一种棉花nac转录因子基因及其应用的制作方法

专利名称：一种棉花nac转录因子基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种棉花NAC转录因子基因以及其构建 的植物表达载体及其在耐旱转基因植物研制方面的应用。
背景技术：
转录因子又称反式作用因子，是一群能与真核基因启动子区域中的顺式作用元件 发生特异性结合，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达的蛋白质分 子。当植物感受外界干旱、高盐、激素、病害时，通过一系列信号传递，激发转录因子，转录因 子与相应的顺式作用元件结合后，激活RNA聚合酶II转录复合物，从而启动特定基因的转 录表达，最后通过基因产物的作用对内、外界信号做出的调节反应。植物许多基因的表达都 是由特定的转录因子与特定的顺式作用元件相互作用调控的。转录因子在植物防卫反应和逆境胁迫应答过程中扮演着非常重要的角色。近几年 来在植物转录因子的基因克隆和功能研究方面取得了很大进展，同时也鉴定出多种与转录 因子相结合的顺式作用元件，例如G盒、W盒、CRT/DRE、MYC-like。转录因子通过与其调控 的下游基因启动子区的顺式作用元件结合而直接调控靶基因的表达，或形成同源、异源二 聚体，或与其他蛋白互作成为某种活化形式而参与JA、SA、ABA等信号传导途径，形成基因 表达的调控网络。根据对MYB类、bZIP类、WRKY类、AP2/EREBP类和NAC类植物转录因子家 族成员的研究，结果表明它们调控了相关生理反应基因表达的蛋白在植物防卫反应和逆境 信号转导中发挥作用，从而使植物适应外界不良环境。其中，WRKY类和AP2/EREBP类转录 因子是植物所特有的转录因子，不过在调控下游基因表达时与其他转录因子是有共性的， 都是通过与顺式作用元件结合来诱导抗逆反应应答。转录因子在提高作物对环境胁迫抗性的分子育种中，与导入或改良个别功能基因 来提高某种抗性的方法相比，导入或改良一个转录因子是提高作物抗逆性更为有效的方法 和途径。操纵一个转录因子就可通过它促使多个功能基因发挥作用，从而达到使植株性状 获得综合改良的效果。NAC转录因子是近十年来新发现的植物特有的转录调控因子。1997年Aida等首先 报道了 NAC结构域，发现在矮牵牛NAM基因、拟南芥ATAF1/2和CUC2基因编码蛋白的N端 包含一段保守的氨基酸序列，取三基因首字母命名为NAC。第一个NAC转录因子是由Souer 等于1996年从矮牵牛中克隆得到的，随后在拟南芥、水稻、小麦、大豆等物种中相继发现， 目前在拟南芥中共发现了 105个NAC成员，而水稻中则发现了 75个。研究表明，NAC转录 因子在植物的生长发育、器官建成、激素调节和防御抵抗多种生物和非生物胁迫等方面发 挥着重要作用。NAC转录因子受多种生物胁迫和非生物胁迫的诱导表达，参与植物的胁迫应答。华 中农业大学熊立仲教授研究小组克隆了一个水稻抗旱耐盐基因SNAC1，该基因是NAC类型 的转录因子，其主要在气孔的保卫细胞中被诱导表达，干旱胁迫时促进气孔关闭，但是并不 影响光合速率，因而抗旱性大为提高，在生殖生长期严重干旱的情况下，超量表达SNACl的转基因植株坐果率较对照提高22% 34%，在营养生长期，转基因植株也表现出很强的抗 旱性。中国农业大学王学臣教授研究小组在拟南芥中克隆了一个干旱诱导基因ATAF1，该基 因也是NAC类型的转录因子。ATAFl的表达受干旱和ABA处理的诱导，在浇水情况下又受到 抑制。敲除ATAFl基因的突变体atafl，在干旱胁迫后的浇水反应测试中恢复率是正常对照 的7倍，而且6个已知干旱诱导基因(RD17、ERD10、KIN1、RD22、C0R78和LT178)表达水平 提高，说明ATAFl基因作为负调控子，通过调节渗透胁迫反应基因的表达在抗旱反应中起 作用。有的NAC转录因子可与MYC-Iike元件结合，该元件的核心序列(CATGTG)在拟南芥 ERDl干旱诱导反应应答过程中起重要作用。Tran等采用酵母单杂交技术从拟南芥中分离 到3个不同的NAC基因(ANAC019、ANAC055和ANAC072)，它们的表达受干旱、高盐和ABA的 诱导，超量表达能显著增强转基因植株的耐旱能力。而ANAC072(RD26)参与ABA介导的逆 境信号传导途径，超量表达R拟6能显著增强转基因植株对ABA的敏感性，同时发现ABA和 逆境因子诱导的基因在转基因植株中也被上调表达，抑制表达R拟6则相反。