一种植物抗黄矮病相关蛋白TiDPK1及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：：一种植物抗黄矮病相关蛋白TiDPK1及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种植物抗黄矮病相关蛋白提TiDPKl及其编码基因与应用。
背景技术：
：大麦黄矮病毒可侵染小粒禾谷类植物，引起小麦、大麦、燕麦等小粒禾谷类作物和牧草的黄矮病，造成产量严重损失。大麦黄矮病毒(barleyyellowdwarfvirus,BYDV)是由蚜虫介导进行传播的。根据不同蚜虫的传播特性，把大麦黄矮病毒分为以下BYDV-PAV、BYDV-MAV、BYDV-GAV、BYDV-GPA、CYDV-RPV和SGV株系及RMV株系。其中BYDV-GPV(我国特有的株系类型)，BYDV-GAV为我国主流的株系。黄矮病是小麦的一种重要病毒病。小麦一旦感染黄矮病即无药可治，造成小麦减产和品质下降，因此黄矮病也称为"小麦癌症"，且分布广泛，在世界各麦区地均有发生。例如，1978年美国因小麦黄矮病的大爆发致使小麦减产60%80%。1988年德国冬小麦因黄矮病流行而减产40%。近年来，因小麦黄矮病危害，每年澳大利亚的小麦损失约3000万美元；新西兰、阿根廷、土耳其、突尼斯等国也有黄矮病的发生。1966年、1970年、1973年、1978年、1980年、1987年、19981999年我国的西北、华北部分地区和东北大面积发生此病害(张增艳，辛志勇，抗黄矮病小麦生物技术育种研究进展，作物杂志，2005，5:4-7)，仅1999年陕西、山西等麦区因黄矮病造成小麦减产20%30%，个别严重麦区减产超过50%，小麦产量损失达数亿公斤(曹亚萍，张明义，乔合心等，冬小麦黄矮病抗性的遗传分析，麦类作物学报，2000，28(6):738742)。近年来由于暖冬、暖春现象频繁，降水明显减少，给蚜虫越冬、繁殖和毒源保存创造了有利条件，致使黄矮病在我国有扩展和危害加重的趋势，小麦黄矮病流行范围已遍及陕西、山西、甘肃、四川、宁夏、内蒙古、河北和江苏等多个小麦产区。因此，黄矮病的防治对于保证小麦高产稳产和农业持续发展非常重要。选育和推广应用抗黄矮病小麦新品种，是防治该病害的最经济有效途径。然而，迄今，小麦初级基因库中尚未发现真正有效的抗性基因，仅鉴定出对BYDV-MAV株系表现一定耐性的Bdvl基因。近年来从偃麦草属、冰草属、赖草属、披碱草属、鹅冠草属中鉴定出十几种小麦远源亲缘植物免疫或高抗黄矮病，其中以中间偃麦草的研究与利用最多(张增艳，辛志勇，抗黄矮病小麦生物技术育种研究进展，作物杂专，2005，5:4-7)。中间偃麦草高抗BYDV-PAV、-GAV、-GPV、-MAV，-RPV等株系，至少含有3个抗黄矮病基因，分别位于第7同源群染色体7X长臂(7Ai-ftlL)，7E长臂和第2同源染色体2Ai-2短臂，分别命名为Bdv2、Bdv3、Bdv4。通过小麦X中间偃麦草远缘杂交，育成抗黄矮病的部分双二倍体TAF46、无芒中4(中5)。分别以TAF46、中5做桥梁亲本，育成抗黄矮病的二体附加系Ll与Zl、Z2、Z6。利用组织培养、中国春ph突变体诱导部分同源染色体配对等途径，成功地将Ll中抗黄矮病基因Bdv2导入小麦，育成一批抗黄矮病的小麦_中间偃麦草易位系，包括TC5-TC10、TC14以及YW642、YW443、YW243等(张增艳，辛志勇，抗黄矮病小麦生物技术育种研究进展，作物杂志，2005，5:4-7)。研究发现，携带抗黄矮病基因Bdv2的小麦-中间偃麦草易位系YW642、YW443、YW243等，高抗BYDV-GAV、-MAV、-GPV和-PAV等株系，并且GISH、RFLP标记等分析结果证明，携带Bdv2的中间偃麦草染色体7X长臂(7Ai-#lL)端部小片段易位到小麦染色体7D长臂端部(张增艳，辛志勇，马有志等，M即pingofaBYDVresistancegenefromThintermediumintermediuminwheatbackgroundbymolecularmarkers,ScienceinChina(SeriesC)，1999，42(6):663668)。本实验室研究结果还表明，YW642能显著抑制BYDV的复制与运动(XiaodongLiu，ZengYanZhang通讯作者，ZhiyongXin，2005，Molecularevidenceofbarleyyellowdwarfvirusreplication/movementsuppressedbytheresistancegeneBdv2derivedfromTh.intermedium,遗传学报，32:942-947)。理论上说，YW642、YW443、YW243等应该可以做为抗黄矮病小麦育种中易于利用的抗性种质。然而，这些易位系虽然高抗黄矮病致病株系但并被没有成功地应用、育成多少抗黄矮病小麦新品种，主要原因可能是抗黄矮病的染色体7Ai-ftlL片段存在着不利的连锁累赘。因此，迫切需要从抗黄矮病的小麦_中间偃麦草易位系YW642等材料中分离克隆出Bdv2等抗黄矮病重要基因，研究其抗性作用分子机制，并应用于基因工程育种，以高效地培育抗黄矮病、高产、优质的小麦新品种。本实验室和国外学者，以抗黄矮病小麦-中间偃麦草易位系YW642、TC14等材料，分子标记了来自小麦近缘植物中间偃麦草(Thinopyrumintermedium)的抗黄矮病基因Bdv2，将Bdv2定位到易位染色体的7AiftlL片段上(张增艳等1999，2001，2004;Stoutjesdijk，P.，Kammholz，S.，Kleven，S.，Matsay，S.，Banks,P.，andLarkin，P.2001，PCR—basedmolecularmarkerfortheBdv2Thinopyrumintermedi咖sourceofbarleyyellowdwarfvirusresistanceinwheat.Aust.J.Agric.Res.52:383—1388;Ayala，L，Henry，M.，Gonz，N.，Ginkel，M.，Mujeeb-Kazi，A.，Keller,B.