专利名称：使用纳米脂质体免疫佐剂制备抗小分子物质抗体的方法
技术领域：
本发明专利属于免疫学技术领域，具体涉及制备抗小分子物质抗体的方法。
背景技术：
抗原是能够刺激动物机体产生免疫应答的外源性物质。免疫佐剂又称非特异性免 疫增生剂，本身不具抗原性，但同抗原一起注射到机体内能增强免疫效果。免疫佐剂 的生物作用包括(1)改变了抗原的物理性状，使抗原物质缓慢地释放，延长抗原的 作用时间；(2)增加了抗原的表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬；(3)佐剂能刺激 吞噬细胞对抗原的处理；(4)佐剂可促进淋巴细胞之间的接触，增强辅助T细胞的作 用。
脂质体生物靶向技术因其"人工生物膜"与细胞膜的高度亲和性，以极强的穿透 力进入靶细胞内发挥作用，已被世界医药界称为"二十一世纪生物导弹"。在疫苗研究 领域，脂质体由于其在体内能够迅速被免疫细胞捕获，体现出令人瞩目的高效乾向作 用，已经被看作一种颇具前景的新型免疫佐剂而被业界寄以厚望。脂质体包封抗原可 使抗原延缓释放，并且脂质体颗粒有刺激机体免疫反应的作用。作为一种新型佐剂， 脂质体在疫苗领域获得了成功。
能够刺激动物免疫系统产生抗体的物质称为抗原，抗原一般需要有大于10000Da 的分子量和复杂的结构。分子量小于1000的物质只能被抗体识别而不能刺激产生抗 体，这样的物质称为半抗原。要产生针对小分子半抗原物质的抗体，必须把其共价偶 联到大分子载体上构成人工免疫抗原，免疫动物产生针对小分子物质的抗体。而有的 小分子物质进入动物体内后不稳定或容易受其它因素的干扰，釆用传统的乳化佐剂难 以产生高滴度的抗体。
把抗原包埋在纳米脂质体内部，通过静脉注射对动物进行全身系统免疫，刺激动 物免疫系统产生高滴度的特异性抗体。脂质体双分子层隔绝生物体内酸、酶、金属离 子等因素对所包埋抗原的作用，有效防止其的分解、变性、失活；通过静脉注射，脂 质体进入体内迅速汇集到动物中枢免疫系统，能够快速产生免疫应答；这些优点很适 合制备针对小分子物质的单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是把偶联小分子物质的人工免疫抗原包埋在脂质体内，注射到动物 体内进行免疫。脂质体双分子层隔绝生物体内酸、酶、金属离子等因素对所包埋抗原 的作用，有效防止其的分解、变性、失活；通过静脉注射，脂质体进入体内迅速汇集 到动物中枢免疫系统，能够快速产生免疫应答；这些优点很适合制备针对小分子物质 的单克隆抗体。
在制备小分子物质(兽药、真菌毒素等)抗体的过程中，需要把小分子化学偶联 到蛋白质载体上，合成人工抗原增加小分子物质的免疫原性，然后免疫动物产生针对小分子物质的抗体。
一些小分子物质经过化学修饰连接到蛋白质后，稳定性降低。另一方面，当人工 抗原进入动物体内，PH、酶、'金属离子等因素会对一些小分子物质产生影响。传统的 免疫途径使用乳化佐剂与抗原混合，对动物进行皮下多点注射免疫，需要较长时间抗 原才能被捕获、加工、提呈，继而刺激免疫系统产生抗体。如果缩短抗原提呈过程， 稳定性低的小分子物质分解可能性降低，人工抗原受pH、酶、金属离子等因素影响减
少，产生特异性抗体的机会增加。 本发明是通过以下技术方案实现的。
使用纳米脂质体作为新型免疫佐剂，包埋偶联小分子物质的人工抗原免疫动物， 进入动物体内后快速实现抗原提呈产生特异性免疫应答。使用脂质体免疫佐剂包埋小
分子人工免疫抗原，免疫动物产生特异性抗体的各个步骤如下
(1)将包埋材料大豆卵磷脂和胆固醇以1.8-2.5/1的重量比混勻，再以W/V为 1/500-800的比例溶解于二氯甲烷溶剂中，加入到圆底烧瓶，在旋转蒸发器上35-40 'C减压蒸干，使大豆卵磷脂和胆固醇贴在容器壁上形成双分子层薄膜；
(2 )在圆底烧瓶中加入浓度为1. 5-2. 0 mg/mL、与包埋材料的物料比为2. 0-2. 5/1 的抗原溶液，强烈晃动，包埋材料分散到溶液中并在表面张力作用下收缩成球状脂质 体，把部分的抗原包埋到脂质体内部，其中缓冲液用pH=6.8-7.2的20mM的PBS;使 脂质体的粒径控制在合适范围并获得高抗原包封效率。粒径和对小分子人工免疫抗原 的包封效率，是影响免疫效率的两个关键的因素，脂质体的粒径控制在50-100nm，以 包封在脂质体的小分子人工免疫抗原的比例为35-50%。