Delessert等发现拟南芥转录因子ATAF2在叶片损伤部位高度诱导表达，并对 涉及损伤的植物激素甲基茉莉酮酸和水杨酸诱导反应作出响应，但对脱落酸没有反应；超 量表达ATAF2抑制了一些病原相关蛋白的表达，植株对土生镰刀霉菌的抵抗力下降，说明 ATAF2作为病原相关蛋白的负调控子在防御反应中起作用。Hegedus等构建了油菜叶片受 机械损伤、甲虫噬啮和冷害处理的混合cDNA文库，并从该文库中筛选出8个NAC类转录因 子，其中5个转录因子与拟南芥的ATAFl或ATAF2相似，将它们异位表达于模式植物拟南 芥，造成发育异常，类似于拟南芥nam和cuc突变体；过量表达&iNAC14的株系表现出叶片 增大，茎干变粗和侧根繁茂等特征，这与拟南芥的NACl基因功能相似。Oh等从辣椒中分离 到一种NAC类转录因子CaNACl，该转录因子受病原菌、外源水杨酸和乙烯的诱导。由此可 见，NAC转录因子在植物的多种抗逆信号途径之中起重要作用。

发明内容
本发明的目的在于提供一种棉花NAC转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。本发明的第二个目的在于提供棉花NAC转录因子基因的cDNA序列，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO 2 所示。本发明的第三个目的在于提供一种棉花NAC转录因子，由SEQ ID NO 1所示核苷 酸序列编码，其氨基酸序列如SEQ IDNO 3所示。本发明的第四个目的在于提供含有所述棉花NAC转录因子基因的植物表达载体。本发明的第五个目的在于提供用所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植 株。本发明的第六个目的在于所述棉花NAC转录因子基因在耐旱植物品种中的应用。本发明的技术路线为1)干旱处理棉花幼苗；2)从经干旱处理的的棉花幼苗上取叶片，并从叶片提取总RNA ；3)用总RNA进行逆转录反应，得到cDNA ；4)依据Genebank上发布的已知NAC基因序列保守区设计简并引物，以棉花逆转录cDNA作为模板进行PCR扩增，获得棉花NAC转录因子基因的EST ；5)以EST为探针，未诱导棉花总RNA为对照，对所获EST进行干旱胁迫下的 Northern表达分析，筛选干旱诱导增强表达的EST ；6)根据EST，用RACE方法获得NAC转录因子基因，命名为ghNACl ；7)构建ghNACl双元表达载体，用根癌农杆菌转化棉花，获得转ghNACl基因棉花， 采用干旱模拟实验验证转ghNACl基因棉花，因ghNACl的过表达而具有耐旱能力。本发明克隆了一种棉花NAC转录因子基因ghNACl，构建ghNACl双元表达载体，用 根癌农杆菌转化棉花，获得转ghNACl基因棉花，采用干旱模拟实验验证转ghNACl基因棉 花，因ghNACl的过表达而具有耐旱能力。


图IA和IB是干旱诱导条件下ghNACl基因表达的Northern检测图；图2是ghNACl基因的PCR扩增示意图；图3是植物表达载体pBI121-ghNAC_l构建示意图；图4是转ghNACl基因棉花ghNACl基因PCR检测电泳图；图5A、5B和5C是未转基因棉花干旱模拟实验图；图6A、6B和6C是转空载体棉花干旱模拟实验图；图7A、7B和7C是转ghNACl基因棉花干旱模拟实验图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。实施例1棉花干旱诱导增强表达ghNACl基因的克隆1、棉花材料的处理鄂杂棉11号Fl代种子萌发15天后，进行干旱处理4小时后，冻存于_70°C冰箱保存。2、棉花总RNA的提取A.取0. Ig棉花叶片液氮研磨后，加0. 5ml植物RNA提取液(购自invitrogen)， 振荡至彻底混勻。B.室温放置5分钟。C. 4"C 12，OOOrpm离心1分钟，上清转入新的无RNase离心管。D.加入 0. Iml 5M NaCl，温和混勻。E.加入0. 3ml氯仿，上下颠倒混勻。F. 4"C 12，OOOrpm离心10分钟，取上层水相转入新的无RNase离心管。G.加与所得水相等体积的异丙醇，混勻，室温放置10分钟。H. 40C 12，OOOrpm离心10分钟。弃掉上清，注意不要倒出沉淀。加Iml 75%乙醇。I. 40C 5，OOOrpm离心3分钟。倒出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸 出，室温晾干2-3分钟。J.加50 μ 1无RNase水，反复吹打、混勻，充分溶解RNA。3、RNA样品中DNA污染的去除
