专利名称：一种来源于瘤胃的中性植酸酶cp53及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种来源于瘤胃的中性植酸酶 CP53及其基因和应用。
背景技术：
反刍动物比起单胃动物，能更加有效的利用饲料中的植酸磷，原因在于在动物的 瘤胃中可能存在一些能够降解植酸的微生物。Yanke et al. (1998)胃中分离的许多厌养 细菌例如 Selenomonas ruminantium、Prevotella ruminicola、Megasphaera elsdenii、 Mitsuokella multiacidus、Mitsuokella jalaludinii 等中都检测到了植酸酶活性，其中 S. ruminantium的植酸酶活性最高(Yanke et al. 1998，144 1565-1573)。不同于其他类植 酸酶，该植酸酶有一个自己的典型序列(保守的活性位点)HCXXGXXR[T/S]。在空间结构上分为两个结构域大结构域和小结构域。大域主要由β片层和α 螺旋构成，类似三明治的结构。小域是由β片层构成的β折叠桶结构。活性部位序列 HCXXGXXR[T/S]形成一个环状结构(p-loop)，活性中性Cys位于p-loop中。活性中心处于 大小结构域之间，它的功能可能是作为与底物结合的口袋，这个口袋的深浅是决定底物特 异性的重要因素。该类植酸酶水解植酸酶的终产物和Aspergillusniger的HAP植酸酶相 似(ffyss et al. 1999，65 :367 373.)，都是2_单磷酸肌醇。，它的活性会受一些金属离子 的抑制，如Cu2+、Zn2+和Hg2+。CP植酸酶是一类从瘤胃环境中分离的植酸酶，目前进行过性质测定的该类植酸酶 比较少，该类植酸酶的最适PH值一般在4. 0-5. O之间，未见中性植酸酶的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的中性植酸酶。本发明的再一目的是提供编码上述中性植酸酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述中性植酸酶的基因工程方法。本发明的另一目的是提供上述中性植酸酶的应用。本发明从瘤胃液中获得一种新的中性植酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。SEQ ID NO. 1 MKKSLALLFALALLLSSCSHQHYTYLRAAEERETVTAAQREEYAAFVWRERRDREALPDNFRICRNEFR QRSAVSGYDPEFVPSRKGLDELKVSASSDFSAGELDAAIAEIRKYHDGPITVVDLRKETHGLLNGNHVSRYGKQNWD NISLSREEIIASEKEIIHGTVGTQVETGSTRPGGRTSTMDVTTAQTEAELCASRGIGYFRLTVLDHCFSDPESIDAF IAFVRTLPENTWLHFHWQAGVGRANMYLIFYDFLRNPDVPEKDIVYRHFNQGGNFMYYQ⑶KPNEEEYKIPLAKEKA EMIPLVRQYIQEQQPKGFKLSffTQffKARRR其中，该酶基因编码331个氨基酸，前21个氨基酸为信号肽序列。因此，成熟的中性植酸酶CP53的理论分子量为36. 2kDa。该植酸酶CP53在中性pH范围内具有较高的活 性。本发明首次从瘤胃环境直接克隆的中性植酸酶，其最适pH值为6.5，在pH 2. 5-8.5之 间有较好的稳定性；最适温度为50°C，热稳定性相对较差，在50°C处理20min后，植酸酶活 基本上损失；比活为 58U/mg，Km = 0. 65mmol/L, Vmax = 107. 5 μ mol/mg/min。与以往所报 道的CP植酸酶相比，该CP植酸酶在中性条件下具有更高的催化活性，这是首次发现的中性 CP类植酸酶，该结果进一步加深了对CP植酸酶的认识。其信号肽序列为MKKSLALLFALALLLSSCSHQ(SEQ ID NO. 3)。因此，成熟的中性植酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示HYTYLRAAEE RETVTAAQRE EYAAFVWRFE RRDREALPDN FRICRNEFRQRSAVSGYDPE60FVPSRKGLDE LKVSASSDFS AGELDAAIAE IRKYHDGPIT WDLRKETHGLLNGNHVSRY120GKQNWDNISL SREEIIASEK EIIHGTVGTQ VETGSTRPGG RTSI1DVTTAQTEAELCASR180GIGYFRLTVL DHCFSDPESI DAFIAFVRTL PENTWLHFHW QAGVGRANMYLIFYDFLRNP240DVPEKDIVYR HFNQGGNFMY YQGDKPNEEE YKIPLAKEKA EMIPLVRQYIQEQQPKGFKL300SffTQffKARRR本发明提供了编码上述中性植酸酶的基因cp53。