(3)以包封在脂质体的小分子人工免疫抗原计算，以每次200-300吗/只小鼠的 量进行静脉注射免疫；在初次免疫之后第3-4周，以同样免疫剂量对小鼠静脉注射脂 质体包封的抗原，进行第一次加强免疫；在与第一次加强免疫相隔大于2-4周的时间 段里，以同样免疫剂量对小鼠静脉注射脂质体包封的抗原，进行第二次加强免疫；选 择特异性抗体效价高的小鼠用于细胞融合实验，筛选所需要的单克隆抗体。
抗原包封率的计算将上述条件所制备的包埋了小分子人工免疫抗原的脂质体， 以"00-5000rpm的速度进行离心，检测上清溶液的蛋白质浓度并计算上清液中的蛋白
量，推算出被包埋的人工免疫抗原.的量，除以人工免疫抗原的总投料量，就是人工免 疫抗原包埋在脂质体内部的包封率。
抗原免疫量的计算人工免疫抗原的总量，乘以人工免疫抗原包埋在脂质体内部 的包封率，就是包埋在脂质体内部的人工免疫抗原的量。
本发明的有益效果是①包埋材料大豆卵磷脂、胆固醇生物相容性好，能够在动 物体内被降解、无毒性；②脂质体进入外周血分布到淋巴结和中枢免疫器官，迅速被 免疫细胞捕获实现抗原提呈；③抗原被包埋在脂质体内部，能够避免受pH、酶、金属 离子等因素的影响，增加抗原的稳定性，确保免疫效果。
图1为脂质体(liposome)结构示意图。其中 图1A磷脂在水中形成单层结构，亲水端向下，疏水端向上； 图1B在表面张力的作用下，磷脂单层收缩成为疏水端向内的球体； 图1C在一定条件下，磷脂形成双分子层结构的脂质体；
图1D脂质体内部是亲水层，中间是疏水层，分别包埋不同的物质，a为疏水性物 质，b为疏水层，c为亲水性物质。
图2为在金属离子螯合作用下，喹诺酮药品母核抗原表位被金属离子遮蔽的情况 的示意图。其中d为载体蛋白，e为喹诺酮药品母核，f为喹诺酮药品母核抗原表位被 金属离子遮蔽。
图3为制备抗羟氨苄青霉素抗体时，羟氨辛青霉素分子中四元环不稳定的情况示 意图。其中g为羟氨苄青霉素，h为载体蛋白，i为羟氨苄青霉素的羧基于蛋白质氨 基结合，J为P内酰胺环容易开环降解。
具体实施例方式
本发明将通过以下实施例作进一步的说明。
实施例1。使用脂质体免疫途径制备抗氟喹诺酮抗生素母核单克隆抗体。 如附图2左所示，方框部分是氟喹诺酮抗生素母核，是几十中氟喹诺酮类药品的 共同结构，得到抗氟喹诺酮抗生素母核的抗体，就能够检测食品中氟喹诺酮类药品的 总残留量。但是，如附图2右所示，氟喹诺酮抗生素母核会在体内会与金属离子发生 螯合，继而与其它蛋白发生结合而被掩蔽，难以顺利产生抗氟喹诺酮抗生素母核的特 异性抗体。
使用传统的弗氏佐剂进行免疫，要先将抗原溶液与弗氏佐剂等量混合，充分振动 乳化之后对动物进行皮下多点注射。在皮下注射到活化特异性B细胞的漫长过程中， 抗原、抗原-MH,CII复合物一直被血液、淋巴液中的4丐、镁、铁、锌等金属离子包围， 喹诺酮母核位点随时会与这些金属离子螯合而被遮蔽。
利用本发明技术，使用逆向蒸发法，包埋材料大豆卵磷脂和胆固醇以2.0/1的重 量比混句，再以W/V为1/500的比例溶解于二氯甲烷溶剂中，加入到圆底烧瓶，在旋 转蒸发器上35。C减压蒸干，使大豆卵磷脂和胆固醇贴在容器壁上形成双分子层薄膜； 在圆底烧瓶中加入浓度为1.5mg/mL、与包埋材料的物料比为2. 0/1的抗原溶液，强烈 晃动，包埋材料分散到溶液中并在表面张力作用下收缩成球状脂质体，把突出氟喹诺 酮抗生素母核的人工抗原(如图2)包埋在脂质体中，其中缓冲液用pH=6.8的20mM 的PBS;以每只小鼠200ng的抗原量，采取静脉注射的方式对小鼠进行免疫，初免第 21天进行二免，第35天进行三免，第50天进行融合前加强免疫，3-5天后进行融合。 在脂质体的介导下，抗原直接进入抗原提呈细胞，避免了与体液过多接触，减少了氟 喹诺酮抗生素母核抗原表位被螯合遮蔽的概率，有利于动物免疫系统产生针对基团表 位的免疫应答。
