专利名称：：具有抗微生物活性的RumC肽的制作方法具有抗孩￡生物活性的RumC肽本发明涉及具有抗孩史生物活性的肽RumCl、RumC2和RumC3，以及还涉及编码这些肽并分离自活泼瘤胃球菌El(iM顧7wcoccMSg"avMEl)的基因。某些菌株具有释放对其竟争剂有抑菌或杀菌作用的物质的能力。这些抗樣i生物物质可以具有有4几物性质，例如，有^/l酸或过氧化氢(Ross等，Int.J.FoodMicrobiol.79,3-16,2002),或具有肽性质。酶促合成的抗微生物肽——其形成抗生素类(Mootz等，Curr.Opin.Chem.Biol.1,543-551,1997;Keating等，Curr.Opin.Chem.Biol.3，598-606,1999),以及核糖体产生的肽——其形成细菌素类(Jacob等，Ann.Inst.Pasteur(巴黎)84,222-224,1953)也是著名的。细菌素在研究和工业领域正在引起越来越多的兴趣；它们可对抗生素应用提供可选的方案，特别是饲养方面(Luchansky,AntonieVanLeeuwenhoek76,335，1999;O'Sullivan等，Biochimie84，593-604,2002)。近年来，已经开发出这些细菌素的很多异源表达系统。具体而言，Morriset等(Morisset等，Appl.Environ.Microbiol"70,4672-4680,2004)已经在肠膜样明串J朱菌亚种DSM20484(丄ewcowoWocme^Wero/t/eswZwp.^^ram'cwmDSM20484)中表达了肠膜菌素Y105(mesentricinY105)的变体，肠膜菌素Y105是由肠膜样明串珠菌亚种Y105生产的IIa类细菌素(Leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroidesY105)。同样，Flynn等(Microbiol"148，973-984,2002)完成了ABP-118——最初由唾液乳酸才干菌亚种UCC118(丄acZoZ)acz.〃iwsahV(2n't^swZwp.sfl/Zvahi^UCC118)生产的lib4干菌素--在宿主才直物享L^干菌(Zacto6ac〃/MS;/a"fan/m)、IL酉复享U求菌(Z(3"ococcm6"/ac"s)和虫普才羊芽孑包4干菌(5flc"/wscereMS)中的表达。另夕卜，已经进行了几项测试，以在细菌大肠杆菌(foc/zen'c/n'aco/z')中表达会田菌素(McCormick等，Appl.Environ.Microbiol,,64,4757-4766,1998;Garneau等，Appl.Environ.Microbiol"69，1352-1358,2003;Biet等，Microbiol"144,2845-2854，1998;Miller等，Appl.Environ.Microbiol"64,14-20，1998;Richard等，J.Bacteriol"186,4276-4284,2004;Kloche等，Appl.Microbiol.Biotechnol.,67:532-538，2005)，在酉良酒西孝母菌(Saccharomycescerevisiae)中表达纟田菌素(Schoeman等，Yeast,15，647-656,1999;VanReenen等，Int.J.FoodMicrobiol.,81,29-40,2003),以及在乳酸菌中表达细菌素(Rodriguez等，Int.J.FoodMicrobiol"80,101-116,2003)。因此已经进行了很多研究，目的是鉴定新细菌素以及如何生产这些细菌素。消化生态系统由丰富且非常复杂的结合有细菌、酵母和古细菌(爿rc/^M)的^:生物系统组成。这种小型生物群本质上是厌氧的，并且主要发现的是类杆菌属(Bacteroides)、真细菌属(五wZ^"en'ww)、才炎菌属(C7c^nWwm)、瘤胃f求菌属(Ww/mVzococc^)、双4支诊干菌属(5zy(ioZ)a"en'M附)和冲炎形冲干菌属(FtwoZa"en'"w)等属的纟田菌(Suau等，Appl.Environ.Microbiol.65，4799-4807,1999)。微生物系统对宿主的健康具有重要的影响。其尤其参与源自食物的代谢化合物的毒化(toxification)和解毒(HughesandRowlandMicrobialEcologyHealthDisease2，179-185,2000)。其也能够调节肠细胞(enterocytic)功能的表达(Bry等,Science273，1380-1383,1996;Hooper等,Science291,881-884，2001)。最后，其在保护宿主免受潜在致病性外源细菌侵袭上起着基本的作用(Ducluzeau等,MicrobialEcologyandIntestinalInfections,1988;Fons等，MicrobialEcologyinHealthandDisease2,240-246,2000)。产气荚月莫才炎菌(C/oWnWwwper/r/wge/w)属于已知的肠病原体，其是一种严格的厌氧型革兰氏阳性细菌，其能够形成孢子并且其非常广泛地分布于环境中。这种病原体可以源自食物，但也可以以低浓度存在于肠内，并且在应激效应下开始增殖并分泌毒素。针对它们所产生的毒素的功能，产气荚膜梭菌的菌株被分成五种毒素型(toxmotype)(Petit等，TrendsMicrobiol.7,104-110,1999)。A型产气荚膜梭菌菌林对人的胃肠道疾病负责。1997年，超过245000个感染产气荚膜梭菌的病例在美国被记载。这导致41.人住院治疗，其中7人死亡(Mead等，Emerg.Infect.Dis.5,607-625，1999)。A型和C型的产气荚膜梭菌菌林可能分别是猪和家禽的坏死性肠炎的起因。在家禽中，坏死性肠炎是一种迅速发展的急性病理，其死亡率可达1%至2%/天。除了其在健康动物上的发病率之外，这种病理因此可具有值得重视的经济影响。一直到1999，通过使用抗生素作为生长因子，这种疾病才得到令人满意的控制。然而，为避免选择抗性细菌以及因此避免降低抗生素在人中的功效，欧盟已经禁止它们用于动物飼料。因为这种禁止，由产气荚膜梭菌在猪和家禽中引起的坏死性肠炎在欧洲不再受到4空制。在RiseauNationald，ObservationsEpid6miologiquesenAviculture(RNOEA)(AFSSAPloufragan)宣一尔的病例数量在1999和2000年显著增加(Valancony，BulletindesGTV12，9-12，2001)。目前，寻找可选的解决方案用以控制和治疗这种疾病因此非常重要。活泼瘤胃球菌是严格厌氧菌，其在梭菌目中属于毛螺菌(丄ac/"腐p/raceae)家族。Dabard等(Appl.Environ.Microbiol,,67,4111-4118,2001)显示，分离自人的显性菌群的菌株活泼瘤胃球菌El能够产生被称为瘤胃球菌素A(ruminococcinA)或RumA的抗微生物物质，其积聚在培养上清液中。其是属于硫醚抗生素家族的细菌素，对各种致病性梭菌种(Clostridiumsp.)的各种菌林均有活性。