专利名称：Rgd修饰的人纤溶酶原k5及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人纤溶酶原，尤其是涉及一种抗肿瘤蛋白——RGD修饰的人纤溶酶原 Kringle 5及其制备方法与应用。
背景技术：
新生血管异常增生所引起的全身组织及器官的损害是目前最为棘手的医学难题之一，是 全身许多重大疾病的病因或/和重要病理特征。人纤溶酶原Kringle5 (Human Plasminogen Kringle 5， K5)是引人注目的抑制血管生成蛋白之一，是目前发现的抑制新生血管活性最强 的纤溶酶原片段，具有生物活性强、高度的细胞特异性、分子量小、副作用小、性质比较稳 定等诸多的显著优点(1 、 Cao. Y, Chen. A. An, S.S. Ji, R.W， Davidson. D and Llinas. M. Kringle 5 of plasminogen is a novel inhibitor of endothelial cell growth. J Biol Chem,272(36):22924陽22928， 1997:2、 W.R.Ji, L.G. Barrientos, M丄liMs, H.Gray, X.Villarreal, M.E. DeFord, F丄Castellino, R.A. Kramer and P.A. Trail. Selective inhibition by kringle 5 of human plasminogen on endothelial cell migration, an important process in angiogenesis. Biochem Biophys Res Commun， 247(2):414-419, 1998; 3、 Soff， G.A. Angiostatin and angiostatin-related proteins. Cancer Metastasis Rev, 19(1-2): 97-107,2000)。已证实，K5在新生血管性疾病如实体瘤(4、 Davidson DJ， Haskell C, Majest S， et al. Kringle 5 of human plasminogen induces apoptosis of endothelial and tumor cells through surface-expressed glucose-regulated protein 78. Cancer Res，65: 46634672 ,2005; 5、 Perri SR, Nalbantoglu J, Annabi B, et al. Plasminogen kringle 5-engineered glioma cells block migration of tumor-associated macrophages and suppress tumor vascularization and progression. Cancer Res,6 5:8359-8365,2005)、糖尿病性视网膜增生(6、 Zhihong Zhang, Jian-xing Ma， Guoquan Gao, Chaoyang Li, Lihui Luo,Mei Zhang,Wenzhao Yang, Aihua Jiang, Wenhui Kuang， Liying Xu，Jiaqi Chen, and Zuguo Liu. Plasminogen Kringle 5 Inhibits Alkali-Burn-Induced Corneal Neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci.46:40624071,2005)等疾病治疗中具有潜在的应 用前景。但是传统的K5存在释放方式缺乏靶向性、应用剂量较大、酵母系统生产成本较高 昂、伴随潜在的毒副作用等缺陷，严重制约着K5在临床中的应用。