，andKhairallah，M.(2001)AdiagnosticmolecularmarkerallowingthestudyofTh.intermedium—derivedresistancetoBYDVinbreadwheatsegregatingpopulations.Theor.Appl.Genet.102，942—949;Ayala，L，Bariana，H.，Singh，R.，Gibson,J.，Gibson,A.，andMechanicos，P.(2007)TrigenomicchromosomesbyrecombinationofThinopyrumintermediumandTh.ponticumtranslocationsinwheat.Theor.Appl.Genet.116,63-75)。但是，由于中间偃麦草与小麦的亲缘关系非常远，携带Bdv2的中间偃麦草染色体(7XL、7Ai#lL)片段与小麦部分同源染色体(7D)间很难发生交换分离，难以通过正常的F2群体精细定位Bdv2与分子标记之间的遗传距离，因此，图位克隆法不适用于分离克隆7AiftlL片段上Bdv2等决定黄矮病抗性的重要基因。
发明内容本发明的目的在于提供一种抗黄矮病蛋白，命名为TiDPKl，来源于中间偃麦草。本发明提供的植物黄矮病抗性相关蛋白(TiDPKl)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物黄矮病抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。为了使(a)中的TiDPKl便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表l标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的TiDPKl可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的TiDPKl的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表l所示的标签的编码序列得到。编码上述小麦黄矮病抗性重要蛋白的基因(TiDPKl)也属于本发明的保护范围。上述基因是如下1)或2)或3)或4)的基因1)编码序列是序列表中序列1的自5'端第196位-第1473位所示的基因；2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的基因；3)在高严谨条件下与1)或2)限定的基因杂交且编码所述蛋白的基因；4)与1)或2)限定的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。上述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7%SDS)中，65t:预杂交30min;弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7%SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65t:杂交12hr;弃杂交液，加入洗膜液I(20,1/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5%SDS)，65。C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1%SDS)，65。C洗膜30min。上述3)或4)的基因具体可以是序列3所示的基因。序列3所示的基因是上述编码基因的基因组DNA，该基因组DNA包括了2个内含子，第一个内含子位于序列3的自5'端的第126-629位，第二个内含子位于序列3的自5'端的第1644-1724位。含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。所述重组表达载体可将所述基因插入pAHC25载体的多克隆位点得到。含有以上任一所述基因(TiDPKl)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。扩增所述基因(TiDPKl)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，可将编码所述植物黄矮病抗性相关蛋白的基因TiDPKl导入目的植物(如植物细胞或组织)中，得到黄矮病抗性高于目的植物的转基因植物。具体来说，可以将所述重组表达载体导入目的植物中，得到黄矮病抗性高于目的植物的转基因植物。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获得黄矮病抗性增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本发明采用比较基因学、RACE技术、染色体定位、基因沉默快速分析功能、转基因功能互补实验等方法相结合的多元策略，进行了中间偃麦草染色体(7XL、7Ai#lL)片段上的抗黄矮病重要基因TiDPKl的分离和功能分析。实验证明本发明提供的TiDPKl基因在抗黄矮病的小麦材料(如YW642)中表达，受BYDV-GAV诱导后，Y怖42叶片的TiDPKl表达量得到提高，以接种12小时最高；亚细胞定位显示TiDPKl是1个膜蛋白；基因沉默结果显示沉默掉TiDPKl基因后，抗黄矮病的植物材料(如YW642)中BYDV-GAV相对浓度提高，并且感病指数上升。说明了TiDPKl基因与抗黄矮病密切相关。转入TiDPKl基因的原感病小麦对黄矮病的抗性得到显著提高。本研究为开展小麦抗黄矮病作用的分子机制研究和分子育种，高效地培育抗黄矮病、高产、优质的小麦新品种奠定了坚实基础。图1为TiDPKl基因的EST功能标记的筛选。图2为利用Q-RTPCR分析在接种携BYDV-GAV岈虫(毒岈)和岈虫(无毒岈)的YW642叶片中TiDPKl基因的表达谱。图3为TiDPKl蛋白的亚细胞定位图，A是GFP-TiDPKl;B是GFP。