专利名称：：混合石蜡、pcr反应试剂的保存方法以及反应试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种混合石蜡，采用该混合石蜡对PCR反应试剂进行保存的方法以及含有该混合石蜡的PCR反应试剂盒。
背景技术：
：实时荧光定量PCR(RealTimePolymeraseChainReaction,RealTimePCR实时PCR)技术是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量或定性分析的方法。目前在&出科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。但是在一般的PCR试剂盒中(反应液体积一般为10(il~100nl),由于反应液体积较少，在高温条件或长途运输过程中，又易因蒸发而体积减少，造成反应液体积和成分的变化，从而影响检测结果；并且长时间保存后，反应液中的Taq酶(耐热性多聚酶)、UNG酶(尿嘧啶DNA糖基酶)易失活也影响扩增效率。如果能采用一种方法，能保证少量的反应液体积在高温或运输的条件下不发生体积和成分的变化，并且能长时间的保持Taq酶的活性，这将给PCR试剂盒的使用带来更大的方便。为解决上述问题，目前有两种方法，一种是使用植物油作为热启动PCR反应中的蒸汽障碍，以减少溶剂挥发，但这种方法并不能解决长时间保持Taq酶活性的问题，另一种是采用固体石蜡将PCR反应中的酶4与其他成分隔离，创造了更多的实用和有效的热启动PCR方法，但现有固体石蜡熔点太高，约为5070。C，而且在-20。C的条件下，PCR反应试剂只能保存1~2周。另外，若PCR反应体系中还含有UNG酶，UNG酶适合的作用温度为37~50°C,现有固体石蜡熔点太高，若要熔化，需要加热到5(TC以上，影响了UNG酶在PCR反应液中发挥防污染的作用，从而可能会影响实验结果。
发明内容本发明实施例的第一目的在于提供一种混合石蜡，用于将PCR反应中的酶与其他成分隔离，旨在解决PCR反应液在低温条件下长时间保存的问题。本发明实施例的第二目的在于提供一种利用上述混合石蜡进行PCR反应试剂的保存方法。本发明实施例的第三目的在于提供一种含有上述混合石蜡的PCR反应试剂盒。本发明实施例的混合石蜡，由液体石蜡(LiquidParaffin)和熔化后的固体石蜡(Paraffinwax)均匀混合而成，其中，固体石蜡选自熔点高于50°C的固体石蜡，固体石蜡和液体石蜡的比值为1:4~1:12(w/v)。本申请文件中质量体积比w/v单位均为g/ml,不再赘述。本发明实施例的PCR反应试剂的保存方法，PCR反应试剂中含有酶和其它必要成份，该方法为利用上述混合石蜡将PCR反应试剂中的酶与其他成份隔离。本发明实施例的PCR反应试剂盒，包括反应容器及置于反应容器中的反应液，所述反应液包括酶和其它必要成份，该PCR反应试剂盒中还包括用于将反应液中酶和其它成份隔离的混合石蜡，所述混合石蜡为上述的混合石蜡。与现有技术相比，上述技术方案采用熔点高于50。C的固体石蜡熔化后和液体石蜡按一定比例混合配制成一种混合石蜡，经过测试(参见具体实施例)，该混合石蜡熔点在2738。C之间，用于将PCR反应液中酶和其它成份隔离，熔点适中，在-2(TC的条件下PCR反应试剂可保存半年。若PCR反应体系中还含有UNG酶，当需要熔化石蜡，使酶和其它成份混合时，无须加热到50。C或以上，不会影响UNG酶在PCR反应液中发挥防污染作用，从而不会因此而对实验结果产生影响。此外，本发明实施例的混合石蜡制造方法简单，成本低。图1是本发明实施例提供的PCR反应试剂中加入石蜡后对基因1扩增的Ct值影响图2是本发明实施例提供的PCR反应试剂中加入石蜡后对基因2扩增的Ct值影响图3是是本发明实施例6混合石蜡的质谱图。具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供一种与现有技术相比，用于将PCR反应中的酵与其他成分隔离，能使PCR反应液在低温条件下长时间保存的混合石蜡。另外，采用固体石蜡隔离PCR反应液中酶和其它成份，在PCR反应液中加入有UNG酶时，该固体石蜡如能满足以下要求最为理想(1)为利于UNG酶(最适温度为50°C)与PCR反应液完全混合，该石蜡在5(TC前应完全融化，进一步考虑到仪器温控性能，该石蜡熔点适宜在40。C以下；(2)在室温条件下，石蜡应为固体状悉，才能将酶与PCR反应液隔离。因现有的液体石蜡(熔点一般为15°C)和固体石蜡(熔点一般为50~70°C)均不满足上述要求。为此，本发明实施例提供一种与现有技术相比，制造方法简单，熔点适中，适合用于隔离用于隔离PCR反应液中酶和其它成份，不影响荧光定量PCR反应效果的混合石蜡。