专利名称：人类白细胞抗原HLA-Cw基因测序分型的方法
人类白细胞抗原HLA-Cw基因测序分型的方法
技术领域：
本发明涉及生物医学，特别是涉及一种临床移植组织配型的人类白细胞抗原 HLA-Cw基因测序分型的方法。
背景技术：
人类白细胞抗原HLA-Cw基因编码的蛋白为经典的HLA I类分子，不仅递呈内源性 抗原肽给CD8+T细胞识别，介导杀伤性T细胞的免疫应答，而且作为杀伤细胞免疫球蛋白样 受体(Killer Immunoglobulin-likeReceptor, KIR)的配体，调节自然杀伤细胞(Natural Killer cells)的杀伤功能，在移植免疫、肿瘤免疫和抗感染免疫中发挥重要作用。HLA-Cw 分子是由一条具有多态性的α多肽链(45kDa)和一条由位于15号染色体基因编码、没有 多态性的微球蛋白(12kDa)通过非共价键组成的异二聚体。随着HLA-Cw分子的生物学功能、HLA-Cw基因与疾病关联以及HLA-Cw基因与移植 相关性等研究的开展和深入，人们对HLA-Cw基因的传统错误认识被逐渐打破，HLA-Cw分子 倍受研究者关注和重视。编码HLA-Cw分子α链的基因共含有8个外显子，7个内含子。8个外显子分别编 码不同的肽结构域，各外显子及内含子序列长短不一，如表1所示表IHLA-Cw基因各外显子及内含子长度 如表1，第1外显子编码一个短的信号肽(序列长度73bp)，指导α链插入内质网 膜，并在蛋白质翻译后、表达于细胞膜上之前被切除。第2、3、4外显子分别编码α ρ α 2、α 3 结构域，第5外显子编码连接肽、跨膜区和胞浆区尾部的初始部分，第6、7、8外显子编码带 碱性锚定残基的胞浆尾部区。抗原肽结合区顶部有肽结合槽(peptide-binding cleft)，由 α链的^、^两个结构域构成，两端呈封闭状，一般结合8-11个氨基酸残基的肽段，此槽 即为抗原呈递部位。由于第2、第3外显子编码功能比较重要的抗原肽递呈结构域，因此，以 往的HLA-Cw基因的测序分型(Sequence-based typing, SBT)方法主要是对高度多态性的 第2、3外显子进行，但当前普遍还增加了第4外显子多态性的检测即对HLA-Cw基因第2、3、 4外显子进行测序分型，以减少HLA-Cw基因测序分型中出现的模棱两可结果。以聚合酶链反应(PCR)为基础的HLA测序分型(PCR-SBT)方法，被誉为国际HLA 基因分型的金标准。该方法首先对需要分型的外显子区域进行PCR扩增即首先扩增目的基 因片段，然后对纯化的PCR扩增产物进行测序反应、电泳检测和序列分析。目前国内各HLA 分型和临床组织配型工作中的HLA-Cw基因测序分型试剂普遍依赖于进口。但国际上不同 厂家的测序分型试剂盒，扩增HLA-Cw基因目的片段的分子大小和策略有所不同。由于商品 化试剂盒较为昂贵，限制了 HLA-Cw基因测序分型在群体遗传学和骨髓库中的大规模应用。 且现有的商品化试剂盒存在三个问题首先，存在HLA-Cw等位基因的漏检情况。如广泛使用的AlleleSEQRHLA-C plus 测序分型试剂盒，其PCR产物有两条带，一条带从第1外显子延伸至第3内含子，另一条带 从第3内含子至第7内含子，但具体的两对PCR引物序列及其位置尚未公开。申请人曾在 620份汉族健康随机个体中检出了 5例经AlleleSEQR HLA-C plus试剂盒检测结果“异常” 的样本，经分子克隆和单倍体测序，以及自行设计的PCR引物再测序，证实了这5例标本均 存在AlleleSEQR HLA-C测序分型试剂盒用于扩增第1外显子至第3内含子的PCR引物与 Cw*0706等位基因序列不匹配，导致中国人群中Cw*0706等位基因漏检和丢失(见中华医学 遗传学杂志，2009年第5期)。其次，大量新的点突变，被发现分布在第2、3、4外显子以外的第1、5、6、7外显子上 并获得等位基因命名。