具体地，该基因的基因组序列如 SEQ ID NO. 4 所示ATGAAMAGAGTCTTGCCTTGCTGTTCGCGCTGGCGTTGCTGCTCTCCTCCTGCAGCCACCAGCACTACACC TACCTCCGGGCGGCCGMGAGCGGGAMCCGTGACGGCCGCGCAGCGGGMGMTACGCCGCCTTCGTCTGGCGCTTCGA GCGCCGCGACCGGGMGCCCTGCCCGACAATTTCCGGATCTGCCGGMCGAGTTCAGGCAGCGGAGCGCCGTGCCGGGCT ACGACCCGGMTTCGTGCCCTCCCGCMGGGCCTGGATGAGCTGMGGTCAGCGCGAGCTCGGACTTCAGCGCCGGGGAG CTGGACGCCGCGATCGCGGMATCCGMMTACCATGACGGCCCGATCACGGTCGTGGACCTGCGGAMGAGACCCACGG CCTGCTGMCGGCMCCACGTGTCCCGCTACGGCMGCAGMCTGGGACMCATCGGCCTGAGCCGGGMGAGATTATCG CATCCGAAMGGAMTCATCCACGGCACGGTGGGAACGCAGGTGGAGACGGGMGCACCCGCCCCGGCGGACGCACCAGC ACGATGGACGTGACGACGGCCCAGACGGMGCCGMCTCTGCGCGAGCCGCGGCATCGGCTATTTCCGCCTGACGGTCCT CGACCACTGCTTCTCCGATCCCGAMGCATCGACGCGTTCATCGCCTTCGTGCGGACGCTCCCGGAGMCACCTGGCTGC ACTTCCATTGCCAGGCGGGCATGGGCCGCACGAACATGTACCTGATCTTCTACGACTTCCTGCGCMCCCGGACGTTCCG GAAMGGATATCGTGTACCGCCACTTCMCCAGGGCGGCMCTTCATGTACTACCAGGGCGACMGCCCMCGAGGAGGA GTACMGATCCCCCTCGCCAAGGAGAMGCCGAMTGATCCCGCTGGTCCGCCAGTACATCCAGGAGCAGCAGCCCMGG GCTTCMGCTCAGCTGGACGCAGTGGMGGCCCGCCGGCGCTM本发明通过PCR的方法分离克隆了这一植酸酶基因cp53，DNA全序列分析结果表 明，植酸酶CP53结构基因cp53全长996bp。其中，信号肽的碱基序列为ATGAAAAAGA GTCTTGCCTT GCTGTTCGCG CTGGCGTTGC TGCTCTCCTCCTGCAGCCAC CAG(SEQ ID NO. 6)。成熟的植酸酶CP53的基因序列如SEQ ID N0. 5所示。SEQ IDN0. 5cactacacct acctccgggc ggccgaagag cgggaaaccg tgacggccgc gcagcgggaa gaatacgccgccttcgtctg gcgcttcgag cgccgcgacc gggaagccct gcccgacaat ttccggatct gccggaacga gttcaggcagcggagcgccg tgccgggcta cgacccggaa ttcgtgccct cccgcaaggg cctggatgag ctgaaggtcagcgcgagctc ggacttcagc gccggggagc tggacgccgc gatcgcggaa
4atccgaaaat accatgacggcccgatcacg gtcgtggacc tgcggaaaga gacccacggc ctgctgaacg gcaaccacgt gtcccgctacggcaagcaga actgggacaa catcggcctg agccgggaag agattatcgc atccgaaaag gaaatcatccacggcacggt gggaacgcag gtggagacgg gaagcacccg ccccggcgga cgcaccagca cgatggacgtgacgacggcc cagacggaag ccgaactctg cgcgagccgc ggcatcggct atttccgcct gacggtcctcgaccactgct tctccgatcc cgaaagcatc gacgcgttca tcgccttcgt gcggacgctc ccggagaaca cctggctgcacttccattgc caggcgggca tgggccgcac gaacatgtac ctgatcttct acgacttcct gcgcaacccg gacgttccggaaaaggatat cgtgtaccgc cacttcaacc agggcggcaa cttcatgtac taccagggcg acaagcccaacgaggaggag tacaagatcc ccctcgccaa ggagaaagcc gaaatgatcc cgctggtccg ccagtacatccaggagcagc agcccaaggg cttcaagctc agctggacgc agtggaaggc ccgccggcgc taa 成熟蛋白理论分子量为36. 2kDa。将植酸酶基因cp53序列及推导出的氨基酸序列 在GenBank中进行BLAST比对。该基因与来源于Megasphaera elsdenii的假定的CP植酸 酶基因序列一致性最高，氨基酸序列一致性为42%，说明CP53是一种新的植酸酶。
