD，BMDY，BNNY，MM，MD培养基均参照Invitrogen毕氏酵母操作手册。
4.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括[美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]。
5.本发明中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指SOD酶活性，均采用SOD检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，并按照其说明书中所述的方法进行测定及计算。
实施例1Cu/Zn-SOD基因的获得 (1)总RNA的分离提取 取梅花鹿肝脏小片，用液氮冻结后在研钵中粉碎，取约100mg粉末于1.5ml离心管中，加入1mL TRIzol溶液(

Reagent，InvitrogenTM Cat No.15596-026)，并按说明书方法操作提取总RNA。
取1uL稀释100倍并进行定量检测，取必要的量用于反转录(RT)，剩余的量加入三倍体积的乙醇混合，于-80℃贮存。
(2)cDNA第一链的合成 RT-PCR是先将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增。cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下形成的互补DNA(complementary DNA，简称cDNA)。cDNA第一链的合成有两个关键因素，一是模板mRNA，二是反转录酶。本cDNA第一链的合成应用申能博彩逆转录试剂盒，按其说明进行操作。
(3)PCR获取目的基因 根据NCBI发表的马鹿SOD序列设计上、下游引物P1和P2。上、下游引物分别含有EcoRI和Not I酶切位点，由上海生工合成，引物序列如下 P15’-GAATTCGCGACGAAGGCCGTCTG-3’ P25’-GCGGCCGCTTACTGGGCAATTCCAATTACACC-3’ 本研究PCR程序为94℃预变性4min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增30次；最后72℃延伸10min。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因。
(4)cDNA亚克隆 制备好的双链cDNA插入到载体系统

Easy上，得到重组质粒

Easy-SOD(如图3所示)，用化学转化法转化受体菌XL1-Blue，在含有100mg/ml Amp和0.5％X-gal的LB平板上37℃培养过夜。挑取蓝色的单克隆(蓝白斑筛选)菌落接种到2ml含有100mg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃200rpm培养3-6h，10000rpm离心10min收集菌体，提取质粒，酶切回收目的基因备用(质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I和E.Z.N.A.Gel Extraction Kit试剂盒)。将所得目的基因进行DNA序列测定(Invitrogen公司)，并在NCBI数据库中进行比对分析，结果分别如图1和图2所示。
由此所得到的SOD的编码序列共有456bp(图1，SEQ ID NO1)，其中第454-456位为终止密码子TAA、第1-453位编码不含信号肽的成熟蛋白(图2)，该成熟蛋白含有151个氨基酸(SEQ ID NO2)。根据在NCBI数据库里同源性比对的结果初步确定所得到的SOD为Cu/Zn-SOD。
实施例2Cu/Zn-SOD编码基因在大肠杆菌中的表达和扩增 将实施例1-(4)中所得到的目的基因，与经过到EcoR I和NotI双酶切的pET21a(+)质粒连接，得到重组质粒pET21a(+)-SOD(如图3所示)。
取10ul构建好的质粒DNA，加入到100ul制备好的感受态细胞(大肠杆菌Rosetta2(DE3)和JM109)中，摇匀置于冰上，冰浴30min；置于42℃水浴中热击90s；将离心管快速移至冰水混合物中冰浴2min；每管加入400ul SOC培养基(2％蛋白胨，0.5％酵母粉，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖，pH7.0～7.2)，用移液器轻吸打散后于37℃摇床上复苏1h(80rpm～200rpm)；离心，4000rpm×5min，除去400ul上清，剩余部分混匀；涂平板(LB-agar平板，含100ug/ml Amp)，37℃正置1h后，倒置培养过夜，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。