图4为利用Q-RTPCR分析在实施TiDPKl基因沉默的YW642及其空白对照YW642、中8601叶片中TiDPKl基因的表达量。图5为利用Q-RTPCR分析在实施TiDPKl基因沉默的YW642及其空白对照YW642、中8601叶片中BYDV-GAV-RdRp基因的相对表达量。图6是空白对照YW642、中8601和实施TiDPKl基因沉默的YW642(BSMV:TiDPKl-YW642)对BYDV-GAV反应的表型。图7是利用TiDPKl基因特异引物对转基因部分植株PCR检测结果，1:水，2:未转基因的中8601,3-22:转基因植株，P:转基因载体质粒，箭头指转基因目的带。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。完成本发明所依赖的遗传资源是中间偃麦草Z1146，于2005年9月购自中国农业科学院作物科学研究所资源种质库，由于是直接购买，所以其原始来源不清楚。本发明所用的其它生物材料如下带病毒BYDV-GAV株系的岈虫购自中国农业科学院植物保护研究所。中8601(感病小麦)和小麦_中间偃麦草易位系YW642(HW642)(抗病小麦_中间偃麦草T7DS7DL-7XL易位系)张增艳，马有志，辛志勇等，1998，应用基因组原位杂交技术鉴定抗黄矮病小麦新种质，中国农业科学，31(3):1-4;ZhangZ，XinZ，MaY，ChenX，XuQ，LinZ.1999，MappingofaBYDVresistancegenefromThinopyrumintermediuminwheatbackgroundbymolecularmarkers.SciChinaCLifeSci.42(6):663-668.;该易位系是1991年中国农业科学院作物科学研究所辛志勇等创制，张增艳等1996年鉴定出来；中国农业科学院作物科学研究所。BSMV-y(BMSV病毒的y载体)Burch-SmithTM，AndersonJC，MartinGB，Dinesh—K咖arSP.Applicationsandadvantagesofvirus—inducedgenesilencingforgenefunctionstudiesinplants.ThePlantJournal，2004，39:734_746;中国农业科学院作物科学研究所。hGFP载体Zhao_ShiXu，Lan-QinXia，MingChen，Xian-GuoCheng，Rui-YueZhang，Lian-ChengLi，Yun-XiangZhao，YanLu，Zhi-YongNi，LiLiu，Zhi_GangQiu，You—ZhiMa，2009，IsolationandmolecularcharacterizationoftheTriticumaestivumL.ethylene-responsivefactor1(TaERFl)thatincreasesmultiplestresstolerance,PlantMolBiol，65:719-732;中国农业科学院作物科学研究所。植物表达载体pAHC25:ChristensenandQuail，1996;Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,5，213-218.;中国农业禾斗学院作物科学研究所。实施例1、新基因的发现1、TiDPKl基因特异的EST功能标记的筛选与序列分析由于中间偃麦草染色体7XL(7Ai#lL)能够易位到小麦染色体7DL上，说明中间偃麦草染色体7XL(7AiftlL)与小麦染色体7DL具有部分同源关系。尽管对中间偃麦草还未开展功能基因组研究，但小麦功能基因组特别是EST计划的实施，许多EST被定位到小麦21条染色体上。因此我们利用小麦染色体7DL上的70个EST序列设计PCR引物，优化PCR扩增和凝胶电泳分析的条件，对携带Bdv2的抗黄矮病材料(中间偃麦草Z1146，小麦-中间偃麦草7X长臂(7Ai#lL)双端体附加系DT7XL，小麦_中间偃麦草易位系YW642)和无Bdv2的感黄矮病小麦材料(中8601，CS，YW641S)DNA进行PCR扩增和SDS-PAGE凝胶电泳分析。结果发现，利用小麦EST(BQ238952)设计的引物(BQ-U:5'-GACATGCCGTATTACCACAAG-3'，BQ-L:5'-GCCAGAGCATCCTCCTTG-3')可以扩增出TiDPKl基因特异片段，该特异片段出现在具有中间偃麦草7XL(携带Bdv2)的抗黄矮病材料，而感黄矮病小麦材料无此特异带(图1中箭头所指为TiDPKl基因扩增片段)。随后我们从凝胶中分离源于Z1146、DT7XL、YW642的TiDPKl特异扩增带(260bp片段)，用特异引物(F:5'-GACATGCCGTATTACCACAAG-3'，R:5'-GCCAATGCGTCCTCCTTG-3')进行二次PCR扩增，回收，克隆，菌落-PCR筛选阳性克隆，将含源于Z1146、DT7XL、YW642的TiDPKl基因片段的阳性克隆各3个进行测序分析，获得TiDPKl基因CDNA序列的No.289-548nt序列(260bp)。2、TiDPKl基因的全长cDNA序列和基因组序列的分离克隆利用源于Z1146、DT7XL、YW642的TiDPKl基因片段的序列设计3'RACE引物(3RP1:5，-CGTGATGTTCCCACGCCAAACTATTC-3，，3RP2:5'-AACAGCGTCATCTATCCCAACAAGGC-3，)，利用巢式PCR策略，以Z1146、Y怖42的cDNA为模板，快速扩增TiDPKl基因cDNA的3'序列(具体条件；94。C3min;94。C30s，72。C3min，5个循环；94。C30s，70。C3min，5个循环；94。C30s，68。C3min，25个循环；72。C10min;)，获得TiDPKl基因CDNA序列的No.457-1842nt序列。实施例2、基因的克隆及其分析—、基因的克隆根据实施例1的基因片段(BQ238952序列和3'RACE获得的序列)拼接的全长cDNA(核苷酸序列如1842bp的序列1所示)，设计全长序列的PCR扩增引物(QC-U:5'-GCAGCACGCCAATCCGC-3'，QC-L:5'-GCAGCCGCTATCAACACAAGAC-3')，以中间偃麦草Zl146(购自中国农业科学院作物科学研究所资源种质库)的cDNA为模板，PCR扩增TiDPKl基因的全长cDNA序列(具体条件94。