Gomez等(J.Bacteriol.,184,18-28,2002)已经显示，参与瘤胃球菌素A生物合成的基因的表达在胰岛素存在下被诱导。该作者还显示，某些消化酶可能抑制RumA生产的诱导。本发明人因此开始关注其它细菌素。本发明涉及对产气荚膜梭菌(C/oWnWi/m;er/n'wge船)具有抗菌活性的肽RumC1、RumC2和RumC3,以及还涉及编码这些肽的基因。序列描述SEOIDNo.1:活泼瘤胃球菌E1的RumC肽的保守肽序列SEOIDNo.2:通过埃德曼降解方法实验测定的活泼瘤胃球菌E1的RumC肽的肽序列SEQIDNo.3:通过埃德曼降解方法实验、测定的活泼瘤胃3求菌El的RumC肽的肽序列SEOIDNo.4:推导自SEQIDNo.7的活泼瘤胃5求菌El的肽RumCl的肽序列SEQIDNo.5:推导自SEQIDNo.8的活泼瘤胃球菌El的肽RumC2的肽序列SEOIDNo.6:推导自SEQIDNo.9的活泼瘤胃球菌El的肽RumC3的肽序列SEOIDNo.7:活泼瘤胃球菌El的mmCl基因的核苷酸序列SEOIDNo.8:活泼瘤胃球菌El的mmC2基因的核苷酸序列SEOIDNo.9:活泼瘤胃球菌E1的mmC3基因的核苷酸序列SEOIDNo.10、11和12:实-验测定的肽序列发明的描述本发明涉及具有抗微生物活性的肽，其特征在于其包括选自下述肽的肽序列SEQIDNo.1的肽；包含与SEQIDNo.1的多肽具有至少80%同一性的肽；序列SEQIDNo.2的肽；以及包含与SEQIDNo.2的多肽具有至少80%同一性的肽。根据本发明的一个实施方式，这种肽也包括肽序列SEQIDNo.3。根据本发明的另一实施方式，这种肽包括的肽选自肽序列SEQIDNo.4、5或6。本发明也涉及编码抗微生物活性的多核苷酸，其特征在于其包括选自下述的多核苷酸按照序列SEQIDNo.7、8或9中任一种的多核苷酸；与按照序列SEQIDNo.7、8或9中任一种的多核苷酸杂交的多核苷酸；编码如上定义的多肽的多核苷酸。本发明也涉及表达盒，其特征在于其在转录方向包括启动子，其在宿主生物中起作用；如上定义的多核苷酸；和在同一宿主生物中的终止序列。本发明还涉及载体，其包含如上定义的多核苷酸和/或如上定义的表达谷jsa>。本发明也涉及宿主生物，其用如上定义的多核苷酸、如上定义的表达盒和/或如上定义的载体转化。本发明涉及活泼瘤胃球菌的菌抹，其于2006年12月19日以编号CNCM1-3705保藏在CNCM(法国巴斯德研究所国家微生物菌种中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes，InstitutPasteur),25rueduDocteurRoux,F-75015Paris)，以及还涉及遗传未修饰的分离形式的菌株，所述菌株产生上述如上所述的肽。本发明涉及蛋白质混合物或发酵添加剂(fermentationmust),其可以通过上面定义的宿主生物或菌抹获得。本发明也涉及组合物，其包括如上定义的肽、如上定义的宿主生物、如上定义的菌株、如上定义的宿主生物的发酵添加剂或者如上定义的菌抹的发酵添加剂。根据本发明的一个实施方式，组合物是液体形式或粉末形式。本发明也涉及营养添加剂，其包括如上定义的肽、如上定义的宿主生物、如上定义的菌抹、如上定义的宿主生物的发酵添加剂或者如上定义的发酵添加剂。根据本发明的一个实施方式，营养添加剂是液体形式或粉末形式。本发明也涉及动物饲料，其特征在于其包括用于动物的营养基和如上定义的营养添力口剂。本发明也涉及如上定义的肽、如上定义的宿主生物、如上定义的菌抹、如上定义的宿主生物的发酵添加剂或者如上定义的菌抹的发酵添加剂用于制造药物、营养添加剂或动物饲料的应用。根据本发明的一个实施方式，这种药物或这种营养添加剂意图用于预防或治疗家禽或猪中的坏死性肠炎。根据本发明的另一实施方式，这种药物或这种营养添加剂意图用于预防或治疗人的胃肠疾病。最后，本发明也涉及如上定义的肽用于治疗动物的非治疗应用。根据本发明的一个实施方式，所述肽得自所述动物的内源菌抹或得自所述动物的外源菌林。根据本发明的另一实施方式，所述肽得自所述动物的内源菌株，并且借助所述内源菌抹的肽的生产被促进。根据本发明的又一实施方式，所述肽得自所述动物的内源菌抹，并且，所述内源菌林的生长被促进。丛本发明因此涉及具有抗微生物活性的肽。优选地，这些肽分离自活泼瘤胃球菌，例如分离自活泼瘤胃球菌的突变株。作为指导，这些肽可以分离自2006年12月19日以编号CNCM1-3705保藏在CNCM(法国巴斯德研究所国家微生物菌种中心，25rueduDocteurRoux，F-75015Paris)的活泼瘤胃球菌的菌4朱，即菌抹LEM9-17。术语"抗微生物活性"意指抑制靶细菌生长或发育的能力或者杀死靶细菌的能力。测量抗微生物活性的技术是本领域技术人员已知的。在本发明中，通过在琼脂培养基上培养的菌株产气荚膜梭菌CpA的活性试验，展示抗微生物活性。将含有本发明的肽之一的样品置于在琼脂培养基中形成的孔中。当抑制孔环(inhibitionhalo)在孔周围形成时，显示出抗微生物活性。活泼瘤胃球菌El的肽RumCl、RumC2和RumC3的肽序列分别以序列SEQIDNo.4、SEQIDNo.5和SEQIDNo.6表示。这些序列分别推导自分别由序列SEQIDNo.7、SEQIDNo.8和SEQIDNo.9表示的基因rw附C、n/mC7和nwiC3的核苦@饼列。本发明也涉及具有抗微生物活性的活泼瘤胃球菌El的这些肽RumCl、RumC2和RumC3的片段。术语"肽片段"表示包含从中衍生的肽的一部分而非全部。本发明因此涉及序列SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的肽。这些片段保留了它们的抗微生物活性。本发明涉及生物活性片段。术语"生物活性片段"表示保留了其从中衍生的多肽功能的多肽片段。本发明也涉及具有抗微生物活性的肽，其具有至少80%、90%、95%、980/。以及优选至少99%的氨基酸与序列SEQIDNo.1、2或3的任一种肽相同。制备序歹'JSEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3的肽的方法是本领域技术人员已知的。RumC肽通过细菌分泌(或释放)到胞外环境中。可能的是，任一种序列SEQIDNo.4、5和/或6的肽包含特定数目氨基酸的信号肽。在这种情况中，本发明也涉及信号肽切割之后得到的成熟肽。根据本发明的一个实施方式，本发明涉及其序列在序列SEQIDNo.4、5和6的20位与63位之间的肽。在另一实施方式中，肽SEQIDNo.4、5或6的潜在信号肽可以用异源信号肽置换，以通过异源宿主生物执行该肽的表达和分泌。的肽具有至少80%的同一性。根据本发明的一个实施方式，这种肽分离自活泼瘤胃球菌的菌抹。根据本发明的另一实施方式，这种肽分离自瘤胃球菌属的其它菌抹或者分离自其它细菌。可选地，这种肽可以通过化学合成获得。本发明的一个主题是具有至少90%、95%、95%以及优选至少99%的氨基酸与序列SEQIDNo.4、5或6的4壬一种肽相同的肽。术语"相同的氨基酸"是指在两个序列之间不变或没有变化的氨基酸。这些肽相对于由序列SEQIDNo.4、5或6表示的肽可以具有至少一个氨基酸的缺失、添加或取代。