具体而言，本发明实施例的混合石蜡，由液体石蜡和熔化后的固体石蜡均匀混合而成，其中，固体石蜡选自熔点高于50。C的固体石蜡，固体石蜡和液体石蜡的比值为1:4~1:12(w/v),得到的混合石蜡的熔点为27~38°C。固体石蜡和液体石蜡的优选比值为1:7~1:9(w/v),此时得到的混合石蜡的熔点为3036°C。本发明实施例中固体石蜡(Paraffinwax)并无特别限制，为本领域常用固体石蜡，只要是熔点高于50。C即可。固体石蜡熔点一般为50~70°C,在本实施例中，采用的固体石蜡为切片石蜡。本发明实施例中液体石蜡(LiquidParaffin)并无特别限制，为本领域常用液体石错，液体石蜡又名白油、石蜡油、白色油、矿物油，常温下为液体，主要成分为C16C20正构烷烃的混合物，通式为CnH2n+2。本发明实施例还提供一种PCR反应试剂的保存方法，该PCR反应试剂中含有酶和其它必要成份，该方法为利用上述混合石蜡将PCR反应试剂中的酶与其他成份隔离。采用本发明实施例的保存方法，在-2(TC的条件下PCR反应试剂可保存半年，而现有的酶与PCR反应液混合的保存方法一般在相同条件下只能保存12周。更进一步，上述反应试剂包括第一反应液和第二反应液，第一反应液包括緩沖液、dNTPs、催化剂、引物、探针、灭菌水，第二反应液即上述酶，该酶包括Taq酶和UNG酶，在反应容器中加入第一反应液后，将上述混合石蜡灭菌且熔化后加入反应容器，待混合石蜡凝固将反应液覆盖后，加入第二反应液并将反应容器口密封。本发明实施例混合石蜡熔点在27。C38。C的范围，当需要熔化石蜡，使第一反应液与第二反应液混合时，无须加热到50。C或以上，不会影响UNG酶在PCR反应液中发挥防污染的作用，从而不会因此而对实验结果产生影响。上述混合石蜡的灭菌方法为本领域常用方法，在本实施例中，混合石蜡经121。C灭菌15分钟。本发明实施例还提供一种PCR反应试剂盒，包括反应容器及置于反应容器中的反应液，上述反应液包括酶和其他必要成份，该PCR反应试剂盒中还包括用于将反应液中酶和其它成份隔离的混合石蜡，该混合石蜡为上述的混合石蜡。上述反应液包括第一反应液和第二反应液，所述第一反应液包括缓冲液、dNTPs、催化剂、引物、探针、灭菌水，所述第二反应液为所述酶，所述酶包括Taq酶和UNG酶。上述第一反应液包括5~50mM的Tris-Cl和40~100mM的KC1,0.10.5mM的dNTPs，1.0~5.0mM的MgCl2，0.(H~0.5|iM的引物，0.0卜0.5[iM的4笨4十，以及余量灭菌水；第二反应液中含有0.5~10unitTaq酶和0.008-0.1unitUNG酶。上述第一反应液优选包括10mM的Tris-Cl和50mM的KC10.25mM的dNTPs，3.5mM的MgCl2，O.ljxM的引物，0.22pM或0.4pM的探针，以及余量灭菌水。实施例1将固体石蜡(上海标本模型厂)和液体石蜡(天津福晨化学试剂公司)按l:4(W/V)的比例加热熔化，混合均匀，配制成混合石蜡。按照"中国药典(第二版)"中石蜡测定的方法进行实验，用两端开口的毛细管吸取，高约10mm，在4。C冰箱中放置24小时，混合石蜡凝固后用橡皮圏将毛细管紧缚在温度计上，使毛细管的内容物附在温度计汞球中部。将毛细管连同温度计浸入传温液中，混合石蜡的上端应处于传温液液面下约10mm处；小心加热，当温度上升至熔点低限低约5"C时，调节升温速率使每分钟上升不超过0.5。C，至混合石蜡在毛细管中开始上升时，检读温度计显示的温度，即为混合石蜡熔点，结果见表l。实施例210与实施例1基本相同，区别在于实施例2~10中固体石蜡和液体石蜡比例依次为1:5、1:6、1:7、1:8、1:8.5、1:9、1:10、1:11、1:12(W/V)。混合石蜡熔点，结果见表l。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、6000转离心30秒，加阳性模板5W/组;<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>探针0.05Taq酶0.4UNG酶0.1模板8灭菌双蒸水32.33、PCR扩增条件:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>4、结果石蜡对PCR反应中Ct值的影响见表3，扩增图谱见图1、图2。