专利名称：用于核酸pcr产物直接测序的测序引物和测序方法
技术领域：
本发明涉及核酸测序领域，尤其涉及一种用于核酸PCR产物直接测 序的测序引物和测序方法。
背景技术：
PCR产物测序大多采用传统克隆测序技术，包括l)PCR产物与质 粒载体连接；2)连接产物转化细菌；3)细菌培养；4)模板制备等繁 瑣步骤，操作麻烦且耗时长。
PCR产物也可以采用直接测序的方法进行测序，目前最常用的PCR 产物直接测序方法仍是Sanger双脱氧核苷酸介导的链终止法，与普通 的PCR反应相比，由于链终止法的测序反应依赖于由单向引物与模板特 异结合后引发的线性扩增，因而对测序模板和引物要求非常严格。该方 法中影响PCR产物直接测序成败的关键因素包括1)测序模板的质量； 2)测序引物的特异性和扩增效率。模板的质量可以通过PCR产物切胶 回收纯化、SAP—Exonl纯化、乙醇/醋酸钠纯化等多种方法加以控制， 从而得到高质量的特异性才莫板。然而，由于PCR产物的多样性，使得测 序引物的设计和选择一直是困扰PCR产物直接测序的一个问题。并非所 有的PCR扩增良好的引物都能用于测序反应，如简并引物、随机引物、 过长的引物(大于24bp)、自身易形成二级结构的引物、纯度不高的引 物等等，如果简单地将常规的PCR引物直接用于测序常常会导致测序结 果不理想或测序反应失败。另需要根据不同的PCR产物重新设计测序引 物，但会造成测序周期的延长和成本的增加。
发明内容
为解决上述问题，本发明的主要目的在于提供用于核酸PCR产物直接测序的测序引物，所述测序引物适用范围广。
本发明的另一个目的在于提供高效、稳定、快捷的用于核酸PCR产 物直接测序的测序方法。
为实现上述目的，本发明釆用如下技术方案
用于核酸PCR产物直接测序的测序引物，所述测序引物的碱基序列 如SEQ ID NO: 1和2所示。
用于核酸PCR产物直接测序的测序方法，包括以下步骤
1)根据待检测的目标核酸序列设计并合成一对扩增引物，所述扩
物5'端的测序引物序列，合成一对测序引物；
2) 采用所述扩增引物对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产
物；
3) 纯化所述PCR扩增产物，得到纯化的测序反应模板；
4) 用纯化的测序反应模板，以所述测序引物进行测序反应，得到 测序反应产物；
5) 纯化所述测序反应产物；
6) 对纯化的测序反应产物进行序列测定。 所述测序引物的碱基序列如SEQ ID NO: 1和2所示。
所述步骤3)具体为PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后切下 待测目标核苷酸目标扩增片段，经凝胶纯化试剂盒纯化，得到纯化的测 序反应模板。
本发明所述用于核酸PCR产物直接测序的测序引物，经GenBank中 BLAST比对结果显示该通用引物序列不与数据库中已知的常见致病性微: 生物、人类及其他哺乳类生物常见基因核酸序列具有完全同源性，不会 引起非特异的测序反应，测序结果可以特异性地反映出序列的真实碱基 组成，所以进行病原」微生物快速筛查和鉴定、遗传性疾病的分子诊断和 单核苷酸多态性研究，都可以利用本申请所述测序引物。
本发明所述用于核酸PCR产物直接测序的测序方法，不需将待测PCR 产物插入质粒载体，而直接对PCR产物进行核酸序列测定。与传统克隆测序技术相比，省去为测序而反复进行的分子克隆、细菌培养和模板制 备等繁瑣步骤，具有快速、简便、经济，并能更好地反映模板的真实情 况的优点，因而可被广泛地应用于基因突变检测、遗传性疾病诊断、单 核苷酸多态性分析、病原微生物快速检测和鉴定等领域。
图1是HBoV阳性标本PCR扩增产物电泳图，图中M为DNA标准带， 3、 6为HBoV阳性标本，IO为阴性对照，1、 2、 4、 5、 7、 8、 9为HBoV 阴性标本。
图2A和2B是人类博卡病毒PCR阳性产物测序图。 图3是四种腹渴病毒阳性标本PCR扩增产物电泳图，图中M为DNA 标准带，1、 2为RV阳性标本，3、 4为NV阳性标本，5、 6为EAV阳性 标本，7为AstV阳性标本，8为阳性对照，9为阴性对照。 图4是四种病毒PCR阳性产物测序图。
具体实施例方式
实施例1婴幼儿急性呼吸道感染人类博卡病毒(HBoV) PCR快速 筛查和测序鉴定
一、 标本来源及采集选取28d—10岁呼吸道感染患儿，共计447 例，在患儿入院后第2天，用一次性吸痰管吸取鼻咽分泌物约0. 5mL, 难以配合或分泌物少者则取咽拭子；标本加入2. OmL病毒运送液(含 100U/mL青霉素，100U/mL链霉素，2000U/mL两性霉素B),置-30。C冰 箱中待检。
二、 具体操作步骤如下
1)用软件Primer5. O设计测序引物，交由Invitrogen (上海)生物 〃>司合成。
上游引物SeqF (SEQ ID NO: 1): 5，-CGCCAGACGATATGCAGC-3，， 下游引物SeqR (SEQ ID NO: 2): 5'-GTGGACAGCGGATAGGTAC-3，， 合成博卡病毒VP基因片段PCR扩增引物，上游引物和下游引物的5，端分别连接测序引物SeqF、 SeqR (下划线部分为测序引物序列) 上游引物HBoVF:
5 ，-CGCCAGACGATATGCAGCGCAAACCCATCACTCTCAATGC-3' 下游引物HBoVR:
5 ，-GTGGACAGCGGATAGGTACGCTCTCTCCTCCCAGTGACAT- 3',
2) 人类博卡病毒核酸提取病毒核酸提取试剂盒购于美国Axygen 公司，严格按照说明书操作，核酸提取物-30。C保存备用。
3) 人类博卡病毒VP基因片段扩增
PCR试剂盒购于立陶宛Fermentas^^司，25pl反应体系，上、下游引 物HBoVF及HBoVR浓度为O. ljiM，病毒核酸提取物2pl， 2 x PCR-Mastermix 12. 5pl。 PCR反应条件94。C 5min; 94。C 30s， 60°C 30s， 72°C 45s， 35个循环；72°C 8min。
4 ) PCR产物纯化
扩增产物经lg/dL琼脂糖凝胶电泳枱r测，切下约440bp处VP基因目 标扩增片段。经美国Axygen公司AxyPrepTM凝胶纯化试剂盒纯化，得 到纯净的测序模板。
5) 测序反应
测序引物采用测序引物SeqF或SeqR,采用美国Beckman公司的 Ge議e Lab TMDTCS-Quick Start Kit。反应条件96°C 20s， 50。C 20s， 60°C 4min, 30个循环。
6) 测序纯化
测序反应产物按照Genome Lab TM DTCS-Quick Start Kit纯化步 骤进行纯化。
7) 序列测定
经美国Beckman公司的CEQTM88 0O遗传分析系统进行核酸序列测定， 所得产物序列输入基因库，采用BLAST进行同源性比对。 三、实验结果 1) HBoV PCIU全测结果
447份呼吸道感染患儿鼻咽分泌物中，有23例检出HBoV VP核酸特异片段，阳性率为5. 1%，阳性扩增产物均为长度约440bp的单一条带，与 预期结果相符。阳性标本PCR产物iy。琼脂糖凝胶电泳结果见图1。 2 ) HBoV阳性PCR扩增产物序列测定及核酸序列比对 对23份HBoV阳性标本的VP基因片段的PCR扩增产物进行核酸序 列测定。测得的基因序列提交基因库，获得登录号为EU334499 、 EU375243、 EU375244、 FJ184310、 FJ184311 、 EU358600一EU358603、 EU363219一EU363221。 23份阳性标本中有15林与EU358602核酸序列完 全相同，2抹与EU363220完全相同,另外4抹EU358601、 EU358603、 FJ184311 、 FJ184310具有独特的核酸序列。该6 4朱与瑞典株 ST1(DQ000495)核酸序列同源性为97. 8%-98. 8%,测序结果见图2。
测序结果证明本发明所述测序引物具有高特异性，表现在经 GenBank中BLAST比对结果显示该通用引物序列不与数据库中已知的核 酸序列(包括人、其他哺乳类、真核、原核生物)具有同源性，因此不 会引起非特异的测序反应，测序结果可以特异性地反映出序列的真实碱 基组成；
所述测序引物具有良好扩增效率，测序反应延伸良好，不会出现信 号的迅速衰减或中断而导致的测序失败，信号的信噪比高，碱基峰质量 高等，测序结果准确、可靠。
实施例2婴幼儿病毒性腹泻患儿粪便标本中轮状病毒、诺如病毒、 星状病毒，肠道腺病毒的检出和鉴定。
一、 标本来源及采集采集0至3岁腹泻患儿粪便标本192份，大便性 状为稀水样、稀糊样及粘液样，用生理盐水制成1%的^更悬液，并在-80
x:的水箱保存备用。
二、 具体操作步骤如下
1)测序引物的合成同实施例l;
合成轮状病毒(RV)、诺如病毒(NV)、星状病毒(AstV)，肠道腺病 毒(EAV)目标基因的PCR扩增引物，上游引物和下游引物的5，端分别连 接通用引物SeqF、 SeqR (下划线部分为通用引物序列)。引物序列见下 表病毒靶基因 引物序列(5'-3')
CGCCAGACGATATGCAGC ATATGC AGCGGAGGTTCTGTACTCATTGTCAAAAA GTGGACAGCGGATAGGTACTAGGTACTCCAGTTTGAAAGTCATTTCCATT
CGCCAGACGATATGCAGC ATATGCAGCTGGAATTCCATCGCCCACTGG GTGGACAGCGGATAGGTACATAGGTACAC(A/T/G)AIYC/T)TCATCATCACCATA
CGCCAGACGATATGCAGC GATATGCAGCATGTATTCCTTTTTCCGAAACTTCCA GTGGACAGCGGATAGGTACATAGGTACGCCACATGGTGCGATCGCA
CGCCAGACGATATGCAGCCGATATGCAGCCGTCATTATTTGTTGTCATACT GTGGACAGCGGATAGGTACGGATAGGTACACATGTGCTGCTGTTACTATG