A.在 RNase-free 的 Eppendorf 管中依次加入 16 μ 1 总 RNA、2 μ 110XBuffer> 1 μ IRnaseOUTU μ 1 RNase-free DNaseI (2U/μ 1)；B.室温放置 15min ；C.力卩入 2 μ 125mM EDTA，65°C保温 15min。4、逆转录Α.在0. 2mltube中，加入下列成分
总 RNA (0. 1 μ g/ μ 1) 2. 0 μ 1Oligo (dT12-18) (2 μ Μ) 2. 0 μ 1B. 70°C水浴10分钟。立即放置在冰浴中；C.加入下列成分2. 0μ IlOXRTbuffer ；2. O μ 1 250 μ M dNTP mix ；2. O μ IlOOmM DTT ；9· 8 μ 1 DEPC Η20 ；0. 2μ 1 200υμ /1 SuperScriptIII ；D.进行下列反应42°C 90分钟；70°C 15分钟；_20°C保存。5、简并引物的设计和棉花ghNAClEST的获得依据Genebank上发布的已知NAC基因序列保守区设计简并引物NF80 :5’ -AYCCSACIGAYGAIGAGCT-3’NR510 :5’ -TTGTAIAKYCGRCAYARMACCCA-3‘以棉花逆转录cDNA作为模板进行PCR扩增，PCR条件94°C 5min ； 94 °C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s，35 个循环；72°C 5min。PCR得到的片段克隆至pGEM T-easy载体上，测序获得NAC基因的表达序列标签 (EST)，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示。6、棉花 ghNACl 片段的 3，RACE3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 试剂盒购 invitrogen 公司，实验步骤按试剂盒说明书操作。引物设计如下GSPl :5’ -GAAAGTTGCGGGGCATCATT-3‘GSP2 :5， -TATCACAACAGAAGGCCGTAAA-3，将PCR片段克隆至pGEMT-easy上并测序，核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示。7、干旱诱导条件下ghNACl基因表达的Northern检测将鄂杂棉IlFl代棉花苗提前一天进行水饱和，第二天早上，进行干旱诱导1小时， 2小时，4小时，6小时，8小时后，并取未诱导的作对照，分别取叶片冻存-700C，提取RNA，进 行Northern检测，结果参见图IA和1B，图中1、2、3、4、5分别为干旱诱导2、4、6、8、10个小 时。可见随干旱诱导时间的增加，此NAC家族基因表达水平也逐渐增强。8、棉花 ghNACl 片段的 5，RACE5' RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends 试剂盒购 invitrogen 公司，实验步骤按试剂盒说明书操作。引物设计如下GSPl GTTGTGAAGAACACGTTGATGATG
6
GSP2 GCTCTCTGCTTGAAACACTTGACGSP3 CAGTCCTAGAGACAGAAAATATCCG将PCR片段克隆至pGEMT-easy上测序并和3’ RACE结果进行序列拼接，获得序列 如 SEQ ID NO 6 所示。9、棉花ghNACl片段的基因全长的获得和克隆 根据拼接序列重新设计引物，并以cDNA和基因组DNA作为模板，扩增得到cDNA和 基因组DNA全长并克隆测序。并将获得的基因命名为ghNACl。扩增引物序列如下ghNAC5， 5， -GAAGATCTGGGTGAATCATGGGAGTGCC-3，ghNAC3， 5， -CGGCTAGCCTGAAATTCCTTTCCTGGTCC-3，PCR 条件94 "C IOmin,94 "C 45s,56 "C 45s,72 "C lmin，5 个循环；94 "C 45s、 60°C 45s,72°C lmin，25 个循环；72°C 7min。电泳结果参见图 2。ghNACl 基因 cDNA 序列如 SEQ ID NO 2 所示。