专利名称：鉴别中国地方猪抗F4ac仔猪腹泻的分子标记及选育应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物分子生物学技术及育种领域，尤其是涉及一个鉴别中 国地方猪种新生和断奶仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的分子标记及其在中国 地方猪种猪遗传改良选育中的应用。
背景技术：
仔猪腹泻是养猪生产中的常见传染病，给世界养猪业造成了巨大经济 损失。丹麦养猪业大规模的场间调查表明6%-7%的新生仔猪患有腹泻病， 使断奶前仔猪的死亡率达2.7%,占此期间整个死亡率的11.9%。即使是病 愈个体，也会严重影响生长发育，有的形成僵猪，导致饲养成本增加，销 售收入下降。
产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Esc/ m.c/nVat co//, ETEC ) F4是引 发新生和断奶前仔猪腹渴病的最主要致病菌，以我国和丹麦为例，分别有 约35%和40%的仔猪腹泻病是因ETECF4侵染而引起的。在我国，其致死 率在10%-30%之间，在个别地方甚至比这个比例更高。
ETEC F4根据免疫学特征分为ab， ac和ad三种亚型，其中F4ac是最 主要的致病原，在美国、西班牙和韩国，ETEC仔猪腹泻病例中只分离到 F4ac亚型。ETEC F4入侵猪肠道后，通过其特异性黏附素附着于小肠上皮 细胞表面的受体，大量繁殖产生肠毒素，致使肠上皮细胞分泌功能亢进， 大量水和电解质进入肠腔，造成肠腔中大量液体积蓄，超过了肠壁重吸收 能力而引起腹泻。由此可见，仔猪小肠上皮细胞有无ETECF4受体，特别 是有无F4ac受体是仔猪被ETEC F4感染时是否发病的关键。无受体猪表现 为抵抗型，有受体猪则表现为易感型。分离和鉴别猪ETEC F4ac受体基因 及其抗性位点因而成为猪ETEC F4ac腹泻抗病育种的关键。
1995年，瑞典LeifAndersson小组利用欧洲野猪x大白猪资源家系群体 为材料，经过三代系i普的连锁分析，首次将ETEC F4ac受体定位于13号染 色体，与Tf基因紧密连锁。2002年，瑞士 Peter Vogeli小组以大白猪和大 白x长白三代家系为材料，利用13号染色体更多的微卫星标记信息，将F4ac 受体进一步定位于S0068和Swl030之间，与其中的S0075和Sw225高度连锁(0=0.00 )。这一结果在一年后瑞典Leif Andersson小组和丹麦J0rgensen 小组联合开展的基因定位研究中得到了验证，他们还利用FISH和辐射杂种 细胞克隆板技术揭示F4ac受体位于13号染色体q41区(SSC13q41 )，分别 与人3号染色体的q28-29和q21区同源。最近，Joller等通过精细定位进一 步将ETECF4ac受体基因定位于q41区域SW207与S0283之间。t研究小 组通过利用大规模白色杜洛克x二花脸资源家系群体在13号染色体上采用 高密度微卫星标记将F4ac受体基因精细定位于S0283邻近区域。
此外，Grange等对F4受体的性质做了一系列详细的研究，在猪小肠上 皮细胞分离到两种粘液型唾液酸津唐蛋白(Intestine mucus glycoprotein, IMTGP),分子量分别为210 kDa (IMTGP画1)和240 kDa (IMTGP國2 )，这两 种蛋白被认为是猪对F4ac易感性和抗性重要的决定因子。而研究表明表达 粘液素蛋白的Aff/O/基因位于猪13号染色体S0283邻近区域，结合其生理 生化功能分析，认为Aft/0/基因极有可能是肠毒素大肠杆菌F4ac受体的一 个重要候选基因。
鉴于以上背景情况，申请人深入开展了猪Mt/OZ基因及其邻近区域多 态性的搜寻、鉴别及其影响仔猪ETEC F4ac腹泻病性状的研究，以期建立 标记辅助选择技术开展断奶仔猪腹泻病的抗病育种工作。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一个鉴别中国地方猪种断奶仔猪F4ac腹泻 易感性/抗性的分子标记，通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用 标记辅助选择(MAS)选择有利的基因型个体留种，可以显著提高中国地 方猪种种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。
本发明的第二个目的是该分子标记在选育改良中国地方猪种种猪抗腹 泻病性状中的应用。
本发明的第一个目的是这样实现的 (1) Mt/C4基因邻近区域大规模多态位点(SNP)搜寻 自ENSEMBLE网站(http:〃www.ensembl.org/index.html)上搜寻到孩i 卫星标记S0283在猪13号染色体位置为94,369,614 bp - 94,369,755 bp。以 S0283为中心，前后延伸5 Mb，即以chromosome 13: 89,369,614 bp -99,369,755 bp为查询号，提交到ENSEMBLE网站上，下载得到猪13号染 色体S0283附近10 Mb的DNA序列。同时自NCBI网站(National Center for Biotechnology Information, http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/ )下载S'J 29369 bp的猪Mt/C4基因的部分DNA序列(序列号DQ848681 )。用该29369 bp序 列锚定下载的SSC13序列，前后再分别延伸约50 kb，则得到一段130 kb 的DNA序列，嚢括了猪MUO/基因的全部DNA序列。