RGD (Arg-Gly-Asp)多肽序列作为配体可与部分整合素受体结合，在介导细胞与细胞外 基质的信号转导中起重要作用。人的基因组含有整合素基因18个a亚基基因和8个P亚基基因，这两个不同亚基的组合产生24个不同的已知的整合素，大约有1/3的整合素在不同程度 上识别RGD序列。肿瘤新生血管内皮细胞膜表面表达高水平的avp3/a5卩i和a5卩!整合素，因 此含有RGD序列的蛋白，作为整合素配体，能够靶向性到达肿瘤局部新生血管内皮。从而抑 制内皮细胞的增殖与迁移，抑制新生血管生成；并且可以携带目的蛋白靶向投递至肿瘤局部 新生血管，增强目的蛋白的抗肿瘤作用；同时也可以抑制肿瘤细胞的黏附及迁移。由此，可 以考虑开发成RGD多肽修饰的治疗肿瘤的靶向性药物(7、 Yun, Z., Menter, D.G andNicolson， G.L. Involvement of integrin alphavbeta3 incell adhesion, motility, and liver metastasis of murine RAW117 large celllymphoma. Cancer Res, 1996,56(13):3103-3111; 8、 Prieto, A丄.，Edehnan, G.M. and Crossin, K，L. Multiple integrins mediate cellattachment to cytotactin/tenascin. Proc Natl Acad SciUSA， 1993,90(21):10154-10158)。据报道，RGD多肽修饰TRAIL (9、 L. Cao, P. Du, S.H. Jiang, G.H. Jin, Q丄.Huang, and Z.C. Hua, Enhancement of antitumor properties of TRAIL by targeted delivery to the tumor neovasculature. Mol Cancer Ther 7 (2008) 851-861 )、 TNF-a (10、 F. Curnis， A. Gasparri, A. Sacchi, R. Longhi, and A. Corti, Coupling tumor necrosis factor-alpha with alphaV integrin ligands improves its antineoplastic activity. Cancer Res 64 (2004) 565-571) 禾口 endostatin (11、 Y. Yokoyama， and S. Ramakrishnan， Addition of integrin binding sequence to a mutant human endostatin improves inhibition of tumor growth. Int J Cancer 111 (2004) 839-848 )等 抗肿瘤药物后，可以显著提高药物在肿瘤中分布，增强其在实体内抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗肿瘤蛋白一RGD修饰的人纤溶酶原K5(简称为RGD-K5)。 本发明的另一个目的在于提供一种RGD修饰的人纤溶酶原K5的制备方法。 本发明的另一个目的在于提供一种RGD修饰的人纤溶酶原K5在抗肿瘤治疗中的应用。 本发明所述抗肿瘤蛋白一RGD修饰的人纤溶酶原K5的氨基酸序列为 ACDCRGDCFCGGGGVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQE
P HRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAA，其分子量
大小为17kDa，该蛋白的肿瘤靶向性和特异性显著比野生型K5提高。 本发明所述RGD修饰的人纤溶酶原K5的制备方法包括以下步骤