取重组大肠杆菌菌株Rosetta2(DE3)，接种于50ml LB培养液中(250ml三角瓶，含100ug/ml Amp)，37℃250rpm振荡培养1-1.5h，加入IPTG诱导(终浓度为2umol/ml)，37℃250rpm再振荡培养3-3.5h。取培养液10000rpm离心10min，收集菌体，再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体，12000rpm离心10min，取沉淀用1/5体积pH6.0，50mM的PBS悬浮菌体，进行超声波破碎，破碎条件为60％功率，间隔5s破碎10min，停止10min，再破碎10min。12000rpm离心，收集上清液分析SOD活力，并通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，结果表明SOD的编码基因所编码的SOD可在大肠杆菌中表达，且有一定的SOD活性，测得酶活力为2050U/ml。
取重组大肠杆菌菌株JM109，接种于50ml LB培养液中(250ml三角瓶，含100ug/ml Amp)，37℃250rpm振荡培养2-2.5h，取培养液10000rpm离心10min，收集菌体，提取质粒，酶切回收目的基因备用(质粒提取和胶回收分别用OMEGA公司的E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I和E.Z.N.A.Gel Extraction Kit试剂盒)。
实施例3酵母重组表达载体的构建 将实施例2中所得到的目的基因，与经过到EcoR I和NotI双酶切的pPIC9k质粒连接，得到重组质粒pPIC9k-SOD(如图3所示)。
以所得pPIC9k重组质粒为模板，以引物P1和引物P2构成的引物对进行PCR，同时，以实施例2制备的pET21a(+)重组质粒与引物P1和引物P2所构成的引物对做PCR，从DNA水平上验证外源基因插入是否正确。PCR所得到的2种产物序列长度均为456bp，与实施例1中从梅花鹿肝脏细胞中所得到的SOD原始基因的序列以及其他特征一致，由此可知目的基因的插入位点、方向和序列正确。
实施例4毕氏酵母发酵生产重组SOD 将实施例3 制备的重组质粒pPIC9k-SOD经SacI或者BglII酶切，得到线性化质粒pPIC9k-SOD1。
取构建好的线性重组质粒DNA 50ug，直接加入到仍在零度以下的感受态细胞中(毕氏酵母GS115)；加入1.0ml含5ug/ml的鲑鱼精DNA的溶液II(40％(w/v)聚乙二醇1000，0.2M N，N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)，或先加入1.0ml的溶液II，然后加入5ul 1mg/ml的鲑鱼精DNA并尽量的将两者完全混匀；30℃水浴保温1h以上，每隔15min轻轻的混匀一次；42℃保温10min；室温3000×g离心5min，弃去上清，用1.0ml的溶液III(0.15M NaCl，10mM N，N-二羟乙基甘氨酸，pH8.35)重新悬浮菌体；室温3000×g离心5min，移去800ul上清，用剩余的200ul上清重新悬浮菌体；将200ul菌液涂YPD平板(YP和20％D单独灭菌，倒平板之前按1∶9向YP中加入20％D；筛选抗性为80ug/ml Amp)，30℃倒置培养3-4天，在抗性平板上生长的为含有重组质粒的阳性克隆子。
取重组质粒pPIC9k-SOD1转化的毕氏酵母GS115菌株阳性克隆子，接种于150ml YPD培养液中，30℃250rpm振荡培养至OD600nm＝0.3～0.5(约20hr)，然后接种于3L发酵基本培养基(26.2ml/L磷酸，0.80g/L硫酸钙，18.7g/L硫酸钾，15.5g/L硫酸镁，4.17g/L氢氧化钾，Glucose 40g/L葡萄糖)中，于5L发酵罐中进行发酵。
在起始阶段——菌体生长阶段，发酵过程中用25％的氨水调节pH，使其维持在6.5，并且以4.0ml/hr的速度流加PTM1(30mM硫酸铜，0.54mM碘化钠，17.6mM硫酸锰，0.80mM钼酸钠，0.32mM硼酸，2.4mM氯化钴，0.18mM氯化锌，0.24mM硫酸亚铁，1.6mM生物素，0.19M硫酸)，进行连续流加补料。搅拌并通气培养20-24hr，在菌体生长过程中溶氧逐渐下降至低于100％，直至碳源耗尽，溶氧又逐渐上升至高于80％，此时菌湿重可达到90g/L。
进入碳源饲喂阶段，以25ml/hr的速度流加用蒸馏水配置的含有25％(w/v)葡萄糖和12ml/L PTM1的溶液，持续流加4-6hr，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下，到代该阶段的末期，菌湿重可达到160g/L。
在诱导阶段，以20-30ml/hr的速度流加含有12ml/L PTM1的甲醇，使培养基中甲醇的终浓度最高不要超过0.3％(v/v)，并调节通气量，使溶氧维持在20％上下。在诱导阶段的发酵过程中每隔8-16hr取样10ml，10000rpm离心5min，收集上清液测定SOD活力并进行SDS-PAGE分析，结果分别如图8和图9所示。发酵达161hr时，菌湿重可达到330g/L，SOD的表达水平(以发酵液上清的酶活力表示)可达到3500U/ml，这说明梅花鹿肝脏细胞来源的SOD基因均在毕氏酵母中得到了表达和积累。
实施例5重组SOD的纯化 将实施例4所制备的发酵培养液10000rpm离心10min去除菌体，取上清液作为粗酶液，用截留分子量为6000Da的外压式中空纤维超滤膜进行超滤，以去除粗酶液中小分子的杂质，并将其浓缩3-5倍。