在转录之后修饰的氨基酸，例如通过脱水、一硫化物桥(monosulfidebridges)、羊毛硫氨酸形成等修饰的氨基酸，被认为是在两个序列之间未改变的氨基酸。本发明的主题还是与序列SEQIDNo.4、5或6的任一种肽具有至少80%、90%、95%、98%以及优选至少99%相似性的肽。术语"相似性"是指蛋白质或核酸序列之间的相似度量度。这些肽相对于由序列SEQIDNo.4、5或6表示的肽可以具有至少一个氨基酸的缺失、添加或取代。由分数来量化的两个序列之间的相似程度基于序列中的同一性和/或保守置换的百分比。用于测量和鉴定多肽之间的同一性程度和相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，通过VectorNTi9.1.0——比对程序AlignX(ClustalW算';去)(InvitrogenINFORMAX,http://www,invitroge.n.corn)或利用工具CLUSTAW(http:〃www.ebi.ae.uk./clustalw/),进4t序歹't匕对。根据本发明的肽可以从它们的自然环境分离或纯化。所述肽可以通过不同的方法制备。这些方法特别是从自然来源诸如自然表达这些肽的细菌进行纟屯化、通过合适的宿主细胞生产重组肽及其随后对其纯化、通过化学合成生产，或者最后这些不同方法的组合。因此,本发明序列SEQIDNo.1至6的肽可以分离自活泼瘤胃球菌菌抹，其于2006年12月19曰以编号CNCM1-3705保藏在CNCM。本发明的肽分离自重组宿主生物，其表达根据本发明的RumC肽或者表达具有抗微生物活性的RumC肽的片段。本发明的主题也是包含根据本发明的肽的融合蛋白、重组蛋白或嵌合蛋白。本发明的肽可以分离自聚藏菌抹活泼瘤胃球菌El的单菌大鼠(monoxenicrat)的盲肠内含物以及分离自活泼瘤胃球菌的突变抹，更具体地，分离自于2006年12月19日以编号CNCM1-3705保藏在CNCM的活泼瘤胃球菌的菌抹。这些肽具有抗微生物活性，通过对产气荚膜梭菌的活性试验展示。质语法能够测定根据本发明的RumC肽的近似分子量。该分子量在4000与4600Da之间，以及更具体地在4100与4500Da之间。根据本发明的一个实施方式，肽适于营养或药物应用，例如用于动物营养。术语"适于营养或药物应用的肽"是指这样的肽，其特征使得其适合于营养或药物。对于营养或药物应用而言基本的特征特别是肽能够耐受的pH。具体而言，人和动物的消化系统的pH是酸性的，因此基本的是肽应当抵抗这种pH。用于营养应用的另一基本特征是温度，在该温度下抗微生物物质是活性的。具体而言，抗微生物物质在药物、营养添加剂或动物祠料中的加工，例如，包括处理和室温以上的温度。所使用的抗微生物的活性因此在工艺条件下特别是温度条件下必须是稳定的。根据本发明的一个实施方式，根据本发明的肽或肽混合物在中性pH下具有抗孩i生物活性，并且在酸性pH下例如7以下以及优选4.4以下保留其抗微生物活性。才艮据本发明的一个实施方式，才艮据本发明的肽或肽混合物在37。C具有抗微生物活性，并且在低于和高于室温的温度下例如50。C以上保留这种活性。本发明也涉及具有抗微生物活性的肽，其分离自单菌大鼠的盲肠内含物或分离自活泼瘤胃球菌的菌抹，对产气荚膜梭菌菌抹具有活性，具有通过质语法测定的4000与4600Da之间的分子量，并且对于小于或等于7的pH是耐受的。才艮据一个实施方式，肽包括序列SEQIDNo.1和/或序列SEQIDNo.2。根据另一实施方式，其也包括序列SEQIDNo.3的肽。有利地，肽包括选自具有序列SEQIDNo.4、5或6的肽的任一种的肽。本发明还涉及具有抗微生物活性的肽，其可以得自活泼瘤胃球菌的突变抹，例如，于2006年12月19日以编号CNCM1-3705保藏在CNCM的活泼瘤胃球菌的菌抹。根据一个实施方式，所述肽对于产气荚膜梭菌菌抹具有抗微生物活性。根据另一实施方式，其具有4000与4600Da之间的分子量，以及优选地具有4100与4500Da之间的分子量，如通过质语法测定。根据另一实施方式，肽在中性pH下具有抗^i:生物活性，并且在酸性pH下例如7以下以及优选4.4以下保留其抗微生物活性。根据一个实施方式，肽包括序列SEQIDNo.1和/或序列SEQIDNo.2。根据另一实施方式，其也包括序列SEQIDNo.3的序列。可选地，肽包括选自具有序列SEQIDNo.4、5或6的肽的任一种的肽。本发明也涉及分离自单菌大鼠的盲肠内含物、具有抗微生物潜力的肽，其对应于图4A的色i普图，该色谱图在214nm通过反相HPLC获得，该肽对产气荚膜梭菌的各种菌抹具有活性，特别是对毒素型A具有活性。多核苷酸本发明也涉及编码抗^1生物活性的多核苷酸。优选地，这些多核苷酸编码瘤胃球菌属的抗微生物活性。根据本发明，术语"多核苷酸"是指可以属于DNA型或RNA型的单链多核苷酸链或其互补链，或者是可以属于互补或基因组DNA类型的双链核苷酸链。优选地，本发明的多核苷酸属于DNA类型，特别是双链DNA。术语"多核苦酸"还表示修饰的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以从它们的自然环境分离或纯化。本发明的多核苷酸也可以通过化学合成制备，或通过由Sambrook,FristschandManiatis在其名称为"Molecularcloning:alaboratorymanual",edition:ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989的书中描述的标准分子生物学技术制备。本发明涉及根据序列SEQIDNo.7、8或9任一种的多核苷酸。本发明也涉及与根据序列SEQIDNo.7、8或9任一种的多核苷酸杂交的多核苷酸。本发明也涉及编码如上定义的具有抗微生物活性的肽的多核苷酸。本发明也涉及这样的多核苷酸，其与根据序列SEQIDNo.7、8或9任一种的多核苷酸具有至少80%、85%、90%、95%、98%以及优选至少99%的同一性。这种多核苷酸编码抗微生物活性。根据一个实施方式，多核苷酸编码针对产气荚膜梭菌菌抹的抗微生物活性。术语"相同的核苷酸"是指在两个序列之间不变或没有变化的核苷酸。这些多核苷酸相对于参考多核苷酸可以具有至少一个核苷酸的缺失、添加或取代。本发明也涉及与根据序列SEQIDNo.7、8或9任一种的多核苷酸具有至少80%、85%、90%、95%、98%以及优选至少99%相似性的多核苷酸。这种多核苦酸编码抗微生物活性。根据一个实施方式，多核苷酸编码针对产气荚膜梭菌菌抹的抗微生物活性。术语"相似性"是指蛋白质序列或核酸序列之间的相似性量度。这些多核苷酸相对于参考多核苷酸可以具有至少一个核苷酸的缺失、添加或取代。由分数来量化的两个序列之间的相似程度基于序列的同一性和/或保守置换的百分比。用于测量和鉴定核酸序列之间的同一性程度和相似性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，通过VectorNTi9.1.0——比对程序AlignX(ClustalW算'法)(InvitrogenINFORMAX,littp:〃www."witr()卿,com)或矛J用工具CLUSTAW(htt:p:〃www.ebi,ac.uk/clustalw/)，进行序列比对。