与传统弗式佐剂相比，通过脂质体免疫途径免疫小鼠，获得的小鼠血清抗氟喹诺酮抗生素母核抗体的效价提高了io倍，为制备抗氟喹诺酮抗生素母核单克隆抗体创造
了非常有利的条件。
实施例2。使用脂质体免疫途径制备抗羟氨苄青霉素单克隆抗体。
如附图3所示，羟氨苄青霉素通过羧基与载体蛋白上的氨基反应，连接到载体蛋 白上合成人工抗原免疫动物，希望能够得到抗羟氨苄青霉素的抗体。
但是，羟氨苄青霉素结构中的P-内酰胺四元环由于键角张力大，容易水解开环。 用传统的乳化佐剂混合人工抗原，注射到动物皮下进行免疫，产生免疫应答需要的时 间较长，在这过程中羟氨苄青霉素的P-内酰胺四元环可能发生开环降解，得不到针对 羟氨苄青霉素的特异性抗体。
利用本发明技术，使用逆向蒸发法，包埋材料大豆卵磷脂和胆固醇以1.8/1的重 量比混匀，以W/V为1/800的比例溶解于二氯甲烷溶剂中，加入到圆底烧瓶，在旋转 蒸发器上35-4(TC减压蒸干，使大豆卵磷脂和胆固醇贴在容器壁上形成双分子层薄膜。 在圆底烧瓶中加入浓度为2. 0mg/mL、与包埋材料的物料比为2. 5/1的抗原溶液，强烈 晃动，包埋材料分散到溶液中并在表面张力作用下收缩成球状脂质体，把偶联羟氨节 青霉素的人工抗原(如图3)包埋在脂质体中，其中缓冲液用pH-7.2的20mM的PBS; 以每只小鼠300^ig的抗原量，釆取静脉注射的方式对小鼠进行免疫，初免第21天进行 二免，第35天进行三免，第50天进行融合前加强免疫，3-5天后进行融合。在脂质 体的介导下，抗原直接进入抗原提呈细胞，大大縮短了产生免疫应答的时间，减少了 羟氨节青霉素的P-内酰胺四元环发生开环降解的可能，有利于动物免疫系统产生针对 基团表位的免疫应答。
使用传统弗式佐剂产生特异性抗羟氨苄青霉素抗体效价不高，通过脂质体免疫途 径免疫小鼠，顺利获得了高效价特异性抗羟氨苄青霉素抗体。
权利要求
1、使用纳米脂质体免疫佐剂制备抗小分子物质抗体的方法，其特征是(1)将大豆卵磷脂和胆固醇以1.8-2.5/1的重量比混匀，再以W/V为1/500-800的比例溶解于二氯甲烷溶剂中，加入到圆底烧瓶，在旋转蒸发器上35-40℃减压蒸干，使大豆卵磷脂和胆固醇贴在容器壁上形成双分子层薄膜；(2)在圆底烧瓶中加入浓度为1.5-2.0mg/mL、与包埋材料的物料比为2.0-2.5/1的抗原溶液，强烈晃动，其中缓冲液用pH＝6.8-7.2的20mM的PBS；脂质体的粒径控制在50-100nm，包封在脂质体的小分子人工免疫抗原的比例为35-50％；(3)以包封在脂质体的小分子人工免疫抗原计算，以每次200-300μg/只小鼠的量进行静脉注射免疫；在初次免疫之后第3-4周，以同样免疫剂量对小鼠静脉注射脂质体包封的抗原，进行第一次加强免疫；在与第一次加强免疫相隔2-4周的时间段里，以同样免疫剂量对小鼠静脉注射脂质体包封的抗原，进行第二次加强免疫；选择特异性抗体效价高的小鼠用于细胞融合实验，筛选所需要的单克隆抗体。
全文摘要
使用纳米脂质体免疫佐剂制备抗小分子物质抗体的方法，属于免疫学技术领域，先将大豆卵磷脂和胆固醇以1.8-2.5/1的重量比混匀，再以W/V为1/500-800的比例溶解于二氯甲烷溶剂中，加入烧瓶，旋转蒸发器上35-40℃减压蒸干；然后加入浓度为1.5-2.0mg/mL、与包埋材料的物料比为2.0-2.5/1的抗原溶液，强烈晃动，其中缓冲液用pH＝6.8-7.2的20mM的PBS；以每次200-300μg/只小鼠的量进行静脉注射免疫；二次加强免疫；选择特异性抗体效价高的小鼠用于细胞融合实验，筛选所需要的单克隆抗体。本发明①包埋材料物相容性好，在动物体内易被降解、无毒性；②脂质体进入外周血分布到淋巴结和中枢免疫器官，迅速被免疫细胞捕获实现抗原提呈；③抗原被包埋在脂质体内部，增加抗原的稳定性，确保免疫效果。
文档编号C12P21/08GK101565726SQ20091011545
公开日2009年10月28日 申请日期2009年5月31日 优先权日2009年5月31日
发明者何庆华, 李燕萍, 杨 许, 郭杰标, 黄志兵 申请人:南昌大学