将上面所得粗酶液的浓缩液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至85％，13000rpm离心15min，取沉淀，用缓冲液重新溶解，置于截留分子量为6000Da的透析袋中，以pH8.0，20mM Tris-HCl为透析外液，透析外液与内液的体积比大于50，4℃透析12-16h，中间每隔4h更换透析外液一次，透析完后，取透析内液用真空旋转蒸发仪进行浓缩，再进行冷冻干燥后，置于-20℃的低温冰箱中保存待用。
取20mg上面所得到的冻干粉末于离心管中，加入2ml pH8.0，50mM Tris-HCl缓冲液，使其充分溶解后，上TOSOH Toyopearl EDAE-650C阴离子柱。先用pH8.0，50mM Tris-HCl缓冲液平衡柱子，然后流加样品，再用相同缓冲液配置的0-0.8mol/L NaCl梯度洗脱5个柱体积，流速为1ml/min，用部分收集器收集，每管3ml。然后对收集管中的溶液测定SOD活力及蛋白电泳分析。
收集离子交换分离后的活性峰，浓缩、脱盐、冻干后，再用pH7.0，20mM PBS缓冲液溶解，上Superdex75HPLC柱。先用pH7.0，20mM PBS缓冲液平衡柱子，然后上样，用pH7.0，20mM PBS缓冲液洗脱1.5个柱体积，流速为0.25ml/min，按峰收集，然后对收集的样品测定SOD活力及进行蛋白质电泳分析。
纯化完成后，梅花鹿肝脏基因来源的SOD比活性从粗酶液的237U/mg提高到纯酶的3447U/mg，纯化倍数为14.5，得率为13.8。SDS-PAGE结果(图10)表明，梅花鹿肝脏基因来源的SOD纯化后的SOD蛋白仅有单一的条带，分子量均约为16kDa。
实施例6重组SOD的酶学性质分析 将实施例4所制备的SOD在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.0-10.0的广泛缓冲液(柠檬酸、磷酸二氢钾、硼酸、氢氧化钠、巴比妥)。SOD在不同的pH的缓冲液中，40℃下测定pH的适性结果，表明梅花鹿肝脏基因来源SOD的最适pH为7.0-8.0(图5)。将SOD酶液在不同pH值的缓冲液中于室温下处理60min，再测定残余酶活性以研究SOD的pH稳定性。结果表明(图7)，在pH4.0-9.0之间，SOD的残余活性均在90％以上。这说明梅花鹿肝脏基因来源SOD有很好的pH稳定性。
最适反应温度的测定在磷酸盐(pH7.0)缓冲体系及不同温度下(30℃-80℃)进行酶促反应。热稳定性研究为在不同温度下处理10-60min，再进行酶活性测定。酶促反应最适温度测定结果(图4)表明，SOD的最适反应温度为40℃。在30℃-50℃的范围内保温60min，残余酶活力均可维持在85％以上(图6)。在60℃下保温30min，残余酶活力为80％左右。说明梅花鹿肝脏基因来源SOD有较好的热稳定性。
分别在梅花鹿肝脏基因来源SOD酶溶液中加入0.05ml胰蛋白酶(0.1mg/ml，用pH7.0PBS缓冲液配置)和胃蛋白酶(0.1mg/ml，用pH2.0甘氨酸-HCL缓冲液配置)于37℃处理30-240min，稀释后再测定SOD活性。经胰蛋白酶处理240min后，SOD的残余酶活力仍维持在100％，无明显的损失；经胃蛋白酶处理240min后，SOD残余酶活力在65％左右(图11)，说明梅花鹿肝脏基因来源SOD具有较好的抗蛋白酶水解能力。
功能及用途试验 实施例7重组SOD对小鼠的抗疲劳实验 超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内超氧化物阴离子自由基的清除剂，能够增强机体内代谢废物的清除能力，从而消除疲劳。普通的SOD多由动植物中提取，但是由于其是非人源的，不可避免某些异源SOD的过敏反应，基因组动物源SOD可以弥补这一缺点。但是，目前关于动物源SOD的抗疲劳作用的研究较少，本专利中通过小鼠的负重游泳实验探讨基因重组动物源SOD的抗疲劳作用。
1材料 昆明小鼠，共40只，雌雄各半，体重(20±2)g，福建医大实验动物中心提供。基因重组动物源SOD由实施例4所制备。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、SOD、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)检测试剂盒由南京建成生物技术公司提供，具体测定方法采用试剂盒中所提供的方法进行。
2给药方法 昆明小鼠随机分成四组，每组10只，雌雄各半。小鼠经口灌胃给药，剂量分别为500、1 500、6 000U/kg；另设生理盐水对照组。各组动物每天固定时间给药1次，连续给药1w。末次给药后，将小鼠放入游泳箱中进行负重游泳实验(负重10％体重)，游泳箱规格为50cm×50cm×40cm，水温为25℃～27℃，直至沉入水中不再浮起时将其捞出，分别记录游泳时间，所得结果如表1所示。