截至到2009年7月，HLA-Cw所有14个子系中(Cw*01，02，03，04，05， 06，07，08，12，14，15，16，17，18)共有463种等位基因。HLA-Cw基因测序分型时，因第2、3、4 外显子序列一致，将导致测序分型中出现模棱两可结果。在此情况下，可根据不同的等位基 因组合，采用组特异性引物对第2、3、4外显子检测区域进行再测序，或增加其它外显子(如 外显子1、5、6、7)的多态性检测，以解决模棱两可的结果。但HLA-Cw基因外显子1、5、6、7 的测序引物混合液(Reaction Mix)及组特异性引物等，均需购置，非HLA-Cw基因的商品化 常规测序分型试剂盒中所包括，因而增加了实验成本。再次，尽管HLA-Cw位点的等位基因数目增长讯速，但具有全长序列的HLA-Cw等位 基因数目却微乎甚微，特别是缺乏中国人群HLA-Cw等位基因的全长序列和SNPs数据。
截止至Ij2009 年 4 月，IMGT/HLA 数据库(http //www. ebi. ac. uk/imgt/hla/)中公 布的HLA-Cw等位基因有440个，其中有全长序列的HLA-Cw等位基因仅49种，大部分的等 位基因缺乏位于其它外显子以及非编码区的SNPs数据和信息，直接影响了高分辨分型的 结果。为此，本申请人建立了 HLA-Cw等位基因全长序列分子克隆及测序方法(中华医学遗 传学杂志.2009，26 :258-262)，测定并获得了中国人群中的35种常见的HLA-Cw等位基因 全长序列，已全部提交国际GenBank数据库和世界卫生组织(WHO)HLA因子命名委员会，均 获得了国际认可(见表2)；从而为基于中国人群HLA-Cw等位基因全长序列中的SNPs信息 设计开发适合中国群体的HLA高分辨分型试剂盒，提供了重要依据。表2中国人群中的35种HLA-Cw等位基因及其全长序列的编号
发明内容本发明旨在基于中国人群HLA-Cw基因遗传学基础和全长序列的单核苷酸多态性 (SNPs)资料，创建一种适合于中国人群的人类白细胞抗原HLA-Cw基因测序分型的方法，以 解决广泛使用的AlleleSEQR HLA-C plus商品化试剂盒对中国人群检测出现的Cw*0706等 位基因漏检现象，以及解决测序分型中出现的模棱两可的结果问题，可用于HLA-Cw基因的 临床移植组织配型、群体遗传学、人类学及进化学等应用和基础研究。为实现上述目的，本发明提供一种人类白细胞抗原HLA-Cw基因测序分型的方法， 该方法包括a、首先由两对PCR扩增引物对分型目的区域进行PCR扩增，其中，第一对PCR引物扩增第1外显子到第4外显子的序列，第二对PCR引物扩增第5外显子到第8外显子的序 列；b、通过十二条正向和反向测序引物对扩增产物进行测序反应，其中，分别对 HLA-Cw基因的第1、2、3、4、5外显子进行正、反向双向测序，对第6外显子进行正向测序和第 7外显子进行反向测序。步骤a中，第1至第4外显子的PCR扩增引物包括上游引物C_SBT_F1和下游引物 C-SBT-Rl，其中，上游引物 C-SBT-Fl 的序列为5' -CCA ATC AGCGTC TCC GCA GTC-3 ‘，下 游引物C-SBT-Rl的序列为5' -ACC CCY CAT YCCCCT CCT TAC-3‘；第5至第8外显子的 PCR扩增弓I物包括上游弓I物C-SBT-F2和下游弓|物C-SBT-R2，其中，上游弓|物C-SBT-F2的序 列为5' -TTM TCA GRGAM GCA GAA GTC-3 ‘，下游引物C-SBT-R2 的序列为5' -AAT CCT GCA TCTCAG TCC CAC-3‘。