本发明也涉及能够与根据序列SEQIDNo.7、8或9任一种的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸。优选地，选择性杂交在适度严格条件下进行并且优选在高度严格条件下进行。根据本发明，术语"能够选择性杂交的序列"是指这样的序列，其与参考序列杂交的水平显著高于背景噪声。能够选择性杂交的序列与参考序列之间相互作用产生的信号水平通常比产生背景噪声的其它DNA序列的相互作用的信号强IO倍以及优选强100倍。允许选择性杂交的严格杂交的条件是本领域技术人员已知的。一4殳而言，在特定地pH以及针对特定的离子强度，杂交和洗涤温度在参考序列的Tm之下至少5°C。通常，对于15至50个核苦酸的多核苷酸，杂交温度是至少30。C，而对于大于50个核苷酸的多核苷酸，杂交的温度是至少6CTC。以举例的方式，在下述緩沖液中进行杂交6XSSC、50mMTris-HCI(pH7.5)、1mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA,500呢/ml变性鮭精DNA。进行洗涤，例如，连续在下述条件下进行在2XSSC、0.1。/。SDS缓沖液中在非严格性下，在0.5XSSC、(Uo/。SDS緩沖液中在中等严格性下，以及在0.1XSSC、0.1%SDS緩冲液中在高严格性下。当然，杂交可以按照本领域技术人员已知的其它普通方法进4亍(4争另'J参见Sambrook,FristschandManiatisintheirbookentitled"Molecularcloning:alaboratorymanual",edition:ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSprmgHarbor,NY，1989)。优选地，与参考多核苷酸选择性杂交的多核苷酸保留参考序列的功能。在本情况中，选择性地与根据序列SEQIDNo.7、8或9任一种的多核芬酸杂交的多核苷酸编码抗微生物活性。本发明一般涉及编码根据本发明的肽的多核苷酸。因为遗传密码的简并(degeneracy)，不同的多核芬酸可以编码相同的多肽。这些表达盒在转录方向包括-启动子，其在宿主生物中起作用；-根据本发明的多核苷酸；-在同一宿主生物中起作用的终止序列。任何类型的终止序列可以用于根据本发明的表达盒中。对启动子的选择将特别取决于针对相关基因表达所选择的宿主生物。某些启动子允许组成型表达，而另一方面其它启动子是诱导型的。在真菌的功能启动子中，特别要提到的是来自构巢曲霉菌(Jwwg说Mw'(iM/flra)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子(Roberts等，CurrentGenet.15，177-180，1989)。在细菌的功能启动子中，特别要提到的是来自噬菌体T7的RNA聚合酶的启动子(Studier等，MethodsinEnzymology,185,60-89,1990)。在酵母的功能启动子中，特别要提到的是基因的启动子(Elledge等，Proc.NatlAcad,Sciences,USA.88,1731-1735，1991)或者酿酒酵母U.cerev&fle)的Ga"和AD/Z启动子。所有这些启动子都在文献中描述并且是本领域技术人员熟知的。对于在绳状青霉菌(/^m'c/〃/w,w/wm'CM/www)中的表达，例如将选择包含H4B组蛋白启动子、门冬氨酸蛋白酶启动子或csl13启动子(WO00/68401)的表达盒。对于在酵母巴斯德毕赤酵母(Pic/n'a/7似toni)中的表达，例如将选择包含曱醇-诱导型AOXl启动子(Tschopp等，Biotechnology,5,1305-1308,1987)或GAP强组成型启动子(Waterham等，Gene186,37-44，1997)的表达盒。对于在粟酒裂殖酵母(Sc/n'zc^flcc/2arom少'(e,s';wmZ^)中的表达，例如将选择包含由硫胺素抑制并且在石克胺素不存在时激活的调节启动子(Maundrell,J.Biol.Chem.265,10857-10864,1989)的表达盒。根据本发明的表达盒也可以包括多肽或多核苷酸表达必需的任何其它序列，例如允许由宿主生物产生的多肽分泌的调节元件或信号序列。特别可能的是使用任何调节序列，其使得能够增加被插入表达盒中的编码序列的表达水平。根据本发明，特别可能的是与启动子调节序列相结合而使用其它调节序列，其位于启动子与编码序列诸如转录激活子("增强子")之间。另外，根据本发明的表达盒可以包括由宿主生物产生的多肽分泌必需的任何其它序列，诸如信号序列。对于巴斯德毕赤酵母的分泌，例如使用a因子序列作为分泌信号是可能的。很多种终止序列可以用在根据本发明的表达盒中，这些需要允许转录终止以及mRNA的多腺香酸化。可以使用在已选宿主生物中起作用的任何终止序列。对于在绳状青霉菌中的表达，例如将选择包含H4.B组蛋白终止子、门冬氨酸蛋白酶终止子或csl13终止子(WO00/68401)的表达盒。本发明的主题还是构成根据本发明的表达盒的多核苷酸；有利地，根据本发明的表达盒被插入载体中。载体本发明也涉及用于宿主生物转化的克隆或表达载体，其包含根据本发明的至少一种多核苷酸或表达盒。这种载体特别是可以对应于质粒、粘粒、噬菌体或病毒，根据本发明的多核苷酸或表达盒被插入其中。用于构建这些载体以及将本发明的多核芬酸插入这些载体中的技术是本领域技术人员已知的。一般而言，可以使用任何能够在宿主细胞中维持其自身、自主复制或繁殖以便尤其是诱导多核苷酸或多肽表达的载体。作为待被转化的宿主生物的函数以及作为所使用的转化技术的函数，本领域技术人员将选择合适的载体。本发明的载体被特别用于转化宿主生物，用于复制载体和/或在该宿主生物中表达根据本发明的肽的目的。本发明也涉及用于制备根据本发明的肽的方法，包括下述步骤-用包括根据本发明的表达盒的表达载体和/或根据本发明的多核苷酸来转化宿主生物，-分离通过宿主生物产生的肽。宿主生物达盒或至少一种载体整合到宿主生物中而转化所述宿主生物的方法。多核苷酸可以被整合到宿主生物的基因组中，或者可以在宿主生物中稳定复制。转化宿主生物的方法是本领域技术人员已知的并且在文献中广泛描述。本发明也涉及用根据本发明的多核苷酸、表达盒或载体转化的宿主生物。根据本发明，术语"宿主生物"具体而言是指任何高等或低等的单细胞或多细胞生物体，特别地选自细菌、酵母或真菌。具体而言，术语"宿主生物"是指非人生物体。有利地，酵母例如选自巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母)、耶罗维亚酵母()和许旺酵母(Sc/rvw2wm'omyces1oct^/ewto/h)。真菌例^口选自曲雾属(^s"/erg7'〃MS)、木霉属(7h'c/^cfermfl)和青霉菌(Pem'c/〃/wwM)，优选选4奪绳状青霉菌、里氏木酶(7h'c/wti^7W(3re&ye/)、黑曲霉素(y4s/7er^〃wsm'ger义5色盛曲霉(^s/erg7'〃ws)、白曲霉(J5/erg7.〃i^fc2vrac/n7)禾口康亍木霉(7h'cAo^fermaA:omVzg")。在本发明的一些实施方式中，宿主生物是绳状青霉菌的菌株，其中根据本发明的肽被表达或过量表达。