3检测指标 末次给药后，将小鼠放入游泳箱中游泳1h后捞出擦干，脱臼处死，取肝脏组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，将组织放入青霉素瓶中，加入生理盐水研磨，3 500r/min离心10min，取上清，制成10％的组织匀浆液。用分光光度法测定小鼠组织中GSH-PX、SOD、T-AOC和MDA的水平，所得结果见表2。
4统计学处理 采用spss统计软件，统计结果以x±s表示，进行组间t检验。
表1小鼠游泳实验结果 由表1可以看出，给药三组的均明显高于对照组(p＜0.05)，这说明SOD可显著延长游泳时间，提高运动耐力。
表2实验后小鼠的生化指标 由表2中的结果可知，给予小鼠SOD后，提高了其肝脏组织SOD、GSH-PX和T-AOC活力，降低了MDA含量。其中低浓度组GSH-PX的水平显著提高(p＜0.05)；中浓度组SOD和T-AOC的水平显著提高(p＜0.05)，MDA显著降低(p＜0.05)；高浓度组SOD的水平显著提高(p＜0.05)，MDA显著降低(p＜0.05)。
据报道，竭力运动后体内的自由基生成增多，同时运动后其防御系统也得到了加强，但运动后即刻抗氧化酶活性的增强不足以清除增多的自由基，导致自由基在体内的堆积，组织内SOD和GSH-PX等抗氧化酶的活性降低。由于自由基非常活泼，化学反应性极强，它可以参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏膜的结构和功能，从而使机体疲劳。
自由基还能引起蛋白质变性和交联，使体内的许多酶及激素失去生物活性。SOD作为一种蛋白质，在运动后自由基增多的情况下很容易失活而起不到抗氧化的作用。本实验结果表明，外源性给予SOD后，组织内SOD的活性明显升高，尤以中、高剂量组升高最为明显，由此推测SOD具有增强组织清除自由基的能力。
谷胱甘肽是一种小分子肽，其在GSH-PX的催化下具有还原过氧化物的作用。近来的研究证明，其能使维生素e(Ve)恢复到还原状态，而脂质过氧化物的毒性作用可被Ve对抗，其能阻断脂质过氧化作用，维护生物膜的结构和功能；而且谷胱甘肽的结构中含有一个活泼的巯基，易被氧化脱氧，这一特异结构使其成为体内主要的自由基清除剂。因此，GSH-PX可以使组织细胞的脂质过氧化物生成减少，从而降低细胞的损伤程度。本实验结果表明，SOD提高了GSH-PX的活性，尤以低浓度组效果最明显，这说明SOD可能有效地阻断了脂质过氧化的发生。
T-AOC是综合反映组织对抗自由基对脂质膜损害、清除活性氧能力的良好指标，它克服了单一的抗氧化指标难以全面反映机体抗氧化能力的不足，能够对各抗氧化系统协同完整的抗氧化能力做出综合全面评价。T-AOC用于运动性疲劳研究，有利于更全面评价机体抗氧化系统的综合作用。本实验结果显示，口服SOD后T-AOC的水平明显提高，这说明SOD提高了组织对抗自由基对脂质膜损害、清除活性氧的能力。
细胞膜富含不饱和脂肪酸，最易受到氧自由基的攻击而发生脂质过氧化反应，其分解产物之一是MDA，MDA的含量能直接反映细胞膜被氧化的程度。本实验的结果显示，口服SOD后，小鼠体内MDA的水平显著降低，中、高剂量组的效果尤其显著，这说明SOD能够显著增加组织对自由基的清除能力。
因此，综合本实验的结果可知，SOD对于降低运动引起的自由基增加的状况和延缓运动性疲劳的发生是十分有利的，可作为生物体内有效的抗氧化剂加以补充。但是对于不同的指标，抗氧化作用的最佳剂量有些不一致，可能是因为疲劳时不同的抗氧化酶代谢速率不同，所以对于提高不同的酶的活性，给予的外源性抗氧化剂的剂量也不同。
序列表
SEQ NO.1
<110>福州大学
<120>一种超氧化物歧化酶及其制备方法
<160>4
<210>1
<211>序列的长度
<212>DNA
<213>梅花鹿肝脏细胞
<220>
<223>该DNA序列共有456bp，其中第454-456位为终止密码子TAA、第1-453位编码不含信号肽的成熟
蛋白，该成熟蛋白含有151个氨基酸。
<400>1
gcgacgaagg ccgtctgcgt gctgaagggc gacggcccgg tgcaaggcac catccgcttc 60
gaggcaaagg gacatacagt cgtcgtaact ggatccatta caggattgac tgaaggtgat120
catggattcc acgtccatca gtttggagac gatacgcaag gctgtaccag tgcaggtcct180
cactttaatc ctctgtccaa aaaacacggt gggccaaaag atgatgagag gcatgttgga240
gacctgggca acgtgacggc tgacaaaaac ggtgttgcca aagtggatat tgtagattct300
ctgatctcac tgtcaggaga acattccatc attggccgca cgatggtggt ccatgaaaaa360
ccggatgact tgggcagagg tggaaatgaa gaaagtacaa agactggaaa cgctggaaat420
cgtttggcct gtggtgtaat tggaattgcc cagtaa 456
SEQ NO.2
<210>2
<211>151
<212>PRT