第1至第4外显子的PCR扩增弓I物的上游引物C-SBT-Fl位于HLA-Cw基因的5’ -启 动子区域，下游引物C-SBT-Rl位于HLA-Cw基因的第4内含子区域，扩增区域涵盖了第2、 3、4外显子，还包含了部分5’ -启动子区、第1外显子、第1内含子、第2内含子、第3内含 子以及部分第4内含子序列，并可同时扩增在引物结合区有单核苷酸多态性的多种等位基 因。第5至第8外显子的PCR扩增引物的上游引物C_SBT_F2位于HLA-Cw基因的第4 内含子区域，下游引物C-SBT-R2位于HLA-Cw基因的3’ -非翻译区，PCR扩增区域涵盖第5、 6、7、8外显子，并包括部分第4内含子、第5内含子、第6内含子、第7内含子及部分3’ UTR 区域的序列。步骤b中，所述测序引物包括第一外显子正向测序引物C1F，其序列为5’ -GTTCTRAAGTCCCCAGTC-3’，第一外显 子反向测序引物C1R，其序列为5，-GAAATACYTCATGGAGTG-3，；第二外显子正向测序引物C2F，其序列为5' -GGGTCTCAGCCMCTCCTC-3‘，第二外 显子反向测序引物C2R，其序列为5' -GCC GTC CGT GGG GGA TG-3'；第三外显子正向测序引物C3F，其序列为5' -GCCCCAGTCRCCTTTAC-3'，第三外 显子反向测序引物C3R，其序列为5' -TTCCTCCCCTCCTCGTG-3‘；第四外显子正向测序引物C4F，其序列为5 ‘ -TTCTCAGGATGGTCACATG-3 ‘，第四 外显子反向测序引物C4R，其序列为5' -CCYCATYCCCCTCCTTAC-3‘；第五外显子正向测序引物C5F，其序列为GTCAGGGCTGAGGCTTG，第五外显子反向 测序引物C5R，其序列为GATGGTGCTTCCAGTAAC ；第六外显子正向测序引物C6F，其序列为TCCAAGACTAGGAGGTTC，第七外显子反向 测序引物C7R，其序列为CAGGTCAGTCATGGTAAG。第1至第4外显子的PCR扩增引物的扩增片断长为1960bp。第5至第8外显子的PCR扩增引物扩增片段长度为1050bp。第1至第4外显子的PCR扩增反应体系组成为IOXPfu Buffer2. 5 +LdNTP (25mM)2.0 +L
PCR 引物(10 μ M)各1孔
基因组DNAIOOng
Pfu 酶(5U +L )0. 5 +L
甘油(50% )1.0 TL
加ddH20至25 +L ；
第5至第8外显子的PCR扩增反应体系组成为
2XGC Buffer12. 5 +L
dNTP(25mM)1.0 +L
PCR 引物(10 μ Μ)各ι不L
基因组DNAIOOng
LA Taq 酶(5U'+L )0. 5 +L
MgCl2 (25mM)1. 5 =FL
加ddH20至25 +L
两对PCR引物的PCR扩增通过PCR仪进行，其循环参数为
95 0C3min
95 0C30Sec
62 0C30Sec
72 0C2min,30个循环
72 0C15min
4 0CInfinite
测序反应的条件为
测序引物(Ι.ΟμΜ)3.2 +L
测序模板DNA2.0 +L
ABI PRISM BigDye Terminator 1. 11.0 +1
加ddH20至10 +L
本发明基于中国人群的人类白细胞抗原HLA-Cw基因全长序列，创建了
HLA-Cw基因测序分型的方法，其贡献在于，它有效解决了广泛使用的Al 1 eIeSEQR HLA-C plus商品化试剂盒对中国人群检测出现的Cw*0706等位基因漏检现象，以及解决测序分型 中出现的模棱两可的结果问题。本发明通过四条位点特异性PCR扩增引物和12条测序引 物，以及探索最佳退火温度和调节Mg2+离子和引物浓度等条件，可对HLA-Cw基因进行PCR 特异性扩增及测序分型。所获得的序列中无背景信号和杂峰，易于识别和结果判读。由于 引物设计时，充分考虑了引物结合区的HLA-Cw等位基因单核苷酸多态性(SNPs)，因而可有 效地解决进口试剂盒检测中国人群DNA样本时出现的HLA-Cw等位基因(如Cw*0706)漏检 和丢失现象。该方法除了可进行HLA-Cw基因第2、3、4外显子常规测序分型外，还可进行第 1、5、6、7外显子多态性检测，减少模棱两可的结果；该方法适合于中国人群HLA-Cw基因的 高分辨水平基因分型，以及HLA-Cw基因的临床移植组织配型、群体遗传学、人类学及进化学等应用和基础研究工作。