C3min;94。C30s，62。C35s，72。Clmin30s，5个循环；94。C30s，60。C35s，72。Clmin30s，5个循环；94。C30s，58。C35s，72。Clmin30s，25个循环；72°C10min;)，获得序列表中序列1的自5'端第32-1827位所示的片段，其中，序列1的自5'端的第196-1473位的序列为完整开放阅读框(ORF)，编码序列2中由425个氨基酸组成的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸双元激酶蛋白TiDPKl。另夕卜，以上述QC-U和QC-L为引物，以YW642、中8601的cDNA为模板扩出的片段与序列表中序列1比对分析发现，源于Z1146、YW642的基因的TiDPKl与源于中8601的同源基因TaDPKl序列间仅存在23处单核苷酸多态性(SNP)差异。用上述QC-U禾口QC-L弓|物(QC-U:5，_GCAGCACGCCAATCCGC_3，，QC-L:5'-GCAGCCGCTATCAACACAAGAC-3')，以Z1146基因组DNA为模板，PCR扩增TiDPKl基因的基因组DNA全长序列，克隆，测序分析。结果得知TiDPKl基因的基因组DNA全长序列为2413bp，核苷酸序列如序列表中序列3所示，包含2个内含子，第一个内含子位于序列3的自5'端的第126-629位，第二个内含子位于序列3的自5'端的第1644-1724位。二、基因的分析1、TiDPKl基因的转录特点A、接种带病毒BYDV-GAV株系的蚜虫购自中国农业科学院植物保护研究所病毒组。镊取带有蚜虫的燕麦病叶小片置于三叶期YW642小麦植株叶腋间，在笼罩条件下强迫蚜虫爬至小麦植株上取食，每株接种5-10头岈虫，7d后药剂灭岈。B、Q-RT-PCR以保守的18SrRNA看家基因(18SrR-F:5'-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3'，18SrR-R:5，-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3，)作为内标基因使样品间总cDNA浓度保持一致，利用TiDPKl特异弓|物TID-SNF:5'-CGCTCCCCTCCTTCCCCGTC-3，，TID-SNR:5'_tgagtatctccgttggatgagttgg_3'，TAKARA公司的SYBRPremixExTaqTM试剂盒进行Q-RT-PCR，分析样品中TiDPKl表达量，每个样品至少3次重复。PCR扩增程序95。C变性lmin，进入95。C10s，60。Cfor31s共41个循环。结果如图2所示，受BYDV-GAV诱导后，Y怖42叶片的TiDPKl表达量得到提高，以接种12小时最高。上述结果说明TiDPKl可能是抗黄矮病相关基因。2、TiDPKl蛋白的亚细胞定位根据序列2的TiDPKl蛋白结构分析得知，TiDPKl双元激酶蛋白具有膜结合位点。为验证该蛋白结构的功能，我们构建了P35S::TiDPKl-GFP融合蛋白载体(具体步骤利用引物GFP-F(5'-GCC腐C7TATGATTGAGGGGGCAAGGTTCC-3'斜体序列为Hindi11酶切位点)和GFP-R(5'-TAGTCGGTGGTCATGGGCTCGG-3，斜体序列为BamHI酶切位点)扩增除去终止密码子的TiDPKl基因的ORF区，连接到pMD18-T载体上，连接产物转化到大肠杆菌中，挑选阳性克隆进行测序，将测序正确的阳性克隆菌株进行保菌并提取质粒，利用HindIII和BamHI将目的片段酶切下来，与经过HindIII和BamHI酶切的hGFP载体(中国科学院遗传研究所王道文研究员提供)进行连接，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆保菌并提取质粒，并用基因枪介导法(参考ZhangZengYan，YaoWuLan，DongNa，LiangHongXia，LiuHongXia，HuangRongFeng.2007.AnovelERFtranscriptionactivatorinwheatanditsinductionkineticsafterpathogenandhormonetreatments.JournalofExperimentalBotany58，2993-3003)，将P35S::TiDPKl-GFP转入洋葱表皮细胞进行瞬时表达(图3中A)，同时以空载体P35S::GFP在洋葱表皮细胞中瞬时表达作为对照(图3中B)。结果如图3所示，TiDPKl-GFP仅在细胞膜表达，而GFP在洋葱表皮细胞的核内与膜上均表达，说明TiDPKl是1个膜蛋白。[]实施例3、TiDPKl基因的抗黄矮病功能分析—、沉默YW642中的TiDPKl基因(病毒介导的基因沉默技术)利用BMSV病毒介导的基因沉默技术，进行TiDPKl的抗黄矮病功能的验证。用引物TiDPKl-FV:5，-AAgCggO^gACATGCCGTATTACCACAAG-3，斜体序列为Notl酶切位点，TiDPKl-RV:5'-CCHW，GCCAATGCGTCCTCCTTG-3，斜体序列为Pacl酶切位点，高保真TAQ酶扩增TiDPKl基因的特异片段(序列1的自5'端第289至第548位)，获得两边分别带有Pacl和Notl酶切位点的TiDPKl基因的特异片段。回收Pacl和Notl酶切的TiDPKl基因特异片段，连接到Pacl和Notl酶切的BSMV病毒的y载体上(BSMV病毒的y载体，参考Burch-SmithTM，AndersonJC，MartinGB，Dinesh-KumarSP.Applicationsandadrantegesofvirus—inducedgenesilencingforgenefunctionstudiesinplants.ThePlantJournal,2004，39:734-746;由美国LargeScaleBiology公司PogueGregory博士惠赠)，使TiDPKl基因的特异片段(序列1的自5'端第289至第548位)以反向法插到BMSV病毒的y载体上(被y载体的T7启动子驱动)，得到重组载体BSMV-y:TiDPKl。