ghNACl 基因 gDNA 序列如 SEQ ID NO :1 所示，其中 192bp_289bp 和 558bp_638bp 为 内含子部分。ghNACl编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。实施例2ghNAC 1双元表达载体的构建请参阅图3，将PCR扩增得到的ghNAC 1基因cDNA (ghNAC-1)用T4连接酶连接 至 pGEM-TEasy 上得到质粒 pGEM_ghNAC_l，用 BamHl 和 SacI 同时双酶切 pGEM-ghNAC-1 和 PBI121，分别获得ghNAC-Ι片段和线性pBI121载体，用T4DNA连接酶将ghNAC_l片段和线 性pBI121载体连接，得到ghNACl双元表达载体pBI121-ghNAC_l。实施例3利用农杆菌介导的转化法获得转ghNACl基因棉花1、根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备1)挑取新鲜的LBA4404单菌落接种于含适量抗生素的LB液体培养基中，28°C培养 至对数生长期；2) 4"C，8000rpm离心5分钟，收集菌体于小离心管中；3)用600 μ 1冰预冷的500mM CaCl2重悬洗涤细胞；4) 40C，8000rpm离心5分钟，细胞沉淀中加入100 μ 1冰预冷的500mM CaCl2,混勻 后备用04-48小时后使用效果最佳)。2、根癌农杆菌LBA4404的转化1)加入1 μ 1植物表达载体质粒DNA至农杆菌感受态细胞中，轻轻混勻，于液氮中 速冻5分钟，37°C温浴5分钟；2)加入600 μ 1 LB液体培养基，轻摇4-6小时，室温，6000rpm离心3分钟，富
集菌体；3)保留50-200 μ 1菌液，混勻，均勻涂布于含适量抗生素的LB选择平板上，28°C倒 置培养两天。4)挑取新鲜菌落，进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。3、棉花的遗传转化及植株再生采用农杆菌介导法转化冀棉14，获得转ghNACl基因棉花。
1)接种农杆菌单菌落于含有适量抗生素的液体LB培养基中摇床暗培养至 生长对数期。以菌液培养基1 50 1 100的比例用LB液体培养基稀释菌液，28°C 摇床暗培养至0D600值0. 8 1. 0 ；2)取暗培养3 4天的冀棉14无菌苗下胚轴，用解剖刀切成0. 6 0. 8cm的切 段，用培养好的菌液浸泡10 15min，其间轻摇几次；3)用无菌滤纸吸去多余菌液，于MS培养基上22 25°C共培养2天；4)把材料转入棉花诱愈筛选培养基(MSB附加KTO. 1、2，4_D0. l、Kml00、Cef500，单 位为mg/L)上，于25 30°C培养2 3个月，每20 30天继代一次；5)待愈伤长至直径约2cm时，转入胚性愈伤诱导培养基(KN03加倍、NH4N03减半 的MSB附加KmlOO、Cef 500，单位为mg/L)上，于25 30°C培养，直至长出大量胚性愈伤；6)将诱导出的胚性愈伤转入液体培养基(KN03加倍、NH4N03减半的MSB附加Km 100mg/L)中，培养15 25天，至细小体胚出现；7)悬浮培养物依次过30目、10目筛，留30目以下10目以上悬浮物，转接至体胚 萌发培养基(KN03加倍、NH4N03减半的MSB附加KTO. UKmlOO,单位为mg/L)上，培养至体 胚萌发成苗。8)待苗长至3 5片真叶，用劈接法嫁接至抗性强、生长旺的砧木上，确认成活后 移栽大田。4、转基因棉花植株的鉴定及检测试剂盒法提取棉花总DNA(1)取新鲜叶片0. lg。装入2ml离心管，液氮冷冻后研磨仪充分研磨；(2)加入 404 μ IPGl，65°C水浴后加入 100 μ 1PG2，冰浴 5min ；(3) 12000rpm离心4min，取上清，加入上清1. 5倍体积的PG2，上柱；G) 12000rpm离心lmin，弃废液，加入500μ 1PG4(PG4与无水乙醇按1 现配现用)；(5) 12000rpm离心lmin，弃废液，加入500 μ 1PG5 (PG5与无水乙醇按1 现配现用)；(6) 12000rpm离心3(^ec，弃废液，加入500μ 1PG5(PG5与无水乙醇按1 现配现用)；(7) 12000rpm 离心 3(^ec，弃废液；(8) 12000rpm离心anin，加入50 100μ 1 TE洗脱液(65 °C水浴预热)，静置 Imin ；(9) 12000rpm 离心 lmin，_20°C冰箱中保存备用。转基因棉花的PCR鉴定得到抗生素筛选阳性的转基因植株后，在生长初期，取转基因植株叶片，用试剂盒 法提取植株总DNA进行PCR鉴定，以合成的ghNACl基因特异性引物进行扩增；扩增引物序列如下ghNAC5， 5， -GGGTGAATCATGGGAGTGCC-3，ghNAC3， 5， -CCTGAAATTCCTTTCCTGGTCC-3，PCR 条件94 V IOmin ；94 V 45s, 56 °C 45s, 72 °C lmin, 5 个循环；94 °C 45s,