图1是实施例1的5例用进口试剂盒检测疑为Cw*0706漏检样本的第1至4外显 子扩增反应效果图。图2是实施例1的一例样本分别用Atria AlleleSEQR HLA-C plus试剂盒与本发 明的检测方法检测所得序列及结果的对比示意图，其中，图2A为第2外显子测序结果比较 示意图，图2B为第3外显子测序结果比较示意图，图2C为第4外显子测序结果比较示意图。图3是实施例2中样本两次扩增效果图，其中，图3A为第1至第4外显子扩增效 果图，图3B为第5至第8外显子扩增效果图。图4是一骨髓志愿捐献者样本的HLA-Cw基因第1 (A)，2 (B)，3 (C)，4 (D)，5 (E)，6及 7(F)外显子正反向引物测序结果示意图。IH 5 ^jjfWii^J-^A Assign 3. 5SBT (Conexio Genomics, WesternAustralia) ^ 件中可清晰判读出受检者的基因型示意图。
具体实施方式下列实施例是对本发明的进一步解释和说明，对本发明不构成任何限制。本发明基于中国人群HLA-Cw基因的分子遗传学基础，提供了一种HLA-Cw高分辨 分型检测的方法，通过设计HLA-Cw基因PCR引物和各外显子的测序引物、探索最佳退火温 度及调节Mg2+离子和引物浓度等条件，可以对HLA-Cw基因进行高分辨水平测序分型。本发明的DNA引物序列共8对16条，委托大连宝生物公司合成。扩增酶采用 Stratagene公司生产的Pfu高保真酶，保证序列的准确性。实施例1本实施例给出了通过本发明的人类白细胞抗原HLA-Cw基因测序分型的方法解决 AlleleSEQR HLA-C plus进口试剂盒对Cw*0706等位基因漏检问题的方案。AlleleSEQR HLA-C plus试剂盒，其PCR产物有两条带，一条带从第1外显子延伸 至第3内含子，另一条带从第3内含子至第7内含子。620例汉族健康随机个体的样本经 AlleleSEQR HLA-C plus试剂盒检测，我们发现了 5例样本无与之完全匹配的基因型，与最 接近的多种等位基因型均存在单个碱基的不匹配，并且在第4外显子出现碱基杂合，提示 为杂合子，但在多态性丰富的第2、第3外显子区域内无杂合碱基。首先，取本发明中的第一对PCR引物的上游引物C-SBT-Fl和下游引物C-SBT-R1， 扩增HLA-Cw基因的第1至第4外显子，对5例异常样本进行PCR扩增，扩增于ABI 9700型 PCR仪进行，扩增反应体系组成为IOXPfu Buffer2.5 +LdNTP (25mM)2. 0 +LPCR 引物(10 μ Μ)各 1 =FL基因组DNAIOOngPfu 酶(5U/ 不L )0. 5 +L
甘油(50% )1. 0 +L
加ddH20至25 +L
扩增循环参数为
95 0C3min
95 0C30Sec
62 0C30Sec
72 0C2min,30个循环
72 0C15min
4 0CInfinite
取5 +L PCR产物，经EB染色，于1 %琼脂糖凝胶中电泳；对照DL2000DNA分子标记，在凝胶成像系统中观察特异性PCR产物条带。PCR产物条带清晰、特异，见图1。
在剩余的PCR扩增产物中加入4 +L EXOSAP-IT酶处理，以去除多余的PCR引物和底物dNTPs。
然后，取本发明中的第2、3、4外显子的正向、反向测序引物C2F、C2R ； C3F、C3R ；C4F、C4R，进行双向测序，其测序反应体系组成如下