本发明还提供了包含上述植酸酶基因的重组载体，优选为pET22b_cp53。将本发明 的植酸酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表 达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将植酸酶基因插入到质 粒pET22b(+)上的NcoI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pET22b_cp53。本发明还提供了包含上述植酸酶基因的重组菌株，其保藏编号为CGMCC No. 3493， 优选为重组菌株BL21cp53。本发明还提供了一种制备中性植酸酶的方法，包括以下步骤1)用权利要求重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组植酸酶的表达；以及3)回收并纯化所表达的植酸酶。其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大 肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21/cp53。本发明还提供了上述中性植酸酶的应用。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在饲料工业中应用新的植酸酶。本发明获得了一种中性植酸酶CP53，最适pH6. 5，在 PH 2. 5-8. 5之间有较好的稳定性。这些性质符合动物消化生理特点，能够提高饲料消化率 和代谢能，降低配方成本，减少环境污染。本发明的植酸酶在中性条件下展现了较高的植酸 酶活性，属于中性植酸酶。饲料中添加植酸酶，可有效分解存在于饲粮中的植酸，释放无机 磷，提高饲料中植酸磷的利用率，降低粪便中磷的排放量，减少环境污染。同时可以解除植 酸的抗营养作用。
图1在大肠杆菌中表达的重组植酸酶的SDS-PAGE分析，其中，M 低分子量蛋白质 Marker ；1 含有植酸酶基因的大肠杆菌培养上清液浓缩液；2 纯化的重组植酸酶。图2重组植酸酶的最适pH。图3重组植酸酶的pH稳定性。
图4重组植酸酶的最适温度。图5重组植酸酶的热稳定性。含本发明的植酸酶的重组菌株大肠埃希氏菌CP53 (Escherichia coli CP53)，其 保藏编号为CGMCC No. 3493，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏日期2009年12月3曰。
具体实施例方式试验材料和试剂1、载体大肠杆菌表达载体pET22b(+)及菌株Escherichia coli BL21(DE3)购自 于Novagen公司。2、酶类及其它生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。 燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基(I)LB 培养基(g/Ι)酵母粉 5.0，蛋白胨 10.0，NaCl 10. 0，ρΗ7· 0。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。实施例1瘤胃环境宏基因组的提取采用直接裂解法分别提取山羊和牛的瘤胃液微生物的宏基因组DNA。具体步骤如 下1、取50mL瘤胃液，用纱布过滤除去未消化的草根及大的颗粒，并用适量的灭菌磷酸盐 缓冲液冲洗草根中吸附的部分微生物；2、上清转移至多个新的50mL离心管中，加入两倍体 积预热的裂解缓冲液，70°C水浴2h，其间每隔IOmin轻轻晃动混勻一次；3、取出后冷却至室 温，5，OOOrpm离心lOmin，弃沉淀，重复离心一次；4、上清中加入0. 7倍体积的异丙醇，轻柔 混勻，冰上放置30min，10，OOOrpm离心30min，沉淀用70%的乙醇清洗一次真空干燥lOmin， 溶于ImL ddH20中；5、取5_10 μ L此粗提的宏基因组DNA电泳检测；粗提的宏基因组DNA用 0. 8%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收分子量在20-40b的基因组DNA，进一步电泳检测，备用。实施例2植酸酶编码基因cp53的克隆根据CP 植酸酶基因的保守([V/M/I]-D-L-R-[Q/K/E]-E-[S/T]-H 和 W-L-H-F-H-C- [X] - [A/E] -G- [X] -G-R-T-T)序列设计合成了简并引物 P1，P2Pl 5' -GTGGACCTRCGRSARGARWCICA-3‘；P2 5' -GTCCGACCATTGCCTGCYTCRCARTGRAMRTGIADCCA-3')。以纯化的瘤胃液宏基因组DNA为模板进行PCR扩增。降落PCR反应参数为94°C 变性5min ；94°C变性30sec，58_52°C退火30sec，72°C延伸lmin，10个循环(每个循环降落 I0C ),然后 94°C变性 30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，30 个循环，72°C保温 IOmin。得 到一约400bp片段，将该片段回收后与PEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。根据测序得到的400bp的核苷酸序列，设计上游和下游各四条TAIL-PCR特异性引 物设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在spl的内侧，sp3位于sp2的内 侧，sp4位于sp3的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22 30nt，退火温度在60 650C 0并将它们分别命名为uspl,usp2, usp3, usp4(上游特异性引物)， dspl，dsp2，dsp3，dsp4(下游特异性引物)见表1。