然后在携带Bdv2的抗黄矮病材料YW642的2叶期幼苗叶片上实施TiDPKl基因沉默，具体步骤如下采用摩擦法接种重组载体BSMV-y:TiDPKl到第二片叶完全伸展的抗病品种Y怖42的第一、第二片叶上。接种时，用未接种手固定小麦幼苗的基部，接种手的拇指和食指压住叶片，沿着叶片伸展的方向，从叶底部连续摩擦到叶尖，第一、第二两片叶子同时接种。接种完成后，向小麦幼苗喷施DEPC水，保鲜膜覆盖保湿24h，之后移去保鲜膜，每隔l-2h喷施一次DEPC水，白天25°C，16h光照，晚上20。C黑暗培养。至此得到了基因沉默的株系(随机取3个株系命名为BSMV:TiDPK1-1、BSMV:TiDPKl-2和BSMV:TiDPKl-3)。在实施TiDPKl基因沉默7天后，对上述3个基因沉默的株系以及未开展基因沉默的YW642和中8601按照实施例2中的接种方法接种黄矮病病毒(BYDV-GAV株系)，然后进行下述l)和2)的检测。1)利用Q-RT-PCR分析实施TiDPKl基因沉默的YW642及其空白对照YW642、中8601叶片中TiDPKl基因的表达量与BYDV-GAV的相对浓度A、Q-RT-PCR分析TiDPKl基因的表达量对上述3个基因沉默的株系以及未开展基因沉默的YW642和中8601进行Q-RT-PCR分析，实验步骤是以保守的18SrRNA看家基因(18SrR-F:5'-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3'，18SrR-R:5'-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3')作为内标基因使样品间总cDNA浓度保持一致，利用TiDPKl特异引物TID-SNF:5，-CGCTCCCCTCCTTCCCCGTC-3，，TID-SNR:5'-tgagtatctccgttggatgagttgg-3，，Takara公司的SYBRPremixExTaqTM试剂盒进行Q-RT-PCR，每个样品至少3个重复。PCR扩增程序95。C变性lmin，进入95。C10s，60。Cfor31s共41个循环。结果如图4(图4中BSMV:TiDPK1-1、BSMV:TiDPK1-2、BSMV:TiDPKl-3是不同基因沉默株系；Mock-l是未开展基因沉默的YW642、Mock-2是未开展基因沉默的中8601)所示，实施TiDPKl基因沉默5天、17天(接种BYDV-GAV的第10天)、27天(接种BYDV-GAV的第20天)后，实施TiDPKl基因沉默的YW642中TiDPKl基因已经完全沉默、不再表达，且TiDPKl基因沉默一直维持到收获。B、Q-RT-PCR分析BYDV-GAV-RdRp的相对表达量(BYDV-GAV-RdRp是BYDV-GAV病毒的一段基因，BYDV-GAV-RdRp的相对表达量可代表BYDV-GAV的相对浓度)。对上述3个基因沉默的株系以及未开展基因沉默的YW642和中8601进行Q-RT-PCR分析，实验步骤是以保守的18SrRNA看家基因(18SrR-F:5，-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3，，18SrR-R:5'-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3')作为内标基因使样品间总cDNA浓度保持一致，利用引物序列RdRP-F:5'-TGACCGAGGCTTGGAACGAC-3'，RdRP-R:5'-CGATGGTGGCGAGAGACAGT-3，，TAKARA公司的SYBRPremixExTaqTM试剂盒进行Q-RT-PCR，分析样品中RdRP表达量，每个样品至少3个重复。PCR扩增程序95。C变性lmin，进入95。C10s，60。Cfor31s共41个循环。结果如图5(图5的横坐标与图4的横坐标相同)所示，接种BYDV-GAV10天(实施TiDPKl基因沉默17天)，TiDPKl基因沉默的Y怖42中BYDV-GAV的相对浓度提高1-1.5倍，高于空白对照Y怖42叶片中的BYDV-GAV相对浓度，相当于中8601叶片中的BYDV-GAV相对浓度的1/2，接种BYDV-GAV20天(实施TiDPKl基因沉默27天)，TiDPKl基因沉默的Y怖42中BYDV-GAV的相对浓度提高3_4倍，远高于空白对照抗病的Y怖42叶片中BYDV-GAV相对浓度，相当于高感黄矮病的中8601叶片中BYDV-GAV相对浓度的3/5。2)接种BYDV-GAV30天后，观察基因沉默的Y怖42及未开展基因沉默的对照YW642、中8601对BYDV-GAV的反应型，进行抗病性调查。其中，抗性调查方法是按照全国统一的分级标准，单株划分病情级别，黄矮病发病程度分为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等11级。用发病程度值的大小作为衡量抗病程度的指标。小麦黄矮病发病强度(IT)分级标准如下0级健株1级部分叶尖黄化2级旗叶下1片叶黄化3级旗叶下2片叶黄化4级旗叶黄化1/4，旗叶下1片叶黄化5级旗叶黄化1/4，旗叶下2片叶黄化6级旗叶黄化7级旗叶黄化，旗叶下1片叶黄化8级旗叶和旗叶下2片叶黄化9级植株矮化，但能抽穗10级植株矮化显著，不抽穗结果如表1所示，接种BYV-GAV30天后，未开展基因沉默的中8601叶片表现对BYDV-GAV感病的症状(感病指数IT:7)，TiDPKl基因沉默的Y怖42也显示对BYDV-GAV感病的症状(感病指数IT:5)，而未开展基因沉默的YW642显示高抗BYDV-GAV、无感病症状(IT:0照片如图6所示)，说明TiDPKl基因是1个抗黄矮病重要基因。