2 )病毒核酸提取病毒DNA、 RNA提取试剂盒购于QIAGEN公司,~~ 严格按照说明书操作，提取的核酸置-80。C温度中保存备用。
3 )病毒核酸抬二测扩增RV、 NV及As tV的RT-PCR试剂盒购于QIAGEN 公司。RT-PCR反应条件反转录，50°C 30min; DM变性，95°C 15min; 94。C 45s—55°C 45s—72°C lmin ( 35个循环)，72。C延伸10min;扩增 EAV的PCR试剂盒购于Fermentas公司。PCR反应条件:94。C变性5min, 94°C 45s—55。C 45s—72°C lmin ( 35个循环)，72。C延伸10min。采用 1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，采用凝胶成像系统观察结果。
4) SAP—Exon I纯化PCR产物
6 pi PCR产物加入2 U SAP及1 U Exon I， 37°C 1 h， 75°C 15 min。 所得的纯化PCR产物作为测序反应模板。 步骤5)至步骤7)同实施例1。 三、实验结果
1)四种急性胃肠炎病毒PCR检测结果
192份患儿粪便标本中四种急性胃肠炎病毒PCR法的检出率为RV 50.5%, NV 12.0%, EAV 11.5%, AstV 2.1%。阳性标本PCR产物l。/n琼脂糖 凝胶电泳结果见图3。
2 )阳性PCR扩增产物序列测定及核酸序列比对
将所得序列输入GenBank，经BLAST比对，RV与已知序列EU679386、 DQ870492、 AF531912的同源性为95%-97%; NV与EU494692、 EU794709、 EU794707的同源性为95°/「97%; EAV与即15364， AB330122,的同源性 为98°/「100%; AstV与AF361030、 L1374S、 AY720891的同源性为93-95%, 测序结果见图4。
RV
NV
EAV
AstV
内衣壳蛋白
基因 RNA依赖的 RNA聚合酶
基因 外壳蛋白六 聚体基因 非结构蛋白
基因
R:
F: R:
F: R: F: R:SEQUENCE LISTING
<110>陆，学东
<120>用于核酸PCR产物直接测序的测序引物和测序方法 <130> PI1139 <160> 2
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA <213>人工序列
<400> 1
cgccagacga tatgcagc 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA <213>人工序列
<400> 2
gtggacagcg gataggtac 19
权利要求
1、用于核酸PCR产物直接测序的测序引物，其特征在于所述测序引物的碱基序列如SEQ ID NO1和2所示。
2、 用于核酸PCR产物直接测序的测序方法，其特征在于包括以 下步骤1)根据待检测的目标核酸序列设计并合成一对扩增引物，所述扩 增引物包括根据目标核酸序列设计的特异性^I物序列和位于特异性引 物5'端的测序引物序列，合成一对测序引物；2 )采用所述扩增引物对待测样品进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；3) 纯化所述PCR扩增产物，得到纯化的测序反应模板；4) 用纯化的测序反应模板，以所述测序引物进行测序反应，得到 测序反应产物；5 )纯化所述测序反应产物；6)对纯化的测序反应产物进行序列测定。
3、 根据权利要求2所述的用于核酸PCR产物直接测序的测序方法， 其特征在于所述测序引物的石咸基序列如SEQ ID NO: 1和2所示。
4、 根据权利要求2所述的用于核酸PCR产物直接测序的测序方法， 其特征在于，所述步骤3)具体为PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检 测后切下待测目标核苷酸目标扩增片段，经凝胶纯化试剂盒纯化，得到 纯化的测序反应模板。
全文摘要
本发明涉及核酸测序领域，尤其涉及一种用于核酸PCR产物直接测序的测序引物和测序方法。所述测序引物的碱基序列如SEQ ID NO1和2所示。本发明所述用于核酸PCR产物直接测序的测序引物，不会引起非特异的测序反应，测序结果可以特异性地反映出序列的真实碱基组成，所以无论进行何种病原微生物快速筛查和鉴定、遗传性疾病的分子诊断和单核苷酸多态性研究，都可以利用本申请所述测序引物。本发明所述用于核酸PCR产物直接测序的测序方法，不需将待测PCR产物插入质粒载体，而直接对PCR产物进行核酸序列测定。具有快速、简便、经济，并能更好地反映模板的真实情况的优点。
文档编号C12Q1/68GK101638691SQ200910189778
公开日2010年2月3日 申请日期2009年8月28日 优先权日2009年8月28日
发明者陆学东 申请人:陆学东