1) 设计和构建RGD-K5序列根据K5全长序列，及表达载体pPIC9K的多克隆位点， 设计合成含有RGD基序的上游引物，下游引物同野生型，将测序鉴定正确的、含有K5cDNA 序列的质粒pPIC9K-K5为模版，应用设计的引物PCR扩增，并Wo I和￡Coi I双酶切PCR 产物和载体pPIC9K,用T4DNA连接酶(TaKaRa)进行连接，获得pPIC9K-RGD-K5质粒；
2) 表达、纯化和鉴定RGD-K5蛋白将经限制性内切酶5WI (TaKaRa)线性化、去磷
4酸化处理的pPIC9K-RGD-K5质粒电转化到毕赤酵母GS115菌株(Invitrogen)巾，通过PCR 方法鉴定阳性重组子，阳性重组子经甲醇小量诱导表达，筛选高拷贝阳性菌株进行大量诱导 表达，收集部分酵母上清，经三氯乙酸沉淀法浓縮蛋白后，Tricine SDS-PAGE电泳检测，17kDa 处有预期的条带，同时通过Western Blot试验利用兔抗K5多克隆抗体鉴定其特异性，纯化 浓縮蛋白和透析后，UNOsphere Q cartridge (BioRad)阴离子交换层析过柱，用洗脱液过柱， 流出液即为纯化的RGD修饰的人纤溶酶原K5 (RGD-K5)。
所述诱导表达的培养条件为28 3CTC， 250rpm， 48h,按体积比，每24h在培养液中补 加甲醇，甲醇的加入量为培养液总量的1%。
所述纯化浓縮蛋白和透析可采用65%饱和度硫酸铵盐沉淀法。
所述洗脱液最好用含0.2mol/LNaCl的洗脱液。
以下给出所述RGD修饰的人纤溶酶原K5的应用。
1) 通过鸡胚尿囊膜实验证明，RGD-K5可以明显抑制血管生成(参见图5);通过体外 实验，内皮细胞增殖实验证明，RGD-K5可以有效抑制内皮细胞增殖(参见图6);通过肿瘤 细胞划痕实验证明，RGD-K5可以抑制肿瘤细胞迁移(参见图7)。
2) 通过体内实验，小鼠肿瘤模型经RGD-K5治疗后，肿瘤生长明显受到抑制(参见图8); 肿瘤组织经免疫组化实验证明，RGD-K5具有明显的抑制肿瘤血管生成的作用(参见图9)。
由此可见，所述RGD修饰显著提高了野生型K5的抗肿瘤活性。
本发明选择肿瘤靶向性RGD序列的多肽，分子设计并重组构建具有肿瘤血管靶向性和选 择性的、具有良好抗肿瘤活性的K5变体，以pPIC9K为载体，建立毕赤酵母表达系统，表达 并纯化出高活性的变体蛋白RGD-K5。该蛋白分子量为17kDa，实验结果显示(1)RGD-K5 保留野生型K5的原有活性，能显著抑制血管内皮细胞增殖和血管生成；(2)经RGD修饰后， 增加了K5对肿瘤细胞迁移的抑制作用；(3)由于RGD-K5的肿瘤靶向作用，其在动物体内 具有更强的抗血管生成和抗肿瘤效应。本发明利用具有高度肿瘤耙向性的RGD分子修饰K5， 高效定向地将治疗蛋白直接释放到肿瘤组织，克服传统释放途径的上述缺陷，能够在大大降 低使用剂量的基础上，同时保持相同甚至更好的抗血管生成和抗肿瘤作用，从而达到降低生 产难度和成本、提高抗肿瘤效果、降低可能的副作用等诸多目标，使其成为恶性肿瘤放疗的 有效补充，使肿瘤治疗变得更为安全有效。
图1为质粒pPIC9K中RGD-K5基因序列结构示意图。其中5'AOX、 3'AOX分别为基 因上下游，S为多克隆位点插入点，TT为转录终止子，J^oI、五coRI分别为上下游酶切位点， ACDCRGDCFC为RGD多肽序列，VLLP---------QCAA代表K5蛋白序列，GGGG为连接物。图2为Tricine SDS-PAGE检测K5蛋白的表达。考马斯亮蓝染色l.蛋白分子量Marker, 2.转染pPIC9K-K5的GS115菌株表达上清，3.转染pPIC9K-RGD-K5的GS115菌株表达上清。
图3为免疫印迹法检测酵母细胞表达的K5和RGD-K5蛋白1:K5; 2:RGD-K5。
图4为RGD-K5蛋白的纯化(Tricine SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色)l:蛋白分子 量Marker; 2:RGD-K5 Q Sepharose离子交换介质穿过液；3:穿过液；4:0.1M NaCl洗脱馏分； 5:0.2 MNaCl洗脱馏分；6:0.5 MNaCl洗脱馏分。