<213>梅花鹿肝脏细胞
<220>
<400>2
Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
1 5 10 20
Gly Thr Ile Arg Phe Glu Ala Lys Gly His Thr Val Val Val Thr
20 25 30
Gly Ser Ile Thr Gly Leu Thr Glu Gly Asp His Gly Phe His Vis
35 40 45
His Gln Phe Gly Asp Asp Thr Gln Gky Cys Thr Ser Ala Gly Pro
50 55 60
His Phe Asn Pro Leu Ser Lys Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Asp
65 70 75
Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asn
80 85 90
Gly Val Ala Lys Val Asp Ile Val Asp Ser Leu Ile Ser Leu Ser
95 100 105
Gly Glu His Ser Ile Ile Gly Arg Thr Met Val Val His Glu Lys
110 115 120
Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr
125 130 135
Gly Asn Ala Gly Asn Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala
140 145 150
Gln
SEQ NO.3
<210>3
<211>152
<212>PRT
<213>马鹿(北美)
<220>
<400>3
Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ile Arg Phe Glu Ala Lys Gly His Thr Val Val Val
20 25 30
Thr Gly Ser Ile Thr Gly Leu Thr Glu Gly Asp His Gly Phe His
35 40 45
Val His Gln Phe Gly Asp Asn Thr Gln Gly Cys Thr Ser Ala Gly
50 55 60
Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Lys Lys His Gly Gly Pro Lys Asp
65 70 75
Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys
80 85 90
Asn Gly Val Ala Lys Val Asp Ile Val Asp Ser Leu Ile Ser Leu
95 100 105
Ser Gly Glu His Ser Ile Ile Gly Arg Thr Met Val Val His Glu
110 115 120
Lys Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys
125 130 135
Thr Gly Asn Ala Arg Asn Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile
140 145 150
Ala Gln
SEQ NO.4
<210>4
<211>152
<212>PRT
<213>马鹿(欧洲)
<220>
<400>4
Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Met Lys Gly Asp Gly Pro Val
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ile Arg Phe Glu Ala Lys Gly Asn Thr Val Val Val
20 25 30
Thr Gly Ser Ile Thr Gly Leu Thr Glu Gly Asp His Gly Phe His
35 40 45
Val His Gln Phe Gly Asp Asn Thr Gln Gly Cys Thr Ser Ala Gly
50 55 60
Pro His Phe Asn Pro Leu Ser Lys Lys His Gly Gly Pro Lys Asp
65 70 75
Glu Glu Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys
80 85 90
Asn Gly Val Ala Lys Val Asp Ile Val Asp Ser Leu Ile Ser Leu
95 100 105
Ser Gly Glu His Ser Ile Ile Gly Arg Thr Met Val Val His Glu
110 115 120