测序引物(Ι.ΟμΜ)3.2 +L,
测序模板DNA2.0 +L,
ABI PRISM BigDye Terminator 1. 1 1.0 +1,
加ddH20至10 TL
测序反应程序为
98 0C2min
96 0CIOSec
50 0C5Sec
60 0C4min,30个循环
4 0CInfinite
测序反应完成后，在ABI3730测序仪中电泳，导出序列分析的结果与Atria
AlleleSEQR HLA-C plus进口试剂盒得出的结果进行对比，发现=AtriaAlleleSEQR试剂盒 检测的这5例样本，无与之完全匹配的基因型，HLA-Cw基因第2、第3外显子的序列全部为 纯合碱基峰。而由本发明的第一对PCR引物扩增及测序后，则得到了完全匹配的基因型，未 检出新的等位基因；并且在第2、3外显子均分别出现了杂合碱基峰。结果对比表明这5个 均携带Cw*0706等位基因的样本，经AlleleSEQR HLA-C plus试剂盒检测均存在Cw*0706 等位基因漏检和丢失现象。如图2 所示，一样本(基因型Cw*0802，0706)经 AlleleSEQR HLA-Cpl us 试剂盒 检测，第2、3外显子均为纯合碱基，只有Cw*0802的序列。而本发明的方法的测序结果表 明，5例样本的第2、3、4外显子均出现杂合碱基，得到了完全匹配(full match)的基因型， 未发现新的碱基点突变。结果对比表明这5例标本经AlleleSEQR HLA-C plus试剂盒检 测均存在Cw*0706等位基因漏检和丢失现象。实施例2
本实施例给出对156例骨髓志愿捐献者样本进行HLA-Cw高分辨测序分型的实例。申请人:从深圳的骨髓志愿捐献者中选择了 156例样本，用本发明中的PCR引物 和测序引物进行测序分型，来验证本发明的实施效果。所选择的156例样本包含了目前 HLA-Cw所有子系。用本发明中的扩增及测序引物对上述样本进行测序分型实验，最后都得 到了 HLA-Cw基因型。首先通过两对PCR扩增引物对对样本进行PCR扩增反应，其中，第一对扩增引物包 含从第1外显子到第4外显子的序列，第二对扩增引物包含从第5外显子到第8外显子的 序列，两个扩增反应结果见图3。扩增反应条件每个样品设置两种扩增反应体系，其中第一对PCR引物的扩增反应体系组成如下
IOXPfu Buffer2. 5 平L
dNTP(25mM)2.0 TL
PCR弓丨物(10 μ Μ)各1 +L
基因组DNAIOOng
Pfu 酶(5U/ +L )0.5 +L
甘油(50% )1.0 +L
加ddH20至25 +L
第二对PCR引物的扩增反应体系组成如下
2XGC Buffer12. 5 +L
dNTP(25mM)1.0 +L
PCR弓丨物(10 μ Μ)各ι +L
基因组DNAIOOng
LA Taq 酶(5U/ +L )0. 5 +L
MgCl2 (25mM)1. 5 平 L
加ddH20至25 +L
设置好PCR反应体系后，在同一个ABI 9700型PCR仪中进行同步扩增，循环参数如下
95 0C3min
95 0C30Sec
62 0C30Sec
72 0C2min，30个循环
72 0C15min
4 0CInfinite
扩增反应结束后，,用12条测序引物，即第--外显子正、反向测序引物C1F、ClR ；第