图5为鸡胚尿囊膜实验。图5a为药物作用48h后鸡胚尿囊膜活体拍摄图1.对照组,2乂5 组，3.RGD-K5组；图5b为各组新生血管占鸡胚尿囊膜面积百分比直方图，横坐标分别为 对照组，K5组，RGD-K5组，纵坐标为各组新生血管占鸡胚尿囊膜面积百分。
图6为MTT法检测K5和RGD-K5对人脐血管内皮细胞增殖的影响。横坐标分别为对 照组，K5组，RGD-K5组；纵坐标为各组在OD570nm的吸光值。
图7为镜下观察K5和RGD-K5鼠黑色素瘤细胞迁移的影响。图为对照、K5组、RGD-K5 组分别在0小时、2小时、20小时的镜下拍照图，划痕宽度以pm为单位在图中标出。
图8为动物体内检测K5和RGD-K5对实体瘤的治疗作用。图横坐标分别为实验的第0、 2、 4、 6、 8天，纵坐标为各组肿瘤体积大小，一■—、 一o—、 一A一分别为对照组，K5组， RGD-K5组。
图9为免疫组化检测肿瘤组织的血管生成情况。图9a为治疗后的肿瘤组织经抗VEGFR2 单克隆抗体检测的拍摄图，从左到右依次为对照组，K5组，RGD-K5组；图9b为单位肿瘤 组织中血管生成的数目的直方图，图横坐标分别为对照组，K5组，RGD-K5组，纵坐标为低 倍镜下肿瘤组织切片中血管的数目。
具体实施例方式
下面结合具体实施例子，进一歩阐述本发明。应理解，这些实施例子仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。
1. pPIC9K-RGD-K5载体的设计、构建
(1) 引物的设计根据K5全长序列及表达载体pPIC9K的多克隆位点，设计合成含有RGD 基序的上游引物和下游引物(赛百盛公司合成)，上游引物5，-CGCTCGAGAAAAGAGCA TGC GAC TGC CGT GGT GAC TGC TTC TGC GGT GGT GGT GGT GTC CTG CTT CCA GATGTAG;下游引物3'陽GC GAATTCTAG GCC GCACACTGAGGGAC。
(2) RGD-K5序列的构建以pPIC9K-K5质粒为模板，利用上述引物经PCR将RGD与 K5的N-端连接，循环参数94。C2min， (94°C 45Sec， 55°C 45Sec， 72°C lmin) 25个循环， 72°C 10min。
PCR产物经1°/。的TAE-琼脂糖凝胶电泳后，用柱离心胶回收试剂盒(购自BIOBASIC INC)回收目的片段，RGD-K5序列结构如图l所示。
(3)pPIC9K-RGD-K5载体的构建回收DNA片段和载体pPIC9K经JT/jo I和I进行 双酶切，柱离心胶回收试剂盒回收酶切产物，用T4DNA连接酶将回收的目的片段和载体于 16'C过夜连接，得到pPIC9K-RGD-K5质粒。将含有RGD-K5 cDNA的质粒pPIC9K转化大肠 杆菌TOP10中，在含氨苄青霉素(终浓度100 ug/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR 方法筛选阳性克隆，并进行DNA测序。DNA序列分析结果表明构建的目的序列与RGD-K5 的cDNA (Genebank)序列完全相同。
2. RGD-K5的表达，纯化及鉴定
(1) RGD-K5的表达将经限制性内切酶I线性化、并经去磷酸化处理的 pPIC9K-RGD-K5质粒电转化到毕赤酵母GS115中，电转参数电压1.5kV，电容25^，电 阻200Q。高浓度G418抗生素(浓度3 mg/ml)筛选的阳性酵母菌经小量表达，挑选出高拷 贝菌株后，接种3mlYPD试管，30。C 250rpm培养过夜，以1%接种于含200 ml BMGY培 养基的1L三角瓶，以甘油为碳源扩增菌体，30。C 250rpm培养至OD600 —定值(大约2天 以后)，室温下1500g离心5min收集菌体细胞，将菌体细胞悬浮在100 ml BMMY培养基， 以甲醇为碳源诱导表达，将菌体悬浮液置于1L三角瓶中，重新盖上三角瓶，再放回培养箱 继续生长，每24h加100%甲醇至终浓度为1%，保持诱导，48h后离心收集酵母上清。