选取白色杜洛克和二花脸8个ETEC F4ac祐附表型极端的个体，其中 4个为强黏附型，4个为不黏附型。在已获得的130kb的DNA片段中共设 计34对引物，其中MUC4基因外的侧翼序列每5kb设计一对引物， 基因内每2kb设计一对引物，均对以上8个个体进行PCR扩增，采用比较 测序法鉴别多态性位点，以大规才莫搜寻单核苷酸多态标记(SNPs )。
在130kb范围内共鉴别到了 104个SNPs。选择其中分布均匀和具有代 表性的70个多态位点，在12个中国地方猪种的148头远》彖群体中进行基 因分型，有64个SNP位点成功分型。随后利用分型成功的基因型数据开展 大规模SNP位点多态性与ETEC F4ac黏附表型之间的单点和多点关联性分 析。关联性分析结果表明，M70/基因邻近区域的SNPA183G位点多态性 与中国地方猪ETEC F4ac黏附表型关联性最显著(i^2.68E-12 )。
(2) SNPA183G的具体鉴别过程
利用上述来自ENSEMBLE网站(http:〃www.ensembl.org/index.html) 的嚢括了猪Mf/C4基因的一段130 kb的DNA序列，使用公用的Primer 5.0 软件设计引物F1和R1 (Fl: 5'-G CTT AGA CAG TGA GAC ATC AAC ATC-3，和Rl: 5，- AAT TAC AGG TGA CAC GCT TCC -3，)扩增猪基因组 DNA (脱氧核糖核酸)。25 pl的聚合ilM式反应(PCR)反应体系中，包括 25ng猪基因组DNA, 1.0mMMgCl2, 100 mM dNTP (合成DNA的四种脱 氧核苷酸底物)，正反向引物各10 pmol， 2单位DNA聚合酶(Taq酶)及 1 xPCR buffer(緩沖液)(上海生物工程公司，中国)。扩增条件为94 。C 4 min; 94 。C 30 s， 58 。C 30 s, 72 。C 60 s,共34个循环；最后在72 。C延伸10 min。 扩增片段采用QIAquickPCR产物纯化试剂盒(QIAGEN，德国)纯化，由 华大基因上海测序中心测序。采用美国国家生物技术信息中心(NCBI, National Center for Biotechnology Information, http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov) 网站公用的BLAST软件，将测序后获得的DNA序列与上述130 kb的DNA 序列进行同源性比较，结果显示该序列与已公布序列同源性在99%以上， 由此说明此段序列为目的序列。然后选取8个ETEC F4ac黏附表型极端个 体，其中4个为强l占附型，4个为不黏附型。采用上述引物F1和R1对以 上8个个体进行PCR扩增，采用比较测序法测序，使用公用的DNAStar软
5件包中的SeqMan软件分析测序结果时，发现在该序列的第183个核苷酸处 存在一个单核苷酸多态位点(SNPs),即SNPA183G位点。
(2)位于猪13号染色体Mt/OZ基因邻近区域、包含183bp处突变位 点(SNPA183G)的部分基因序列如下
tccttgggcttssc3ctgctgtaactttsasggggscttt60
ttttt3ttC3gasttatgsatsgstttgtttctsggsctctssgtcctstscctgctccc120
tcctcagtaaagttcataaacttcgtttctctagctaaggtttagattgg180
ccrtgs33ttattattsagctt3tttcctcttcctasgaasgcsacgctc240
tgtcttctggctttgsgtc3ccagatagaagct3gttsc3tgCC333Ctt300
ttsttatsgsttcttggcsstt33t3t3Cttttggsgcctgcstcacctctgtt3333tC360
33t3tt3gC3gc3333gtttcstgsttgc3csgtcc33gttttttaasgt33sgstttgt420
stttgtttgttC3t3333gtagtacagctct3ctcccsgcaatatggcag480
CCttt33Ct3gsgsscstgctaatgtgtaat333t3ttttctgsaitgctg540
3gctgagatc33gggagacgctcsggsgtgasggsgttgs600
tgctctcstscsstttggsgatttctgagatctsgsgtttggcatttt3a660
tggctgc3tg3C33tCtt3gtgtagsctgsatattttctg720