1.4配制， 4配制， 4配制，600C 45s, 720C lmin，25 个循环；72°C 7min。经PCR扩增，可以得到约1Kb的条带，说明ghNACl基因已整合至棉花基因组，电泳 结果如图4所示。5、过表达ghNACl转基因棉花的耐旱模拟实验及功能鉴定未转基因棉花干旱模拟实验结果参见图5A-5C，其中图5A为水饱和后第二天结 果，图5B为水饱和后干旱一周结果，图5C为水饱和后干旱两周结果。转空载体棉花干旱模拟实验结果参见图6A-6C，其中图6A为水饱和后第二天结 果，图6B为水饱和后干旱一周结果，图6C为水饱和后干旱两周结果。转ghNACl基因基因棉花干旱模拟实验结果参见图7A-7C，其中图7A为水饱和后第 二天结果，图7B为水饱和后干旱一周结果，图7C为水饱和后干旱两周结果。通过转ghNACl基因和对照组的干旱耐受实验证明，干旱胁迫两周后，转空载体和 未转基因棉花萎蔫程度明显高于转ghNACl基因组，并且转基因组棉花生长状况依然良好， 这说明我们克隆的棉花ghNACl基因作为植物逆境胁迫下的转录因子，通过调节渗透反应 基因的表达在干旱反应中起作用。SEQUENCE LISTING<110>创世纪转基因技术有限公司<120> —种棉花NAC转录因子基因及其应用<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1284<212>DNA<213> 棉花<400>1
0145]gggtgaatcatgggagtgccggaaactgatccattggctcaattgagcttgccgccgggg600146]tttcggttttatccaactgatgaagagcttttagtgcaatatttatgcaggaaagttgca1200147]gggcatcatttttctctgcaaatcattggcgaaatcgatttaatccatgg1800148]gatttaccgagtaagtttcaccgagtccaaagcaaagaattaactttgtttttctttttt2400149]tgttcatttctttactaata3. 3.3.3.3.3. taaattgttttttgacaggtaaagctttgt3000150]ttggtgaaaaagaatggtattttttcagtcctagagacagaaaatatccgaacgggtcac3600151]gacctaatagagttgccgggtccgggtactggaaagctaccggaactgat4200152]caacagaaggccgtaaagttggtataaaaaaagctctggttttttacgtcggaaaagctc4800153]ctaaaggaactggattatgcatgaatatcgactcattgaatcttctcgta5400154]aaagtggtagctccaaggtaatctattttt 3.3.3.3. 3.attattgaataataattgtt6000155]tgaactttga3. 3.3. 3.3. 3.Cttttttttttgttgtagttggatgattgggttttatgtc6600156]gaatatacaagaagaattcaagtggtcaaaaaccattgtcaagtgtttcaagcagagagc7200157]aaagcacgaatgggtcatcatcatcgtgttcttcacaactggataacatgcttgactcat7800158]tgcccgagttggacgatcgtttctttgctttgccgcgcattaactcgttcaaaacgcttc8400159]aaaacgatgtgaaactggggtttcaaaatctgggtatagg gaatttggattgggggagtc900
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202530