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3中基因1引物探针序列为invAF:5，-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3'invAR:5，-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3'invAProbe:ROX5'-CCGCCATTGTATTGGTTGTTACGGCGG陽3，Dabcyl表3中基因2引物探针序列为IpaH-F5'陽TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3'IpaH-R5'-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3'IpaHProbe5'-FAM-C4CGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGrG-DABCYL—3'由图1、图2及表2、3可以看出，该配方的石蜡对基因1、基因2扩增的各Ct值间经ttest检验与未加石蜡组没有显著性差异。基因1、基因2的Ct值分别延后0.10和0.03，即各延后0.5%和0.15%。质i普试验取上述实施例6所得混合石蜡进行质谱试验，得到其质谱图，参见图3。由该图3可观察到，本实施例的混合石蜡由两组物质构成，第一组物质是由20~32个碳的直链烷烃或支链烷烃、环烷烃产生10-20个特征峰的混合物；第二组物质是由16-20个碳的直链、支链烷烃或环烷烃构成的成分复杂的、不能产生特征峰(每种物质的含量均不高，故不能产生特征峰)的混合物。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。权利要求1、一种混合石蜡，由液体石蜡和熔化后的固体石蜡均匀混合而成，其中，所述固体石蜡选自熔点高于50℃的固体石蜡，固体石蜡和液体石蜡的比值为1∶4～1∶12(w/v)。2、如权利要求1所述的混合石蜡，其特征在于，所述固体石蜡和液体石蜡的比值为1:7~1:9(w/v)。3、如权利要求1所述的混合石蜡，其特征在于，所述固体石蜡为切片石蜡。4、一种PCR反应试剂的保存方法，PCR反应试剂中含有酶和其他必要成份，其特征在于，该方法为利用如权利要求13任一项所述混合石蜡将PCR反应试剂中的酶与其他成份隔离。5、如权利要求4所述反应试剂的保存方法，其特征在于，所述反应试剂包括第一反应液和第二反应液，所述第一反应液包括緩冲液、dNTPs、催化剂、引物、探针、灭菌水，第二反应液为所述酶，所述酶为Taq酶，在反应容器中加入第一反应液后，将如权利要求l-3任一项所述混合石蜡灭菌且熔化后加入.反应容器，待混合石蜡凝固将反应液覆盖后，加入第二反应液并将反应容器口密封。6、如权利要求5所述PCR反应试剂盒的保存方法，所述第二反应液中酶还包括UNG酶。7、一种PCR反应试剂盒，包括反应容器及置于反应容器中的反应液，所述反应液包括酶和其他必要成份，其特征在于，所述PCR反应试剂盒中还包括用于将反应液中酶和其它成份隔离的混合石蜡，所述混合石蜡如权利要求1~3任一项所述的混合石蜡。8、如权利要求7所述PCR反应试剂盒，其特征在于，所述反应液包括第一反应液和第二反应液，所述第一反应液包括緩沖液、dNTPs、催化剂、引物、探针、灭菌水，所述第二反应液为所述酶，所述酶包括Taq酶和UNG酶。9、如权利要求8所述PCR反应试剂盒，其特征在于，所述第一反应液包括8~15mM的Tris-Cl和45~55mM的KC1，0.20.4mM的dNTPs;2.5~4.0mM的MgCl2，0.10.3i!M的引物，0.20.5nM的探针，以及余量灭菌水；所述第二反应液为卜5unitTaq酶和0.008-0.1unitUNG酶。10、如权利要求9所述PCR反应试剂盒，其特征在于，所述第一反应液包括10mM的Tris-Cl和50mM的KCl,0.25mM的dNTPs,3.5mM的MgCl2,O.lpM的引物，0.22pM或0.4^iM的探针，以及余量灭菌水。全文摘要本发明提供了一种混合石蜡，采用该混合石蜡对PCR反应试剂进行保存的方法以及含有该混合石蜡的PCR反应试剂盒，该混合石蜡由液体石蜡和熔化后的固体石蜡均匀混合而成，其中，固体石蜡选自熔点高于50℃的固体石蜡，固体石蜡和液体石蜡的比值为1∶4～1∶12(w/v)。本发明的混合石蜡熔点在27～38℃之间，用于隔离PCR反应液中酶和其它成份，熔点适中，不影响荧光定量PCR反应的效果。而且，本发明实施例的混合石蜡制造方法简单，成本低。文档编号C12P19/00GK101665816SQ20091019011公开日2010年3月10日申请日期2009年9月8日优先权日2009年9月8日发明者严琼英,吴炳义,鹏张,论彭,汪再兴申请人:深圳市生科源技术有限公司