二外显子正、反向测序引物C2F、C2R ；第三外显子正、反向测序引物C 3F、C3R ；第四外显子 正、反向测序引物C4F、C4R ；第五外显子正、反向测序引物C5F、C5R ；第六外显子正向测序引 物C6F ；第七外显子反向测序引物C7R对相应的PCR模板进行测序反应，可以看出HLA-Cw基因第1、2、3、4、5、6、7外显子正向和/或反向测序的碱基信号峰较高，序列中无背景信号和 杂峰。测序结果显示，在156份样本中，155份样本出现完全匹配(full match)的结 果，另一份样本的基因型与0*010201，010201最接近，但在第3外显子存在单个碱基不匹 配。进一步采用本发明的第一对PCR引物对扩增HLA-Cw基因外显子1 4，对PCR扩增产 物进行分子克隆和单倍体测序，证实该样本携带Cw*01相关的新等位基因，这个新等位基 因与最接近的Cw*010201的差异在于第3外显子基因组序列nt959T > C(codon 171TAC >CAC)错义突变(见图4)，导致一个氨基酸残基发生取代(Tyrl71His)。该序列已提交 GenBank (注册号GQ373181)和WHO HLA因子命名委员会(HWS10006611)，并被正式命名为 Cw*0130 ο当所有序列导入Assign 3. 5SBT(Conexio Genomics，WesternAustralia)软件中， 可清晰地判读出受检者的基因型，如图5所示。
权利要求
一种人类白细胞抗原HLA Cw基因测序分型的方法，其特征在于，该方法包括a、首先由两对PCR扩增引物对分型目的区域进行PCR扩增，其中，第一对PCR引物扩增第1外显子到第4外显子的序列，第二对PCR引物扩增第5外显子到第8外显子的序列；b、通过十二条正向和反向测序引物对扩增产物进行测序反应，其中，分别对HLA Cw基因的第1、2、3、4、5外显子进行正、反向双向测序，对第6外显子进行正向测序和第7外显子进行反向测序。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，第1至第4外显子的PCR扩 增引物包括上游引物C-SBT-Fl和下游引物C-SBT-Rl，其中，上游引物C-SBT-Fl的序列为 5' -CCA ATC AGC GTC TCC GCA GTC-3‘，下游引物C-SBT-R1 的序列为5' -ACC CCY CAT YCC CCT CCT TAC-3'；第5至第8外显子的PCR扩增引物包括上游引物C-SBT-F2和下游引 物 C-SBT-R2，其中，上游引物 C-SBT-F2 的序列为5' -TTM TCA GRG AM GCA GAA GTC-3 ‘， 下游引物 C-SBT-R2 的序列为5' -AAT CCT GCA TCT CAG TCC CAC-3‘。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第1至第4外显子的PCR扩增引物的 上游引物C-SBT-Fl位于HLA-Cw基因的5’ -启动子区域，下游引物C-SBT-Rl位于HLA-Cw 基因的第4内含子区域，扩增区域涵盖了第2、3、4外显子，还包含了部分5’ -启动子区、第 1外显子、第1内含子、第2内含子、第3内含子以及部分第4内含子序列，并可同时扩增在 引物结合区有单核苷酸多态性的多种等位基因。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第5至第8外显子的PCR扩增引物的上 游引物C-SBT-F2位于HLA-Cw基因的第4内含子区域，下游引物C-SBT-R2位于HLA-Cw基 因的3’-非翻译区，PCR扩增区域涵盖第5、6、7、8外显子，并包括部分第4内含子、第5内 含子、第6内含子、第7内含子及部分3’ UTR区域的序列。