(2) RGD-K5的纯化:酵母上清用65%饱和度硫酸铵盐沉淀过夜，离心收取沉淀并溶于20ml 平衡盐缓冲液中(20mMTris-HCl， lmMEDTANa2， pH8.5)， 4'C条件下透析3次，每次4 h。 透析液为(20mMTris-HCl， lmM EDTANa2， pH 8.5)，采用2L大体积透析。将样品加入 UNOsphere Q cartridge阴离子交换层析过柱，通过含0.2mol/LNaCl的洗脱液将RGD-K5洗脱。 流出液经Tricine SDS-PAGE电泳检测，结果如图4所示，RGD-K5集中在0.2mol/L NaCl的 洗脱液中，所以以此为纯化蛋白。由条带深度可知，RGD-K5的纯度在90%以上。
(3) RGD-K5的鉴定用16.5% Tricine SDS-PAGE电泳检测RGD-K5蛋白，由图2可知， 分子量约为17kDa，比野生型K5蛋白(15kDa)略大，与理论值相符。上述制备的酵母表达 上清经Tricine SDS-PAGE电泳后，15V、 30分钟条件下电转PVDF膜，10%小牛血清白蛋白 封闭非特异性结合位点1.5h，加入RGD-K5蛋白的多克隆抗体(1 : 500)，于4'C过夜，TBST 溶液洗涤lh后，加1 : 50000稀释的HRP标记二抗，置于室温振荡2h,用TBST溶液洗涤2h 后，在新鲜的ECL底物(Millipore)液中反应3 min,进行医学X-光片曝光。由图3可知，显 色条带位置与16.5% Tricine SDS-PAGE电泳结果一致，免疫印迹实验证实了利用毕赤酵母表 达的RGD-K5蛋白的特异性。
3. 体外实验检测RGD-K5蛋白活性(1) 鸡胚尿囊膜试验种蛋在37'C培养箱(保持一定的湿度)蛋架上孵育7天。孵育 第7天，在种蛋钝端消毒后用无菌的眼科剪开一1.5cmxl.5cm窗口，剥除壳膜后暴露鸡胚尿 囊膜，将6mm直径大小的滤纸小碟放置于血管较少的部位，用微量加样器将1吗RGD-K5或 K5蛋白滴入小蝶中，阴性对照组用等体积无菌PBS缓冲液。用无菌透明胶带封窗后放入孵 化箱，37。C继续孵化48h。活体拍照，分析给药区血管形成情况。图5a为K5、 RGD-K5和 PBS作用后，鸡胚尿囊膜照片，图5b为K5、 RGD-K5和PBS组血管占鸡胚尿囊膜总面积的 比率，其大小分别为20.1%、 9.12%、 9.25%，与PBS组相比，K5和RGD-K5对新生血管有 显著的抑制作用，抑制率分别达到54.77 %和55.50°/。，但无明显差异。
(2) 内皮细胞增殖试验人脐静脉内皮细胞经胰酶消化后，接种在96孔板中(2000个 /孔)，于37'C培养箱培养24h， RGD-K5或K5加入细胞培养基中使其终浓度达到5吗/ml ， PBS为阴性对照，培养箱孵育48h，用MTT标准方法检测存活的内皮细胞数量。结果如图6， 与阴性对照相比，K5和RGD-K5对血管内皮细胞具有较为有效的抑制，抑制率分别为23.48% 和29.33%，活性相似，无显著差异。
在体外实验中，K5经RGD修饰后具有很强的抗血管和抗内皮的活性，但是其效果并没 有显著提高，可能是因为局部用药，无法显示其肿瘤靶向的优越性。
(3) 肿瘤细胞迁移试验黑色素瘤细胞(B16F10)在培养板中长满后，用200pL枪头 在细胞表面划一划痕，PBS洗去细胞碎片，用含有10ng/mlRGD-K5或K5的无血清培养基培 养，PBS治疗组作为阴性对照，显微镜下用尼康照相机对不同时程的划痕拍照。结果如图7， 20h时，K5和PBS作用的肿瘤细胞分别使划痕距离减少了 86%和91%，无明显抑制，而 RGD-K5作用的肿瘤细胞却只使划痕减少了 44%，由此可知，K5经RGD修饰后，产生了显 著的抑制肿瘤细胞迁移的活性。
4.体内实验检测RGD-K5蛋白活性
小鼠肿瘤模型在雌性C57BL/6J小鼠中建立黑色素肿瘤动物模型，每只小鼠于后背部皮 下注射lxio5个黑色素瘤细胞，待肿瘤长至500mm3以5 mg/kg/day的剂量连续9天腹腔注射 K5、 RGD-K5，或者PBS替代作阴性对照，肿瘤的体积每两天测量一次(公式肿瘤的体积= 长度x(宽度)、0.52)。在第9天处死小鼠并取出肿瘤组织，福尔马林固定2天，应用常规方法 制作石蜡切片，经去蜡、水化、抗原修复后，用Ultrasensitive S-P immunohistochemistry试剂 盒检测血管(所用一抗为1 : 250稀释的兔抗VEGFR2单克隆抗体)，DAB显色后，镜下观察 血管生成情况。肿瘤生长情况如图8所显示，与K5相比，RGD-K5显示了更强的抗肿瘤活性。 图9a为低倍镜下拍摄K5、 RGD-K5， PBS组的肿瘤切片；图9b为各组切片的血管在低倍镜 下记数，与K5相比，RGD-K5显示了更强的抗血管生成活性。序列表