在另一实施方式中，宿主生物是卡氏德巴利酵母("eZ)ara附，rac"We〃a)的菌抹，其中才艮据本发明的肽^皮表达或过量表达。在又一实施方式中，宿主生物是活泼瘤胃球菌的菌株，其中根据本发明的肽被表达或过量表达。白的4支术广泛描述于文献中，特别是由Sambrook,FristschandManiatis在名称为"Molecularcloning:alaboratorymanual",edition:ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989的书中所述，或者由Ausubel等在"CurrentProtocolsinMolecularBiology",edition:GreenePublishingAssociates,Inc.,andJohnWileyandSons,NY，1992的书中所述。囷林活泼瘤胃球菌的新菌4朱于2006年12月19日以编号CNCM1-3705保藏在CNCM(法国巴斯德研究所国家微生物菌种中心，25meduDocteurRoux,F-75015Pans)。根据布达佩斯条约第7条，CNCM是国际保藏单位。新菌抹通过菌株活泼瘤胃球菌L14的随机诱变获得。该菌抹是活泼瘤胃球菌El的自发突变体，其已经失去体外生产RumA的能力但是仍能体内合成RumC。强烷化剂N-曱基-N，-硝基-N-亚硝基胍(NG)被用于诱变。利用另一起源的DNA或RNA，通过重组技术，没有获得遗传修饰。菌抹LEM9-17的培养基优选是补充有酵母提取液和氯化血红素的BHI培养基(BHI-YH)。蛋白质混合物、发酵添加剂法包括下述步骤a)在诱导肽表达的条件下，培养活泼瘤胃球菌的菌抹或根据本发明的转化宿主生物，和b)回收包含所述肽的培养上清液。肽与培养上清液的分离可以通过电荷、大小和/或疏水性质进行。本领域技术人员知晓作为各种培养基组成的电荷、大小和/或疏水性质的函数的各种制备技术。这种培养上清液或发酵添加剂然后可以被浓缩或冻干以配制食品添加剂或动物饲料。该过程可以包括从培养上清液中提纯抗微生物物质的附加步骤。如果宿主生物不分泌抗樣i生物物质到培养上清液中，则细胞溶解和细胞提取的另外步骤可能是必需的。本发明的肽也可以从单菌大鼠的盲肠内含物获得。组合物根据本发明的组合物包括根据本发明的肽、根据本发明的宿主生物、根据本发明的菌抹、根据本发明的宿主生物的发酵添加剂或者根据本发明的菌林的发酵添加剂。所述组合物处于液体形式或者处于粉末形式。这些组合物包括各种成分。液体组合物例如可以包括另一种抗微生物剂，例如山梨酸或山梨酸盐、苯曱酸或苯甲酸盐，或者富马酸或富马酸盐。本发明的组合物也可以包括山梨糖醇。山梨糖醇是稳定剂和配制剂。本发明的组合物也可以包括防冻剂，例如乙二醇、甘油、丙二醇和1,2-丙二醇。粉末形式的组合物包含支持物。这种支持物可以选自小麦面粉、淀粉、糊精、石膏或玉米芯。根据本发明的组合物具有抗微生物活性。它们对抗生素应用提供可选方案。它们可以用于例如动物饲养或用作人的药物。本发明的组合物包含至少一种根据本发明的肽，但是它们也可以包含其它物质，例如维生素、其它活性成分、氨基酸或矿物盐。根据本发明的组合物使得例如预防或治疗猪或家禽中的坏死性肠炎以及预防或治疗人的胃肠疾病成为可能。本发明的组合物例如被添加至动物饲料中或者例如与营养基料相结合。可以被掺入具有抗菌活性的组合物中的粉或颗粒的形式。本发明的主题还是动物饲料，其包含根据本发明的肽、根据本发明的宿主生物或者根据本发明的宿主生物的发酵添加剂/培养上清液。术语"饲料"是指可以用作动物食物的任何物质。术语"营养基(nutritionalbase)"是指组成动物食物定量的基本部分的任何物质，例如，其由谷类、蛋白质和动物和/或植物来源的脂肪的混合物组成。通常，这些营养基包括例如玉米、小麦、豌豆和大豆。这些营养基适应其预期的各种动物种类的需求。所述动物例如可以是家禽(蛋鸡、肉鸡、火鸡和鸭子)或猪(生肥育猪(growingandfinishingpigs)或小猪)。肽的应用本发明也涉及根据本发明的肽、根据本发明的宿主生物、根据本发明的菌抹、根据本发明的宿主生物的发酵添加剂或者根据本发明的菌抹的发酵添加剂在制造药物中的应用。本发明也涉及根据本发明的肽、根据本发明的宿主生物、根据本发明的菌抹、根据本发明的宿主生物的发酵添加剂或者根据本发明的菌抹的发酵添根据本发明的一个实施方式，这种药物或这种营养添加剂意图用于预防或治疗家禽或猪中的坏死性肠炎。根据本发明的另一实施方式，这种药物或这种营养添加剂意图用于预防或治疗人的胃肠疾病。附图简述图:通过在SephadexG-75上可溶性馏分的分子筛选获得的色谱图，所述可溶性馏分含在聚藏菌抹活泼瘤胃球菌E1的单菌大鼠的10g盲肠内含物中；x-轴给出洗脱体积，以mL计；y-轴给出280nm处的吸收；阴影面积对应于对产气荚膜梭菌有活性的馏分(馏分325至358)。图2A:通过在SephadexG-75上标准蛋白质分子筛选获得的谱图；x-轴给出洗脱体积，以mL计；y-轴给出280nm处的吸收；a:白蛋白67kDa;b:卯白蛋白43kDa;c:糜蛋白酶25kDa;d:核糖核酸酶A13.7kDa图2B:得自图2A的色谱图的log校准曲线(MM)=f(Ve);x-轴给出洗脱体积，以mL计；y-轴给出分子量对数轴左侧，给出214nm处的吸收；y-轴右侧给出NaCl浓度，以M计；x-轴给出时间，以分钟计图4A:通过反相HPLC获得的活性CM馏分的色谱图；y-轴，左侧给出给出214nm处的吸收；y-轴右侧给出乙腈洗脱剂的百分比；x-轴给出时间，以分钟计；图4B和4C:从反相HPLC得到的馏分的质语；x-轴给出质量/电荷；y-轴给出信号强度图5:用于从聚藏菌抹活泼瘤胃球菌El的单菌大鼠的盲肠内含物纯化RumC的方案规划图6:在阳离子交换树脂上通过FPLC得到的脱盐馏分SN9-17的色语图；x-轴给出时间，以分钟计；y-轴给出214nm处的吸收a:在214nm的吸光度b:NaCl浓度c:导电率d:流速，以mL/分钟计图7:在RumC纯化过程中各种馏分的质语；x-轴给出质量/电荷；y-轴给出信号强度图7A:SN9-17图7B:活性CM馏分图7C:R10kDa图8:馏分GF47-50的质谱；x-轴给出质量/电荷；y-轴给出信号强度图9:从突变4朱LEM9-17纯化RumC的方案规划实施例材料与方法1.细菌菌抹和培养基菌抹活泼瘤胃球菌El——其产生RumC,分离自健康成人的显性排泄物小型生物群(Dabard等，Appl.Environ.Microbiol.,67,4111-4118,2001)。菌林活泼瘤胃球菌L14是活泼瘤胃球菌El的自发突变体，其已经失去体外生产RumA的能力但是仍能体内合成RumC。于2006年12月19日以编号CNCM1-3705保藏于CNCM的活泼瘤胃球菌菌抹衍生自菌抹L14的随机诱变。其能够在胰岛素补充的琼脂培养基(500(ig/ml，但不在液体培养基中)上体外生产RumC。其是菌株LEM9-17。用作活性试验靶标的菌抹是菌林产气荚膜梭菌CpA(Dabard等，Appl.Environ.Microbiol.,67，4111-4118，2001)。在受控大气压下在"Freter"型室中厌氧培养这四种菌抹(85%N2、10%H2、5%C02)。使它们在37。