cataaagctggaaacctcsgtgaaaaggtggtctsg3333780
3gg3gg3gttccctggtggctcagtgggtt33ggstcc3gcgttttcsctgctggggctc840
tggttactgc tgag
(3) SNPA183G的基因分型
使用SNaPshot试剂盒(ABI公司，美国)开展基因分型。方法如下
1) 引物设计
设计引物对F2和R2 (F2: 5，- ACG TTG GAT GCT TAG GAA GAG GAA ATA AGC -3'和R2:5，國ACG TTG GAT GCT TCG TTT CTC TAG CTA AGG _3，)扩增包含要检测SNP A183G位点的DNA片^爻以及一条 SNaPshot延伸引物(5，-A AAA AAA AAA AAA GGA AAT AAG CTT AAT AATAATTTC -3,)。
2) PCR扩增条件及产物纯化
使用上述引物对F2和R2扩增猪基因组DNA。 25 pi的PCR反应体系 中，包括25ng猪基因组DNA， 1.0mMMgCl2， 100 mM dNTP，正反向引 物各10pmo1， 2单位Taq酶及lxPCR buffer (上海生物工程公司，中国)。 扩增条件为94。C4min; 94 °C 30 s， 56 。C 30 s, 72 。C 30 s,共35个循环；最后在72 。C延伸10 min。 PCR产物用2 %琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。 取3pl PCR产物，加入lpl ExoSAP-IT酶(上海国药集团公司，中国)37。C 醉育15min,然后80。C处理15min灭活酶。PCR产物纯化后稀释4倍备用。
3 ) SNaPshot反应及产物纯化
SNaPshot反应体系为SNaPshot反应混合物(Multiplex Ready Reaction Mix) 2^1; SNaPshot延伸引物0.5|xl (引物终浓度为0.2nmol/L );上述纯 化稀释PCR产物1.5nl;去离子水1^1。SNaPshot循环参数为96°C 10s,50°C 5 s， 60°C 30 s，共25循环。取5pil SNaPshot反应产物加入0.57^1 lOxbuffer 和O.lnlCIP (SNaPshot反应产物纯化酶)在37。C下孵育lh,然后75。C处 理15min灭活酶达到产物纯化效果，-20°(:保存备用。
4 ) 3130XL遗传分4/H义电泳
电泳混合体系包括9.25nlHi-Diformamide (曱酰胺变性剂)；0.5|il上 述经纯化后的SNaPshot反应产物；0.25jil GeneScan 120 LIZ size standard (电泳分子内标)。体系混合后于95。C变性5min然后立即置于冰上处理 2min。离心上样。
具体判型方法如附图2所示。
本发明的第二个目的是这样实现的本发明利用这个多态位点及侧翼 DNA序列信息，采用分子生物学技术鉴别个体基因型，针对抗腹泻病性状 选育中国地方猪种种猪。
本发明鉴别了一个影响中国地方猪种断奶仔猪抗腹泻病性状的单核苷 酸多态性(SNP)位点，通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标 记辅助选择(MAS)选择有利的基因型个体留种，可以显著提高中国地方 猪种种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。
图1为本发明鉴别的猪SNPA183G突变位点的序列峰图2为SNPA183G位点的SNaPshot判型图，其中a为GG型；b为爿G 型；c为^4型；
图3为ETECF4ac与刷状缘的黏附检测结果，(a)为不l占附型，(b)为黏 附型。
具体实施例方式
下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。 选择中国地方猪种种猪核心群个体，利用上述的SNaPshot方法鉴别猪 13号染色体Mf/OZ基因邻近区域SNP A183G位点的基因型，选择有利的 基因型个体(^4型)留种，群体继代选育后改良中国地方猪种种群的抗仔 猪腹泻病性能。实施例
利用148头代表我国6个生态类型(包括华北、华南、华中、江海、西 南、高原型等)的12个地方猪种纯种仔猪作为实验动物，每个猪种选取至 少3个父系家系，每个家系选择3-4个l-2月龄个体；148头纯种仔猪屠宰 后，取小肠空肠部分，提取小肠上皮细胞刷状缘，利用￡.co// F4ac菌林#占 附猪小肠上皮细胞刷状缘，通过相差显微镜检测细菌的黏附结果。每个样 品检测20个以上的刷状缘,若有10。/o以上的刷状缘上至少有2个细菌勦附， 判该样品为勦附型，若至少有2个细菌黏附的刷状缘不到10%， <旦有1-2 个细菌黏附的刷状缘多于10%,判该样品为弱黏附型，否则判为不翻附型。 黏附效果图如附图3所示 ' ， ，