表1.植酸酶CP53 TAIL-PCR特异性引物 通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物 技术有限公司测序。通过四步Tail-PCR获得该片段的上下游侧翼序列。拼接后CP53植酸 酶基因全长996bp，编码331个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP (http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP)进行分析表明N端21个氨基酸为预测的信号肽。预测该基因 所编码的成熟蛋白的理论分子量为36. 2kDa，等电点为6. 6。氨基酸序列在GenBank中进行 BLAST比对发现，该基因与来源于Megasphaera elsdenii的假定的CP植酸酶基因序列一致 性最高，氨基酸序列一致性为42%。其三维结构通过预测分析，具有典型的CP植酸酶的结 构，活性位点Cys位于催化中心的P-Ioop上。实施例3重组植酸酶的制备。将表达载体pET22b (+)进行双酶切(NcoRI+XhoI)，同时将编码植酸酶的基因cp53 双酶切(NcoRI+XhoI)，切出编码成熟植酸酶的基因片段与表达载体pET22b(+)连接，获得 含有植酸酶基因cp53的重组质粒pET22b-cp53并转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得重组大肠 杆菌菌株BL21 cp53。取含有重组质粒的BL21菌株，接种于3mL LB (100 μ g/mL的氨苄青霉素)培养液 中，37°C培养过夜。接菌于20mL LB (加有100 μ g/mL的氨苄青霉素)，37°C振荡培养约 2 3h (OD600达到0. 6 0. 8)后加入终浓度0. 6mmol/L的诱导剂IPTG，20°C 180rpm震荡 培养12h。12000rpm离心5min，收集培养基上清。经过IPTG在30°C诱导8h后，在诱导液的细胞破碎液中检测到植酸酶活性，在pH 4. 5的条件下，检测到的植酸酶的活性是0. 51U/mL。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组植酸 酶在大肠杆菌中得到了表达。所表达的植酸酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白
7的90%以上。实施例4重组植酸酶的活性分析植酸酶活性的测定采用蓝钼法(Huang et al. , 2006)将酶液用含有0. 05% BSA 和0.05% Triton X-100的0. 25mol/L的pH 5. 0的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，取50 μ L稀 释的酶液加入950 μ L 1. 5mmol/L底物植酸钠(用0. 25mol/L的pH 5. 0的乙酸-乙酸钠缓 冲液配制)，37°C水浴中反应15min，加ImL 10% TCA终止反应，接着加2mL显色液(IOg四 水合钼酸铵，32mL浓硫酸，73. 2g硫酸亚铁，加水定容至1L)，对反应液进行显色。对照则加 酶液后先加TCA混勻，再加底物。显色IOmin后，在700nm下测其OD值，最后计算酶活单位。实施例5重组植酸酶CP53的性质测定1、重组植酸酶CP53的最适pH和pH稳定性的测定方法如下将实施例4纯化的重组植酸酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底 物植酸钠用不同PH的缓冲液37°C下进行植酸酶活力测定。结果(图2)表明，CP53的最适 PH为6.5，在pH 4.5到？!1 8. 0条件下，该酶具有较好的催化活性。植酸酶于上述各种不同 PH的缓冲液中37°C处理60min，再在pH6. 5缓冲液体系中37°C下测定酶活性，以研究酶的 PH耐性。结果(图3)表明，该重组酶在整个酸性条件下具有极好的稳定性，在碱性条件下 稳定性较差。2、植酸酶的最适温度及热稳定性测定方法如下植酸酶的最适温度的测定为在pH6. 5缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐 温性测定为植酸酶在不同温度下处理不同时间，再在37°C下进行酶活性测定。酶反应最适 温度测定结果(图4)表明，其最适温度为50°C。酶的热稳定性性试验表明(图5)，在50°C 处理5min后，损失了近60%的相对活性，处理30min后，基本检测不到植酸酶活性。3、植酸酶的Km值测定方法如下用不同浓度的植酸钠(0. 125、0.25、0.5、l、2、4mM)为底物，在最适pH缓冲体 系中，37°C下测定酶活性，计算相应的反应速度，利用米氏方程双倒数法求得Km值及 Vmax (Lineweaver-Burk法)。采用双倒数做图法，绘制重组植酸酶的动力学曲线，该植酸酶 的 Km = 0. 65mmol/L, Vmax = 107. 5 μ mol/mg/min。4、不同金属离子化学试剂对CP53酶活的影响测定如下在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性 的影响，各种物质终浓度为lmmol/L。在50°C、pH6. 5条件下测定酶活性。结果(表2)表明 不同离子或化学试剂处理后，重组植酸酶CP53的酶活的变化情况。从表中可以看出绝大多 数的离子对酶活性具有部分抑制作用，如Fe3+，Hg2+，Ag+对植酸酶的活性几乎完全抑制， 另外，SDS也几乎完全抑制其活性。表2.各种化学试剂对植酸酶CP53活力的影响