C在补充由酵母提取液和氯化血红素的BHI培养基(BHI-YH)中温育。液体BHI-YH:37g/LBHI(BrainHeartInfusion,DifcoLaboratories)5g/L酵母才是取液(YeastExtract,Fluka)5mg/L氯化血红素(Hemin,Sigma)琼脂BHI-YH:同前+15g/L琼脂(BACTOagar,DifcoLaboratories)2.利用液体样品的抗孩i生物活性试马全为了由液体样品进行抗微生物活性试验，将104至105个产气荚膜梭菌CpA细胞铺板在琼脂培养基上。室温下30分钟后，利用巴斯德吸管在琼脂中制成直径为6mm的孔。然后，体积为100|iL以下的样品一皮置于孔中，并且培养m在37。C被温育16至24小时。如果样品含有直接对抗产气荚膜4炎菌CpA的抗li生物物质，细菌的生长得到抑制，这导致在孔周围形成"抑制孔环(inhibitionhalo)，，。也可以通过直接将10)iL测试样品放到用产气荚膜梭菌提前接种的琼脂上进行活性测试。3.利用在琼脂培养基中生长的菌落的抗微生物活性测试在补充有或另外具有50|ig/mL胰岛素的琼脂培养基上培养24小时之后，潜在生产抗微生物物质的菌株用含有靶菌抹的"软"琼脂培养基(含有7.5g琼脂/L)覆盖。这种软琼脂通过临时混合5mL表面灌流的琼脂培养基与5mL含有104至105个靶菌抹细胞的液体培养基来制备。然后将培养皿在37。C再温育16至24小时。在产生抗微生物物质的菌落周围观察到抑制孔环。4.从盲肠内含物中取出细胞碎片和食物残留物10g盲肠内含物在30mLPBS(NaCl137mM、KC12.68mM、Na2HP048.1mM、KH2P041.47mM，pH7.4)中稀释，然后在10000xg以及4°C下离心15分钟。移走含有细胞碎片和食物残渣的片状沉淀物。5.离心过滤装置作为离心后其分子量的函数，这些是用于将蛋白质分离成两部分的滤膜器。这些体系也可以被用于浓缩样品或使样品脱盐。几家制造商销售这种类型的产品。在大多数情况下，膜由再生纤维素制成，但是它们也可以由聚醚砜制成。系统的选择成为待被处理的样品体积以及膜的截止阈值(cut-offthreshold)的函数(表1)。这些过滤装置按照制造商提供的关于选择转子类型和离心速度的说明书使用。然而，离心时间作为样品粘度的函数是可变的。表1:在RumC纯化测试过程中使用的过滤装置的特性名称膜类型截止阈值最大体积AmiconUltra-15PL-5*再生纤维素5kDa20mLMicroconYM-10*再生纤维素10kDa0.5mLMicroconYM-3*再生纤维素3kDa0.5mLVivaspin500-5000MWCO**聚醚砜5kDa0.6mLVivaspin500-3000MWCO**聚醚砜3kDa0.6mL*商品名Millipore的产品；**商品名Sartorius的产品6.在SephadexG-75上的分子筛选在G-75柱(2.4x187cm)上进行盲肠内含物上清液的分子筛选。样品(其体积是柱体积的大约2%)被放置在柱上，在4。C在1mL/分钟的流速下利用PBS进行洗脱，并收集600个2-mL馏分。通过读取每种馏分在280nm处的吸收获得色语图。7.在FPLC上的分子筛选在FPLC系统上进行活性CM馏分的分子筛选。将样品装载到HiLoad26/60Superdex30pg柱(GEHealthcare)上。在2.5mLZ分钟的流速下利用PBS进行洗脱。通过测量280nm处的吸收变化，检测所洗脱的蛋白质材料。自动收集对应于2分钟洗脱的馏分。8.在阳离子交换CM柱上的HPLC在装备有Waters616Pump注射器的Waters600SController上进4亍阳离子交换HPLC。将样品(0.5mL)装载到来自TSK的CM-3SWSpherogel半制备柱上。在pH5的20mM乙酸钠緩冲液中在0.8mL/分钟的流速下，利用从0至1M的NaCl浓度梯度进行洗脱。在第一个20分钟期间，在没有NaCl的情况下以无梯度模式进行洗脱，然后利用从0至0.5M的线性NaCl浓度梯度洗脱30分钟。洗脱然后在无梯度条件下继续5分钟，然后在1分钟内进行交换至1M的NaCl浓度，之后在无梯度条件下继续15分钟，最后，回到最初的条件。通过j吏用Waters486TunableAbsorbanceDetector测量280或214nm处的吸收，；险测所洗脱的蛋白质物质。自动收集馏分，然后利用AmiconUltraPL-5系统脱盐。9.在阳离子交换柱上的FPLC在FPLC系列上进行阳离子交换色i普法。将样品装载到Hi-Prep16/10CMFF柱(GEHealthcare)上。在pH5的20mM乙酸钠緩沖液中，利用从0至0.4M的NaCl浓度梯度进行洗脱。在没有NaCl的情况下以无梯度模式进4亍洗脱50分钟，流速为2mL/分钟。然后在5mL/分钟的流速下，利用从0至0.4M的线性NaCl浓度梯度在40分钟内进行洗脱。通过测量在280nm处的吸收变化，检测所洗脱的蛋白质物质。自动收集1mL馏分，然后在Sep-PakC18柱体上脱盐。10.反相HPLC在AllianceWaters1690SeparationsModule系列上进行反相HPLC。将预先用0.1%三氟乙酸(TFA)酸化的样品(100)装载到Vydac218TP52250x2分析柱上。在恒定流速(0.5mL/分钟)下进行洗脱。在15%乙腈下以无梯度模式洗脱10分钟后，在60分钟内应用15%至30%乙腈的线性梯度。然后在1分钟内进行交换至70%乙腈，并且在无梯度条件下继续洗脱19分钟，之后回到初始条件。通过4吏用Waters996PhotodiodeArrayDetector测量214nm处的吸收变化，检测所洗脱的蛋白质物质。自动收集0.5mL馏分。利用SpeedVacConcentrator(Savant)蒸发掉乙月青。11.质谱法在Timoneproteomicplateau(SchoolofPharmacy,Marseilles,France)进行质谱法分析。在以正线性模式使用的EttanMaldi-TofPro光i普仪(GEHealthcare,Uppsala,瑞典)上利用延迟萃取获得Maldi类型的质谱。样品与511^/1^0;-氰基—4-羟基桂皮酸溶液在Maldi耙上通过干点滴法共结晶。利用20kV的加速电势获得光i普，并且激光功率被设定为最低水平，以便获得优良信号。在外部模式下通过采集已知质量的标准肽混合物获得光谱校准(Pepmix4,Laserbiolabs,Nice,France)。对于某些难于结晶的样品，利用2，5-二羟基苯曱酸的溶液进行共结晶。12.Edman测序该技术基于蛋白质的游离末端胺基团与异硫氰酸苯酯(C6H5NOS)的反应。这种环状化合物在^5威性介质中在蛋白质的第一氨基酸残基上进行亲核攻击。然后肽的苯M^硫曱酰基(phenylthiocarbamyl,PTC)衍生物通过水解作用被切割。获得第一氨基酸的苯胺基-噻唑啉酮(ATZ)和已经失去这种氨基酸的蛋白质。入丁2-#^酸然后被转化为乙内酰^^克脲-(PTH)tt酸。分离连续获得的PTH-氨基S臾，并通过RP-HPLC通过测量280nm处的吸收以及通过比4交洗脱时间进4亍鉴定。反应周期可以重复，并因此产生蛋白质的序列。13.随机诱变在37。