CysArgLysValAlaGlyHisHisPheSerLeuGlnlielieGlyGlu
354045
IleAspLeuTyrLysPheAsnProTrpAspLeuProSerLysAlaLeu
505560
PheGlyGluLysGluTrpTyrPhePheSerProArgAspArgLysTyr
65707580
ProAsn Gly Ser Arg Pro Asn Arg Val Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys
859095
AlaThr GlyThrAspLyslielieThrThrGlu GlyArg LysValGly
100105110
IleLysLysAlaLeuValPheTyrValGlyLys AlaProLysGlyThr
115120125
LysThrAsnTrplieMetHisGluTyrArgLeulieGluSerSerArg
13013514D
LysSerGlySerSerLysLeuAspAspTrpValLeuCysArglieTyr
145150155160
LysLysAsnSerSerGlyGlnLysProLeuSerSerValSerSerArg
165170175
GluGlnSerThrAsnGlySerSerSerSerCysSerSerGlnLeuAsp
180185190
AsnMetLeuAspSerLeuProGluLeuAspAspArgPhePheAlaLeu
195200205
ProArglieAsnSerPheLysThrLeuGlnAsnAspValLysLeuGly
210215220
PheGlnAsnLeuGlylieGlyAsnLeuAspTrpGlySerLeuGlyGly
225230235240
LeuSerSerValProGluLeuValProSerGlyGlnThrGlnThrGln
245250255
ThrGlnThrGlnSerGlnGlylieThrSerTyrGlyAsnSerAsnVal
260265270
TyrValSerThrMetProProThrLeu CysGlnMetAspValSerThr
275280285
AsnLyslie GlyAsn Ser Val Glu Glu Glu Val Gln Ser Gly Leu Arg
290295300
ThrGlnArg AlaAsp AsnSerGlylieValGlnGlnAsnSerAsnVal
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LeuAsnSerHisAsnPheSerAsnSerlieAspProTyrGlyPheArg
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<212>DNA
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1权利要求
1.一种棉花NAC转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.根据权利要求1所述的一种棉花NAC转录因子基因，其特征在于所述棉花转录因 子基因的cDNA序列如SEQ ID NO 2所示。
3.权利要求2所述的棉花NAC转录因子基因编码的蛋白质，具有SEQID N0:3所示的氨基酸序列。
4.含有权利要求1或2所述棉花NAC转录因子基因的植物表达载体。
5.用权利要求4所述植物表达载体转化的植物细胞、组织或植株。
6.权利要求1或2所述棉花NAC转录因子基因在耐旱植物品种中的应用。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种棉花NAC转录因子基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，构建ghNAC1双元表达载体，用根癌农杆菌转化棉花，获得转ghNAC1基因棉花，采用干旱模拟实验验证转ghNAC1基因棉花，因ghNAC1的过表达而具有耐旱能力。
文档编号C12N15/11GK102080078SQ20091018955
公开日2011年6月1日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者孙超, 崔洪志, 王君丹, 陈文华 申请人:创世纪转基因技术有限公司