Lys Pro Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys
125 130 135
Thr Gly Asn Ala Arg Asn Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile
140 145 150
Ala Gln
权利要求
1.一种超氧化物歧化酶，其特征在于所述的超氧化物歧化酶为铜锌超氧化物歧化酶，所述述氧化物歧化酶的核苷酸序列的如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶，其特征在于所述氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQ NO.2所示。
3.一种如权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体，其特征在于所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒。
4.根据权利要求3所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体，其特征在于所述的载体为pGEM-T Easy-SOD、pET21a(+)-SOD或pPIC9k-SOD。
5.一种如权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的编码序列的细胞，其特征在于所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的细胞选大肠杆菌细胞或酵母细胞；所述核苷酸分子的细胞由所述载体转化而得。
6.根据权利要求5所述的的超氧化物歧化酶的编码序列的细胞，其特征在于所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕氏酵母。
7.一种如权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于所述超氧化物歧化酶的制备步骤包括Cu/Zn-SOD基因的获得从梅花鹿肝脏中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再用PCR扩增；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因；制备好的双链cDNA进行亚克隆将所得目的基因进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到Cu/Zn-SOD基因。
8.一种如权利要求3所述的超氧化物歧化酶的核苷酸分子的重组载体的制备方法，其特征在于所述Cu/Zn-SOD基因的重组载体的制备为采用所述Cu/Zn-SOD编码序列经EcoRI和NotI双酶切后与EcoRI和NotI双酶切的pET21a(+)载体连接，得到大肠重组表达载pET21a(+)-SOD或采用所述的Cu/Zn-SOD编码序列经XhoI和NotI双酶切后与XhoI和NotI双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-SOD。
9.一种如权利要求5所述的的超氧化物歧化酶的编码序列的细胞的构建，其特征在于所述细胞是用所述重组载体转化来构建的；所述细胞选大肠杆菌细胞和酵母细胞，选用大肠杆菌和毕氏酵母构建表达Cu/Zn-SOD的重组细胞。
10.一种如权利要求1或2所述的超氧化物歧化酶的表达，其特征在于培养所述包含Cu/Zn-SOD编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物通过包含本发明Cu/Zn-SOD编码序列的酵母发酵来生产Cu/Zn-SOD，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。
全文摘要
本发明提供一种动物来源的SOD基因，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，所述氧化物歧化酶的核苷酸序列的如SEQ NO.1所示；氧化物歧化酶的氨基酸序列如SEQNO.2所示；核苷酸分子的载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒；核苷酸分子的细胞由所述载体转化而得；所述超氧化物歧化酶的核苷酸分子的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕氏酵母。本发明制备出能够高效表达并分泌Cu/Zn-SOD的重组生产株，实现Cu/Zn-SOD的生产产业化，获得具有很好的pH稳定性，良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力的Cu/Zn-SOD产品。
文档编号C12N9/02GK101633916SQ200910112388
公开日2010年1月27日 申请日期2009年8月13日 优先权日2009年8月13日
发明者叶秀云, 李仁宽, 靳伟刚, 洋 张, 罗鋆琳 申请人:福州大学