C温育24小时的14mL菌抹L14的培养物被分入七个2mL试管中，然后将试管在5800xg下离心10分钟。将细胞沉淀用2mL0.1M柠檬酸盐緩冲液(柠檬酸21mg/mL,NaOH8.8mg/mL,pH5.5)洗涤两次，然后溶解在含有增加浓度的N-曱基-N，-硝基-N-亚硝基胍(NG)——有效地诱变剂——的拧檬酸盐緩沖液中。表2:在Sep-Pak上脱盐期间使用的溶液的体积<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>然后将试管在37。C上温育30分钟，之后在5800xg离心10分钟。片状沉淀物用0.1M磷酸盐緩冲液(KH2P0413.6mg/mL，NaOH2,32mg/mL,pH7)洗涤，然后溶解在液体BHI-YH培养基中。14.在Sep-PakCI8柱体(Waters)上脱盐根据才莫型，这些柱处于所述相^皮倾倒入注射器中的形式，或者这些柱处于固定至注射器末端的微型柱的形式。緩沖液的流量通过蠕动泵得以保障。在第一阶段，通过使H20经过，然后使CH3CN以及最后使含有0.05%TFA的H20经过，平衡柱。然后施加预先用0.05%TFA酸化的样品。通过连续加入H20-0.05%TFA、40%CH3CN-0.05%TFA和CH3CN-0.05%TFA,以三步进行洗脱。因此收集三种镏分:对应于未被柱保留的蛋白质的馏分以及对应于盐的馏分(馏分NR)、含有用40%CH3CN稀释的蛋白质的馏分(40%CAN馏分)以及含有用100%CH3CN稀释的蛋白质的馏分U00。/。CAN馏分)。取决于体积，利用SpeedVacConcentrator或旋转蒸发器蒸发4皁i容剂。表3显示使得自RumC纯化的馏分脱盐所使用的每种溶液的体积(cf.结果和讨i仑)。这些体积取决于Sep-Pak的相体积。表3:作为施加的函数在Sep-Pak期间所使用的溶液体积<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>15.温度耐受性测试加热含有RumC的等分部分的馏分，每种达到不同的温度，用导热釜(heatingblock)进行5或15分钟，然后在4。C保藏。然后使它们经历抗微生物活性试验。16.pH耐受性测《式将含有RumC的等分部分的馏分在期望的緩冲液大约稀释十倍。室温下IO分钟后，将每种溶液置于Vivaspin5003kDa过滤装置上，然后按照制造商的指令离心。将緩冲液添加至由Vivaspin500保留的馏分中，然后再离心过滤装置。由Vivaspin5003kDa保留的每种馏分-即含有RumC-的体积用緩冲液调节，以便对应于起始体积。然后在进行抗微生物活性试验之前将各种馏分保藏在4。C下。Vivaspin5003kDa滤器不耐受大于9的pH。因此仅测试酸性或中性pH的缓冲液。成分如下t)H2緩冲液:50rnMKC1-13mMHClpH4.4緩冲液:0.2MpH4.4乙酸钠緩沖液pH7li沖液:50mMKH2P04-39mMNaOH结果和讨论1.来自盲肠内含物的RumC的纯化尽管菌株活泼瘤胃球菌El是可培养的，但是在测试的培养条件下RumC不能体外生产。为纯化RumC，因此必需利用来自聚藏菌株E1的单菌大鼠的盲肠内含物来操作，或者产生能够体外生产RumC的活泼瘤胃球菌的突变抹(见第2节)。1.1.来自单菌大鼠的盲肠内含物的稀释第一步由在PBS中稀释盲肠内含物组成。1.2.细胞碎片的移除在第二步纯化期间，细菌、细胞碎片和食物残渣通过离心盲肠内含物而被移走。1.3.浓缩然后在Amicon⑧Ultra-15PL-5系统上浓缩溶液，之后应用于分子筛选柱。1.4.抗微生物活性试验在菌株产气荚膜梭菌CpA上测试所得到的所有馏分，这证实抗-产气荚膜梭菌物质在单菌大鼠的盲肠内含物中的存在。利用来自无菌大鼠(无微生物)的盲肠内含物进行阴性对照。未4企测到抗-产气荚膜梭菌活性。在单菌大鼠的盲肠内含物中存在的抗-产气荚膜梭菌物质的确是活泼瘤胃球菌El特定的。之后，每一纯化试验之后进行抗-产气荚膜梭菌活性试验。在第一阶段，仅研究活性的存在或缺乏，注意要确保阴性结果与技术的灵敏度阈值(sensitivitythreshold)无关。当明确的方案被确定时，在第二阶段进行定量试验。1.5.在G-75柱上的分子筛选在SephadexG-75柱(2.4x187cm)上进行分子筛分。通过读取所收集的600个2-mL馏分中每一种在280nm处的吸收，监测洗脱。在利用MicroconYM-3预先浓缩的馏分上进行抗孩i生物活性试验。馏分325至358证实对产气荚膜梭菌具有活性，并且其被汇集以形成新的活性GF馏分(图1的阴影部分)。利用来自无菌大鼠的盲肠内含物进行的对照产生的洗脱曲线与利用来自单菌大鼠的盲肠内含物得到的洗脱曲线相当，但是未检测到抗-产气荚膜梭菌活性。1.6.RumC大小的评价为了评价在活性GF馏分中存在的RumC的大小，将已知分子量的标准蛋白质置于同一SephadexG-75柱上，并测量各洗脱体积(图2A)。然后绘制定义物质的分子量对数(log(MM))与其洗脱体积(Ve)之间比例的校准曲线(图2B)。平均洗脱体积是683mL的情况下，抗微生物物质不在选择的标准蛋白质范围内，但是通过外推，其分子量可以近似评价为5200Da。1.7.在阳离子交换树脂上的色谱法利用活性GF馏分，使用HPLC系统，考虑在羧曱基(CM)-Spherogel柱上的阳离子交换色镨。在pH5，通过NaCl浓度梯度进行洗脱，并在214nm监测(图3)。在32分钟与38分钟之间发现活性(活性CM馏分)，其对应于0.2至0.3M的NaCl浓度。该技术使得消除未被保留的馏分中的污染物特别是消除所有的黄色颜料成为可能。通过质谱法进行的活性CM馏分的分析显示其含有大约4200Da的单一肽(结果未显示)。使该馏分经历N-末端测序。最初的11个氨基酸因此被测定AGVIX(N/S)GTXAV(SEQIDNo.10)。该序列未显示与已知蛋白质具有任何强同源性。测序也显示出两个较小的序列。1.8.反相HPLC色谱获得在214nm处的各种吸收峰。在被称为a(或"双峰")和b(或"单峰")的两种馏分中显示出活性(图4A)。通过质语法对这两种馏分进行分析显示存在三种主要的肽，它们各自的分子量在4230与4460Da之间(图4B和4C)。利用所开发的三种色谱法，即，分子筛选、阳离子交换色谱法和反相色谱法，再次进行RumC自盲肠内含物的纯化。得到的洗脱曲线与所展开的第一次测试的那些洗脱曲线相当。RumC纯化方法因此是可再现的，并且因此可以被采用。总结/人盲肠内含物纯化RumC方案示出图5中。1.9.纯化收率和纯化因子按惯例，在溶液中存在的随意活性单位(arbitraryactivityunit,AAU)的数目被定义为最后活性稀释的倒数。因此在得自纯化的每种活性馏分的连续稀释(两倍)上进行抗-产气荚膜梭菌活性测试。通过比较以AAU/mg蛋白质表达的每种馏分的比活性获得纯化因子(purificationfactor)。对各种馏分中蛋白质数量的估计得自其在280nm处的吸收测量，利用的是1.8的质量消光系数EQ1%。表4给出了用于自单菌大鼠盲肠内含物纯化RumC的方案步骤的活性收率和纯化因子。表4:在从10g单菌大鼠盲肠内含物体内制备RumC过程中的活性收率和纯化因子馏分V(mL)抗-CpAA.