本发明所述抗肿瘤药物一RGD修饰的人纤溶酶原K5的氨基酸序列为-P HRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYD YCDVPQCAA c
含有RGD基序的上游引物和下游引物
上游引物5，-CG CTC GAG AAA AGA GCA TGC GAC TGC CGT GGT GAC TGC TTCTGC GGT GGT GGT GGT GTC CTG CTT CCA GAT GTA G;
下游引物3，-GC GAATTC TAG GCC GCACAC TGAGGGAC。
权利要求
1.RGD修饰的人纤溶酶原K5，其特征在于其蛋白的氨基酸序列为ACDCRGDCFCGGGGVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAA，其分子量大小为17kDa。
2. 如权利要求1所述的RGD修饰的人纤溶酶原K5的制备方法，其特征在于包括以下 步骤1) 设计和构建RGD-K5序列根据K5全长序列，及表达载体pPIC9K的多克隆位点， 设计合成含有RGD基序的上游引物，下游引物同野生型，将测序鉴定正确的、含有K5cDNA 序列的质粒pPIC9K-K5为模版，应用设计的引物PCR扩增，并Wo I和￡Coi I双酶切PCR 产物和载体pPIC9K,用T4 DNA连接酶进行连接，获得pPIC9K-RGD-K5质粒；2) 表达、纯化和鉴定RGD-K5蛋白将经限制性内切酶Sfl/I线性化、去磷酸化处理的 pPIC9K-RGD-K5质粒电转化到毕赤酵母GS115菌株中，通过PCR方法鉴定阳性重组子，阳 性重组子经甲醇小量诱导表达，筛选高拷贝阳性菌株进行大量诱导表达，收集部分酵母上清， 经三氯乙酸沉淀法浓缩蛋白后，TricineSDS-PAGE电泳检测，17kDa处有预期的条带，同时 通过Western Blot试验利用兔抗K5多克隆抗体鉴定其特异性，纯化浓縮蛋白和透析后， UNOsphereQ cartridge阴离子交换层析过柱，用洗脱液过柱，流出液即为纯化的RGD修饰的 人纤溶酶原K5。
3. 如权利要求2所述的RGD修饰的人纤溶酶原K5的制备方法，其特征在于所述诱导 表达的培养条件为28 3CTC， 250rpm， 48h，按体积比，每24h在培养液中补加甲醇，甲醇 的加入量为培养液总量的1%。
4. 如权利要求2所述的RGD修饰的人纤溶酶原K5的制备方法，其特征在于所述纯化 浓縮蛋白和透析采用65%饱和度硫酸铵盐沉淀法。
5. 如权利要求2所述的RGD修饰的人纤溶酶原K5的制备方法，其特征在于所述洗脱 液用含0.2mol/L NaCl的洗脱液。
6. 如权利要求1所述RGD修饰的人纤溶酶原K5用于抗肿瘤治疗。
全文摘要
RGD修饰的人纤溶酶原K5及其制备方法与应用，涉及一种人纤溶酶原。提供一种抗肿瘤蛋白-RGD修饰的人纤溶酶原K5及其制备方法与在抗肿瘤治疗中的应用。其氨基酸序列为ACDCRGDCFCGGGGVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAA，其分子量大小为17kDa，该蛋白的肿瘤靶向性和特异性显著比野生型K5提高。1)设计和构建RGD-K5序列。2)表达、纯化和鉴定RGD-K5蛋白。
文档编号C12N9/96GK101649312SQ200910112480
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月4日 优先权日2009年9月4日
发明者洋 王, 王恩华, 苏文松, 庆 葛, 聪 谭, 郭中强, 金光辉 申请人:厦门大学