序列表
<110>中国农业科学院饲料研究所
<120> 一种来源于瘤胃的中性植酸酶CP53及其基因和应用
<160>6
<210>1
<211>331
<212>PRT
<213> 牛、山羊(bowt、goat)
<400>1
MKKSLALLFALALLLSSCSH QHYTYLRAAEERETVTAAQR EEYAAFVffRF
ERRDREALPD60
NFRICRNEFRQRSAVSGYDP EFVPSRKGLDELKVSASSDF SAGELDAAIA
EIRKYHDGPI120
TVVDLRKETHGLLNGNHVSR YGKQNWDNISLSREEIIASE KEIIHGTVGT
QVETGSTRPG180
GRTSTMDVTTAQTEAELCAS RGIGYFRLTVLDHCFSDPES IDAFIAFVRT
LPENTffLHFH240
WQAGVGRA匪YLIFYDFLRN PDVPEKDIVYRHFNQGGNFM YYQ⑶KPNEE
EYKIPLAKEK300
AEMIPLVRQYIQEQQPKGFK LS WTQffKARR R331
<210>2
<211>310
<212>PRT
<213> 牛、山羊(bowt、goat)
<400>2
HYTYLRAAEERETVTAAQRE EYAAFVffRFERRDREALPDN FRICRNEFRQ
RSAVSGYDPE60
FVPSRKGLDELKVSASSDFS AGELDAAIAEIRKYHDGPIT VVDLRKETHG0108]LLNGNHVSRY
0109]GKQNWDNISL SREEIIASEK EIIHGTVGTQ VETGSTRPGG RTSTMDVTTA
0110]QTEAELCASR
0111]GIGYFRLTVL DHCFSDPESI DAFIAFVRTL PENTffLHFHW QAGVGRANMY
0112]LIFYDFLRNP
0113]DVPEKDIVYR HFNQGGNFMY YQ⑶KPNEEE YKIPLAKEKA EMIPLVRQYI
0114]QEQQPKGFKL
0115]SffTQffKARRR
0116]<210>3
0117]<211>21
0118]<212>PRT
0119]<213> 牛、山羊(bowt、goat)
0120]<400>3
0121]MKKSLALLFA LALLLSSCSH Q
0122]<210>4
0123]<211>996
0124]<212>DNA
0125]<213> 牛、山羊(bowt、goat)
0126]<400>4
0127]atgaaaaaga
0128]cagcactaca
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0140]ccggacgttc
0141]tactaccagg
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0145]<211>955
0146]<212>DNA
120
180
240
300 310
21
gtcttgccttgctgttcgcgCtggCgttgCtgctctcctcctgcagccac60cctacctccgggcggccgaagagcgggaaaccgtgacggccgcgcagcgg120ccgccttcgtctggcgcttcgagcgccgcgaccgggaagccctgcccgac180tctgccggaacgagttcaggcagcggagcgCCgtgCCgggctacgacccg240cctcccgcaagggcctggatgagctgaaggtcagcgcgagctcggacttc300agctggacgccgcgatcgcg aataccatgacggcccgatc360acctgcggaaagagacccacggcctgctgaacggcaaccacgtgtcccgc420agaactgggacaacatcggcctgagccgggaagagattatcgcatccgaa480tccacggcacggtgggaacgcaggtggagacgggaagcacCCgCCCCggC540gcacgatggacgtgacgacggcccagacggaagccgaactctgcgcgagc600gctatttccgcctgacggtcctcgaccactgcttctccgatcccgaaagc660tcatcgccttcgtgcggacgctcccggagaacacctggctgcacttccat720gcatgggccgcacgaacatgtacctgatcttctacgacttcctgcgcaac780cggaaaaggatatcgtgtaccgccacttcaaccagggcggcaacttcatg840gcgacaagcccaacgaggaggagtacaagatccccctcgccaaggagaaa900tcccgctggtccgccagtacatccaggagcagcagcccaagggcttcaag960cgcagtggaaggcccgccggcgctaa9960147]〈213〉牛、山羊(bowt、goat)0148]〈400>50149]cactacacctacctccgggcggccgaagag0150]gaatacgccgccttcgtctggcgcttcgag0151]ttccggatctgccggaacgagttcaggcag0152]ttcgtgccctcccgcaagggcctggatgag0153]gccggggagctggacgccgcgatcgcggaa0154]gtcgtggacctgcggaaagagacccacggc0155]ggcaagcagaactgggacaacatcggcctg0156]gaaatcatccacggcacggtgggaacgcag0157]cgcaccagcacgatggacgtgacgacggcc0158]ggcatcggctatttccgcctgacggtcctc0159]gacgcgttcatcgccttcgtgcggacgctc0160]caggcgggcatgggccgcacgaacatgtac0161]gacgttccggaaaaggatatcgtgtaccgc0162]taccagggcgacaagcccaacgaggaggag0163]gaaatgatcccgctggtccgccagtacatc0164]agctggacgcagtggaaggcCCgCCggCgC0165]<210>60166]<211>630167]<212>DNA0168]〈213〉牛、山羊(bowt、goat)0169]〈400>50170]atgaaaaaga gtcttgccttgctgttcgcg0171]cag
cgggaaaccgtgacggccgcgcagcgggaa60cgccgcgaccgggaagccctgcccgacaat120cggagcgccgtgccgggctacgacccggaa180ctgaaggtcagcgcgagctcggacttcagc240atccgaaaataccatgacggcccgatcacg300ctgctgaacggcaaccacgtgtcccgctac360agccgggaagagattatcgcatccgaaaag420gtggagacgggaagcacccgccccggcgga480cagacggaagccgaactctgcgcgagccgc540gaccactgcttctccgatcccgaaagcatc600ccggagaacacctggctgcacttccattgc660ctgatcttctacgacttcctgcgcaacccg720cacttcaaccagggcggcaacttcatgtac780tacaagatccccctcgccaaggagaaagcc840caggagcagcagcccaagggcttcaagctc900taa933ctggcgttgctgctctcctcctgcagccac60
1权利要求
一种来源于瘤胃的中性植酸酶CP53，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的中性植酸酶CP53，其特征在于，序列SEQID NO. 1在N端包含 信号肽，所述信号肽的序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.一种中性植酸酶基因cp53，其特征在于，编码权利要求1所述的中性植酸酶CP53。
4.如权利要求3所述的中性植酸酶基因cp53，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
5.如权利要求3所述的中性植酸酶基因cp53，其特征在于，所述中性植酸酶基因cp53 包括信号肽序列，所述序列如SEQ ID NO. 6所示。
6.包含权利要求3所述中性植酸酶基因cp53的重组载体。
7.包含权利要求3所述中性植酸酶基因cp53的重组载体pET22b-cp53。
8.包含权利要求3所述中性植酸酶基因cp53的重组菌株，其保藏编号为 CGMCCNo. 3493。
9.一种制备中性植酸酶CP53，其特征在于，包括以下步骤1)用权利要求6的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组植酸酶表达；3)回收并纯化所表达的中性植酸酶CP53。
10.权利要求1所述中性植酸酶CP53的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种来源于瘤胃的中性植酸酶CP53及其基因和应用。本发明提供了一种来源于瘤胃宏基因组DNA的植酸酶CP53，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述植酸酶的基因组编码基因cp53。本发明的植酸酶具有以下性质最适pH 6.5，最适温度50℃，在pH 2.5-8.5之间有较好的稳定性，在中性pH条件下具有高的催化活性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于反刍动物和水产饲料工业等。
文档编号C12N9/16GK101914507SQ20091024237
公开日2010年12月15日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者史秀云, 姚斌, 孟昆, 杨培龙, 柏映国, 王亚茹, 石鹏君, 罗会颖, 袁铁铮, 黄火清 申请人:中国农业科学院饲料研究所