采用SHE在线7>用软件分析这个SNP位点多态性与实-验猪只ETEC F4ac 勦附表型性状之间的关联性(见表1 )。结果表明SNP A183G多态性与ETEC F4ac的侵染易感性呈极显著相关(P=2.68E-12; LogP=11.57), G等位基因 为易感基因，J等位基因为抗性基因；基因型GG和」G个体对ETEC F4ac 的侵染易感，^4型个体对ETECF4ac的侵染具有抵抗性(表2)。 A4型个 体是抗腹泻病型猪的选育改良所需的基因型个体。在商业种猪核心群中， 继代选育型个体，可以进一步改良中国地方猪种种群的抗腹泻病性状， 减少仔猪的死亡率。
表1 SNPA183G多态性与ETEC F4ac黏附表型的关联分析
SNP位点P值LogP值
SNPA183G2.68E-1211.57
表2 SNPA183G位点在实验猪群体中的基因型和ETEC F4ac翁附表型分布
— _____ 黏附表型
标记位点
基因型 一
黏附(+)不點附(一)
AA26100
AG171
GG40
SNPA183G
权利要求
1、一种鉴别中国地方猪抗F4ac仔猪腹泻的分子标记，其特征在于该分子标记的DNA序列如下所示tgttagaaag tccttgggct ttaacccaaa taacactgct gtaactttaa aggggacttt60tttttattca gaattatgaa tagatttgtt tctaggactc taagtcctat acctgctccc 120tcctcagtaa agttcataaa cttcgtttct ctagctaagg tttagattgg aagacataca 180ccrtgaaatt attattaagc ttatttcctc ttcctaagaa cataaataaa agcaacgctc 240tgtcttctgg ctttgagtca ccagatagaa gctagttaca tgccaaactt actaataaac 300ttattataga ttcttggcaa ttaatatact tttggagcct gcatcacctc tgttaaaatc 360aatattagca gcaaaagttt catgattgca cagtccaagt tttttaaagt aaagatttgt 420atttgtttgt tcataaaagt agtacagctc tactcccagc aatatggcag aagagacaaa 480cctttaacta gagaacatgc aaatgccaga taatgtgtaa taaatatttt ctgaatgctg 540agctgagatc cgaagaaaga aagggagacg ctcaggagtg aaggagttga aaactaagat 600gataagtaag tgctctcata caatttggag atttctgaga tctagagttt ggcattttaa 660tggctgcatg gagaaaggaa acaatcttag atcaggacac tgtagactga atattttctg 720cataaagctg gaaacctcag tgaaaaggtg gtctagaaaa atcaaaaaga aaaaagaaaa 780aggaggagtt ccctggtggc tcagtgggtt aaggatccag cgttttcact gctggggctc 840tggttactgc tgag
2、 4財居权矛J^求1所述的分子标记，其特征在于所述DNA序列第183个核 苷^t^在一个A183-G183的4tt突变。
3、 才財居权矛J^求2所述的分子标记，其特征在于检顶'j4tt突变的正、反向引 物以及一条SNaPshot延伸引物的核苦^列如下所示正向5，- ACG TTG GAT GCT TAG GAA GAG GAA ATA AGC誦3' 反向5 ，- ACG TTG GAT GCT TCG TTT CTC TAG CTA AGG画3' SNaPshot延伸引物5 ， -A AAA AAA AAA AA AGG AAA TAA GCT TAA TAATAATTTC -3,。
4 、鉴别中国地方猪抗F4ac仔猪腹竭的分子标记在选育改良中国地方猪种种 猪抗腹泻病性状中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别中国地方猪种新生和断奶仔猪F4ac腹泻易感性/抗性的分子标记及其在中国地方猪种种猪遗传改良中的应用，它通过克隆得到如序列表中所示的DNA片段，并在该序列的第183bp处鉴别到一个单核苷酸多态性(SNP)A183G，再采用SNaPshot方法对SNPA183G进行基因分型。本发明还公开了获得上述分子标记及相关引物的制备方法以及利用本发明克隆的分子标记进行中国地方猪腹泻性状关联分析的方法。本发明通过现代分子生物学技术检测该多态位点，利用标记辅助选择(MAS)选择有利的基因型个体留种，可以显著提高中国地方猪种种群断奶仔猪的抗腹泻病能力，大大减少仔猪死亡率。
文档编号C12Q1/68GK101603089SQ20091011571
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月20日 优先权日2009年7月20日
发明者军 任, 晏学明, 艾华水, 黄路生 申请人:江西农业大学