表1.TiDPKl基因沉默的YW642的病感指数11<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例4、转基因植物的获得和抗病性鉴定—、重组表达载体pA25-TiDPKl的构建单子叶植物表达载体pAHC25(ChristensenandQuail，1996;Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,5，213-218.由美国USDA-ARS的Dr.PeterQuail惠赠))，含有2个表达盒；第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS基因、Nos终止子，GUS两端具有Smal和Sacl酶切位点；第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar基因、Nos终止子。以Z1146的cDNA为模板，用加酶切位点的TiDPKl基因特异引物(QF-SMAI:5'-ATCCCGGGATGATTGAGGGGGCAAGGTTC-3，引入Smal酶切位点，QF-SACI:5，-CCGAGCTCTCAGTCGGTGGTCATGGGCTC-3'引入Sacl酶切位点)和高保真TAQ酶PCR扩增，获得两端带Smal和Sacl酶切位点的TiDPKl基因完整开放阅读框(0RF)，用Smal和Sacl酶切的该基因扩增片段和pAHC25，连接酶切的TiDPKl基因0RF与pAHC25载体目的片段，将TiDPKl基因OR替代pAHC25的GUS基因构建成重组载体。经过测序鉴定，重组载体中，含有TiDPKl基因的全长0RF构建到单子叶植物表达载体pAHC25的Smal和Sacl位点之间，该载体中的各片段序列正确，将该重组载体命名为pA25-TiDPKl.二、转基因植物的获得1、用基因枪法将pA25-TiDPKl轰击到小麦品种中8601幼胚的愈伤组织(轰击50枪，每枪40个愈伤组织，共计2000个愈伤组织块)(方法参见文献徐惠君，Steinbiss，H.H.，Sohn，A.，等，云南大学学报，1999，21:26-27)。2、轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。将愈伤组织转移到SD2(MS培养基的无机盐成分中添加VB工lmg/L，天冬门酰胺150mg/L，2，4-D2mg/L)，26°C，暗培养，恢复培养2周。3、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中(1/2MS培养基附加NAAlmg/L、KTlmg/L、Bial即hos2-5mg/L)，24-26光照培养14d。4、将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基附加Bial即hos2-3mg/L)，24-26光照培养。5、经过2-3次Bial即hos筛选的转化小苗转移到壮苗培养基(1/2MS培养基附加0.5mg/LNAA)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆，在温室生长发育。至此，获得了转pA25-TiDPKl的转基因植物。按照获得转pA25-TiDPKl的转基因植物的方法，将空载体pAHC25转入中8601，得到转空载体中8601对照。在4叶期，每株转化苗取1个叶片提取基因组DNA进行PCR鉴定(TID-SNF:5，-CGCTCCCCTCCTTCCCCGTC-3，，TID-SNR:5'-tgagtatctccgttggatgagttgg-3，)。结果表明，得到了转TiDPKl基因中8601阳性植株63株，PCR检测部分植株及其对照的电泳图见图7。12对63株PCR鉴定阳性的转TiDPKl基因小麦中8601植株、未转基因中8601和转空载体中8601对照，接种BYDV-GAV株系，进行抗病性鉴定。抗病性鉴定方法同实施例3。接种5周后开始进行抗病鉴定。结果表明有29株转TiDPKl基因阳性的小麦中8601对BYDV-GAV表现抗性(IT1-2);未转基因中8601叶片表现感病症状(IT7-8);转空载体中8601对照的叶片表现感病症状(IT7-8);未转基因YW642高抗BYDV-GAV(IT0)。再次说明TiDPKl基因是1个抗黄矮病重要基因。序列表〈110〉中国农业科学院作物科学研究所〈120〉一种植物抗黄矮病相关蛋白TiDPKl及其编码基因与应用〈160>3〈210>1〈211>1842〈212>DNA〈213〉中间偃麦草(Thinopyrumintermedium)〈400>1ccacgcgtccgcgcctcgcacgcagcacgccaatccgcgcccggattctc60cccgccgcccaatcgccgccgccgctcccctccttccccgtccgcagctccgctcccggc120tgaggacccatttcattgctgg3g皿C3g3teattgtcagaagctttgccattggtgtgt180gttgcatctttg皿gatgattg郷gggraaggttccacaatetgcteggcggtgccggc240atcggcggcggc卿ggg皿gctggag皿c皿gagc皿cggcttctecgacatgccgtet300teccac皿ggtcgggg卿gctcccacatgtcggtgg織gcgcggac皿catgaactcg360atg皿ctetgttggcagctccgtcgccatgtcggtgg織3C3gC3gCgtggcctcgaac420gagtcccgcaccgtcatgctc皿ccaccctggcctccgtgatgttcccacgccaaactet■tcagtttgcaacagcgtcatctetcccaac皿ggctgctgcgtctgttctc皿ggaggac540gcattggctcgggttttgatggacccaactcatccaacggagatectcacteactecgag600gagtggaccatcgatctgggg皿gctggacatgggggctccttttgctcagggggccttt660gga皿gctetatcgggg皿cateteatgggga卿tgttgccatteagctgctgg卿