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，所述测序引物包括第一外显子正向测序引物C1F，其序列为5’ -GTTCTRAAGTCCCCAGTC-3’，第一外显子反 向测序引物 C1R，其序列为5，-GAAATACYTCATGGAGTG-3，；第二外显子正向测序引物C2F，其序列为5' -GGGTCTCAGCCMCTCCTC-3‘，第二外显子 反向测序引物C2R，其序列为5' -GCC GTC CGT GGG GGA TG-3'；第三外显子正向测序引物C3F，其序列为5' -GCCCCAGTCRCCTTTAC-3 ‘，第三外显子 反向测序引物C3R，其序列为5, -TTCCTCCCCTCCTCGTG-3‘；第四外显子正向测序引物C4F，其序列为5' -TTCTCAGGATGGTCACATG-3 ‘，第四外显 子反向测序引物C4R，其序列为5' -CCYCATYCCCCTCCTTAC-3‘；第五外显子正向测序引物C5F，其序列为GTCAGGGCTGAGGCTTG，第五外显子反向测序 引物 C5R，其序列为GATGGTGCTTCCAGTAAC ；第六外显子正向测序引物C6F，其序列为TCCAAGACTAGGAGGTTC，第七外显子反向测序 引物 C7R，其序列为CAGGTCAGTCATGGTAAG。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第1至第4外显子的PCR扩增引物的扩 增片断长为1960bp。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第5至第8外显子的PCR扩增引物扩增 片段长度为1050bp。
8.如权利要求3、4、6、7中任一条所述的方法，其特征在于，所述第1至第4外显子的PCR扩增反应体系组成为IOXPfu Buffer 2. 5 + LdNTP (25mM)2.0 +.LPCR 引物(10 μ Μ) 各 IL +基因组DNAIOOngPfu 酶(5U/ 不L)0. 5 + L甘油(50% )1.0 + L加 ddH20 至25 + L ；所述第5至第8外显子的PCR扩增反应体系组成为'2 X GC Buffer12. 5 + LdNTP (25mM)1. 0 + LPCR 引物(10 μ Μ)各 IT L基因组DNAIOOngLA Taq 酶(5U/ + L)0. 5 + LMgCl2 (25mM)1. 5 +L加 ddH20 至25 +L。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，两对PCR引物的PCR扩增通过PCR仪进行， 其循环参数为'95 0C 3min'95 °C30Sec'62 °C30Sec'72°C 2min，30 个循环'72 °C 15min'4 °CInfinite。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述测序反应的条件为 测序引物(1.0 μ M)3.2 + L测序模板DNA2. 0 +； LABI PRISM BigDye Terminator 1.1 1.0+1 加 ddH20 至10 + L。
全文摘要
一种人类白细胞抗原HLA-Cw基因测序分型的方法，它包括a、通过两对PCR扩增引物对分型目的区域进行PCR扩增，其中，第一对扩增引物包含从第1外显子到第4外显子的序列，第二对扩增引物包含从第5外显子到第8外显子的序列；b、通过十二条正向和反向测序引物对扩增产物进行测序反应，其中，分别对HLA-Cw基因的第1、2、3、4、5外显子进行正、反向双向测序，对第6外显子进行正向测序和第7外显子进行反向测序。本发明基于HLA-Cw基因全长序列和单核苷酸多态性数据而创建，解决了AlleleSEQR HLA-Cw plus试剂盒对人群检测出现的Cw*0706等位基因漏检以及测序分型中出现的模棱两可的结果问题。该方法适合于中国人群HLA-Cw基因的高分辨水平基因分型，有利于HLA-Cw基因的各种应用和基础研究工作。
文档编号C12Q1/68GK101928770SQ200910190478
公开日2010年12月29日 申请日期2009年9月18日 优先权日2009年9月18日
发明者徐筠娉, 王大明, 邓志辉 申请人:深圳市血液中心