ag720cctgag皿tgatc^gagagatgg^cagcagtttgtgcaag皿gttetg780atgttgtcteccccaatettgteaggttcattggggcatgccgg皿gtcg840attgtttggtgtetcattectg皿tetgca腿ggtggctctgtcaggcagttccttgcc■Cg皿ggC3g3ccaagtctgtgcccctgagattggragtgatgatgttgcc960郷gg皿tggcgtetgtgcatgccctgggatttetccacagggatctg皿gtcagateac1020cttcteatttC3gC3g3C皿atccatcaagattgcagactttggagttgctcg皿tcgag1080gte皿皿ccg3ggg皿tg3Cggaaccteccgctggatggc3CCgg3g3tg1140atccagcacaggccttetgatcateaggtcgacgtgtetegctttgggattgtgccgtgg1200gagcttetgaccggcatgctccccttcacacggttcaggcagcttttgct1260gtggtga織皿皿cgctcgtcctgccatcccacaagattgcctgcctgctcteagccac1320atcatgacccgttgctgggacgcaaaccctgaagtccgcccgtcattcaacgaggtcgtc1380accatgctcgaggctgccgagacggacgttgtcagcaacgtccgteaggcacggttccgc1440tgctgcatctccgagcccatgaccaccgactgagactegtgccaggatec3g3gteccag1500朋朋tg朋朋atggg朋g朋g朋cg朋gatggga朋ggaggcgacgc朋tctcgatgtet1560agaccacactgatecacctgggcgttgcgtgtgcctgcctatccgaaggtctgatggttg1620ccctgggcteagcteggttcttcattgctgctttctectetcttgtcttegttgcatggg1680ttggagtgattgtttgccaagtetggatgatgctecgtetgttttctgttttcttggaag1740gatgctetctggtetgtteac朋ggagctetggtetgtettctccgc朋gc朋3gagcte1800tctttgtcttgtgttgategcggctgcgaa1842〈210>2〈211>425〈212>PRT〈213〉中间偃麦草(Thinopyrumintermedium)〈400>2MetlieGluGlyAlaArgPheHisAsnMetLeuGlyGlyAlaGlylie151015GlyGlyGlyArgGlyLysLeuGluAsnLysSerAsnGlyPheTyrAsp202530MetProTyrTyrHisLysValGlyGluSerSerHisMetSerValAsp354045SerAlaAspAsnMetAsnSerMetAsnTyrValGlySerSerValAla505560MetSerValAspAsnSerSerValAlaSerAsnGluSerArgThrVal65707580MetLeuAsnHisProGlyLeuArgAspValProThrProAsnTyrSer859095ValCysAsnSerVallieTyrProAsnLysAlaAlaAlaSerValLeu100105110LysGluAspAlaLeuAlaArgValLeuMetAspProThrHisProThr115120125GlulieLeuThrAsnTyrGluGluTrpThrlieAspLeuGlyLysLeu130135140AspMetGlyAlaProPheAlaGinGlyAlaPheGlyLysLeuTyrArg145150155160GlyThrTyrAsnGlyGluAspValAlalieLysLeuLeuGluLysPro165170175GluAsnAspGinGluArgAlaGinLeuMetGluGinGinPheValGin180185190GluValMetMetLeuSerThrLeuArgHisProAsnlieValArgPhe195200205<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>acttttaacctccaagggttagttgagtttagtttegttt郷tgggg皿tgcgteggte420gga朋gcttcagtgctgcgaagctcaatttggtctgtgtc皿gateggttaattttgctg■ttgctggatgg￡ltgg￡ltgg￡lttttggggcctgctetccttccttctcagccgtg咖tgg540ggca朋ttteccttgtgttgtetetgtteggttetgtgttgtgcatttcgatggacagtc600atetectctgtcctggttetatetgcaggacccatttcattgctggag皿cagateattg660tcagaagctttgccattggtgtgtgttgcatctttg皿gatgattgagggggc皿ggttc720cacaatetgcteggcggtgccggcatcggcggcggcagaggg皿gctggag皿c皿gagc780aacggcttctacgacatgccgtetteccac皿ggtcggggagagctcccacatgtcggtg840g織gcgcggctcgatgaactetgttggcagctccgtcgccatgtcggtg■g3C朋C3gC3gcgtggcctcg皿cgagtcccgcaccgtcatgctcaaccaccctggcctc960cgtgatgttcCC3CgCC3朋ctettcagtttgc皿cagcgtcatctetccc皿c皿ggct1020gctgcgtctgttctcaaggaggacgrattggctcgggttttgatggacccaactcatcca1080acggagatectcactaactacg郷賜tggaccatcgatctgggg皿gctgg織tgggg1140gctccttttgctcagggggcctttgga皿gctetetcgggg^cateteatgggga卿t1200gttgccatteagctgctggag皿gcctgaggttgatgg皿1260cagcagtttgtgc朋g朋gttatgatgttgtctecattgaggcaccccaatettgteagg1320ttcattggggcatgccgg朋gtcgattgtttggtgtetcattectgaatetgc朋皿ggt1380ggctctgtcaggcagttccttgcccg皿ggC3g3CC皿gtctgtgcccctg卿ttggra1440gtg朋3C3g3cacttgatgttgcc郷ggaatggcgtetgtgcatgccctgggatttetc1500C3C3ggg3tCtgaagtcagataaccttcteatttcagcagc^gattgca1560gactttggagttgctcgaatcgaggte^a3CCg3ggg皿tgactccagag3C3gg皿CC1620tecteagtcaattgcatccacteccgatgttttttttgtgtgcaaatgtctctcagatet1680gctgatgtcttttgcctteacaggcgctgg3tggC3CCggagatgatccagcacaggcct1740tetgatcateaggtcgacgtgtetegctttgggattgtgccgtgggagcttetgaccggc1800atgctcccctg織gcggttcaggcagcttttgctgtggt1860gctcgtcctgCC3tCCC3C3agattgcctgcctgctcteagccacatcatgacccgttgc1920tgggacgcaaaccctgaagtccgcccgtcattc皿cgaggtcgtcaccatgctcgaggct1980gccg卿cggacgttgtcagcaacgtccgt皿ggcacggttccgctgctgcatctccgag2040cccatgaccaCCg3Ctg3g3ctegtgccaggatecagagtg皿朋atggg2100朋g朋g朋cg朋gatggg皿郷郷cgacgcaatctcgatgtetegaccacactgatac2160acctgggcgttgcgtgtgcctgcctetccg皿ggtctgatggttgccctgggcteagcte2220ggttcttcattgctgctttctactetcttgtcttegttgcatgggttggagtgattgttt2280gcc朋gtetggatgatgctecgtetgttttctgttttcttgg皿ggatgctetctggtet2340gtteac朋ggagctetggtetgtettctccagctatctttgtcttgtgtt2400gatagcggctgcg241权利要求一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与植物黄矮病抗性相关的的由1)衍生的蛋白质。2.权利要求l所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的基因1)编码序列是序列表中序列1的自5'端第196位-第1473位所示的基因；2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的基因；3)在高严谨条件下与1)或2)限定的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；4)与l)或2)限定的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述3)或4)的基因如序列表中序列3所示。5.含有权利要求2-4任一所述基因的重组载体或重组菌或转基因细胞系。6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是将权利要求2-4任一所述基因插入PAHC25载体的多克隆位点得到的重组表达载体。7.—种培育转基因植物的方法，是将权利要求2-4任一所述基因导入目的植物中，得到黄矮病抗性高于目的植物的转基因植物。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于权利要求2-4任一所述基因通过权利要求5或6所述重组表达载体导入目的植物中；所述目的植物为小麦。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述目的植物为小麦品种中8601。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述黄矮病是由黄矮病病毒BYDV-GAV株系引发的。全文摘要本发明公开了一种植物抗黄矮病相关蛋白TiDPK1及其编码基因与应用。该蛋白是如下1)或2)的蛋白1)序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)在序列表中序列2的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且与植物耐逆相关的由1)衍生的蛋白质。上述蛋白的编码基因TiDPK1基因和转基因株系、方法也属于本发明的保护。实验证明该基因在抗黄矮病小麦(如YW642)中特异表达，且受BYDV诱导上调；TiDPK1是1个膜蛋白；TiDPK1沉默的原抗黄矮病的YW642中BYDV浓度提高、感病指数上升；过表达的转基因小麦提高了黄矮病抗性；说明TiDPK1基因是抗黄矮病重要基因。文档编号C12N15/82GK101704883SQ200910237948公开日2010年5月12日申请日期2009年11月26日优先权日2009年11月26日发明者刘艳,张增艳,徐惠君,辛志勇,陈亮,高兰英申请人:中国农业科学院作物科学研究所