(AAU)M蛋甴质(mg)SA(AAU/mg)收率F纯化匀浆39780nd100%SN32375375148%i浓缩的SN143502701.345%1.3活性GF662052010.326%]0活性CM1-1.51700.135126022%1200双峰1-1.550nd13%单峰1-1.550ndn.d.=未测定V:馏分的总体积，以mL计抗-CpAA.:抗-产气荚膜^l菌活性，即在馏分中包含的活性单位总数M蛋自质馏分中的蛋白质质量，以mg表达SA:抗-产气荚膜梭菌比活性，以AAU/mg计SA=^t-CpAA./m蛋由质收率纯化的活性收率收率=100x抗-CpAA.测试馏分/抗-CpAA.ij裝F纯化纯化因子F纯化=SA测试泡分/SAsN1.10.肽序列的测定尽管在"双峰"和"单峰"馏分中存在的产物的分子量不同，但是Edman测序使得建立单一主要N-末端序列AGXIXSGSVAV(SEQIDNo.3)成为可能。在所关注的两种馏分中，也显示了较小的17个残基的序列AGPAYXVGYXGNNGAVT(SEQIDNo.2)。2.通过随机诱变产生突变抹所采用的技术是菌株活泼瘤胃球菌L14的随机诱变。该菌抹是活泼瘤胃球菌E1的自发突变体，其已经失去体外生产RumA的能力，但是仍能体内合成RumC。将该菌抹暴露于有效的烷化剂N-曱基-N，-硝基-N-亚硝基胍(NG)。因此，将等分部分的菌4朱L14的同一培养物暴露于增加浓度的NG(0至1000fig/mL)。处理后，稀释各种细胞悬液，然后将其铺板在培养皿上。在培养之后计数菌落使得能够评价在各种悬液中的活细胞浓度。通过与对照浓度(试管l,无NG处理)比较，可以测定每种处理的死亡率。其表明用NG的处理是有效的死亡率在50%至99%之间，并且随浓度增力口。为了发现感兴趣的突变体(多种)，近860个随机选自在各种处理中存活的克隆的菌落在胰岛素补充的琼脂培养基上进行次培养，然后使其经受抗-产气荚膜梭菌活性试验。发现83个克隆是在胰岛素存在下抗-产气荚膜梭菌物质的潜在生产者。在这些当中，选择20个进行更严格的表征。在第一阶段，检查影响克隆的突变，以确保它们没有通过PCR在n/mJ中恢复染色体组成(chromosomalorganization)。然后，在胰岛素存在或不存在下，使该20个已选克隆在琼脂培养基上和在液体培养基中经历抗-产气荚膜梭菌活性试验。在胰岛素补充的琼脂培养基上，在所测试的20个克隆中的7个克隆周围出现抑制孔环。另一方面，在无胰岛素的琼脂培养基上，不存在产生任何抗-产气荚膜梭菌物质的克隆因此胰岛素对于杆菌素的合成总是必需的。甚至在胰岛素存在的情况下，在液体培养基中培养的克隆没有产生抗-产气荚膜梭菌。3.利用突变抹的纯化在七个生产克隆之一——突变体9-17上进行生产和纯化试验。利用可变浓度的细胞和胰岛素，在软琼脂上进行试验。在培养突变体之后，磨碎琼脂然后离心，回收上清液(SN9-17)。然后针对产气荚膜梭菌测试该上清液，其证明是活性的。在该活性上清液上进行通过质谱法的分析(图7A)。3丄利用FPLC系统在阳离子交换树脂上的色语法在进行离子交换色谱法之前，样品需要脱盐。第一试验显示，SN9-17在Amicon上的脱盐是不足的。因此，应当考虑样品在Sep-Pak上脱盐，作为初步纯化步骤。用40。/。乙腈溶液进行蛋白质从Sep-Pak的洗脱。在旋转蒸发器上蒸发掉乙腈之后，通过在20mM,pH5乙酸钠缓冲液中稀释溶液，使其在pH5平衡。从65mLSN9-17中获得50mL在pH5平衡的SN9-17,并将其装载到羧曱基-Sepharose阳离子交换柱上。将0至0.4MNaCl的浓度梯度运行40分钟。在用0.2至0.3MNaCl洗脱的馏分中检测抗-产气荚膜梭菌活性，尽管当参比在280nm处的吸收变化时非常少的蛋白质物质存在于这些馏分中(图6)。在RumC从盲肠内含物纯化过程中已经观察到这种现象。汇集活性馏分然后脱盐并在Sep-Pak上浓缩。通过质谱法分析该馏分("活性CM馏分")证实通过阳离子交换色语法^是供的纯化增加显著，并且显示污染物都具有小于2500Da的分子量(图7B)。3.2.CM馏分的分子筛选通过FPLC系统在柱上进行活性CM馏分的分子筛选，这使得分离出具有10kDa以下分子量的肽。通过读取280nm处吸收的变化监测洗脱；蛋白质物质的量小，而且分离证实不令人满意(未显示)。虽然如此，在收集的馏分中测试了抗-产气荚膜梭菌活性。在筛选之后仅发现5%的已装载活性。因此，对于纯化而言，不采用这种技术。另一方面，活性馏分("GF47-50")通过质语法分析并且证实其事实上是纯的，其中肽为4235Da(图8)。3.3.CM馏分的过滤利用过滤装置，进行了从活性CM馏分去除污染物的另一种尝试。因为RumC被5kDa滤器保留(尽管具有稍微较低的分子量)，因此利用Vivaspin500过滤装置——其截止阈值是5kDa——进行了第一次试验。遗憾的是，杂种还是被滤器保留，尽管它们的分子量小于2.5kDa。具体而言，质谱分析没有显示任何纯度增加(结果未显示)。因此利用Microcon过滤装置——其截止阈值是10kDa——尝试了第二次试验。具体而言，尽管其分子量，但是先前观察到RumC可被10kDa滤器保留("10kDaR馏分")。质语法分析证实了先前的结果，并且使得能够显示大部分污染物在未保留的馏分中被去除(图7C)。3.4.在HPLC系统上10kDaR馏分的反相色语法然后含有三个RumC峰的10kDaR馏分(4235D、4324Da和4456Da)经历反相HPLC。流速与梯度条件与从盲肠内含物纯化RumC所开发的那些条件相同，并且得到的结果相当两种不同的镏分一一"双峰"馏分和"单峰"馏分对产气荚膜梭菌有活性。3.5.纯化收率和纯化因子验。然后计算在每种馏分中包含的随意活性单位数(AAU)，并推导活性收率(表5)。在培养上清液脱盐、阳离子交换色谱之后另一次脱盐的步骤过程中观察到活性物质损失重大。损失很可能是发生在阳离子交换色谱过程中，但是这不会使该方案的有效性被质疑。200880017926.4表5:来自突变体9-17的培养上清液的RumC纯化的收率馏分V(mL)抗画CpAA.(AAU)收率SN9-171251453100%活性CM330021%双峰0.42140}19%单峰0.42140V:馏分总体积，以mL计抗-CpAA.(抗-产气荚膜梭菌活性)包含在馏分中的活性单位总数目，以AAU计收率二100x抗-CpAA.测试馏分/抗-CpAA.sN9-n;以％表达评价纯化方案的另一种重要的标准是展示通过每一步骤所提供的纯化增长。纯化因子通过比较每一步骤的比活性(AAU/mg白质)确定，但是为了完成此工作，必须测量每种馏分中含有的蛋白质的质量。由于该方法的灵敏性，通过质语法监测纯化，这使得能够避免"消耗"太多生物材料。尽管该方法不是定量的，但是纯化的增加得到非常清楚地展示。3.6.质谱法通过质语法分析"双峰"和"单峰"馏分。得到的结果与得自使用盲肠内含物的纯化的馏分的那些结果相同"双峰"馏分含有4324Da和4456Da肽，而"单峰"馏分含有4235Da肽。3.7.测序这些馏分因此^皮测序。对于"单峰"馏分，得到的序列与已经测定的序列相同AGXIXSGSVAV(SEQIDNo.3)。较小的序列出现在第五周期AGPAY(SEQIDNo.il)。关于"双^奪"馏分，注意到轻微的差异AGXYXSGSIAV(SEQIDNo.12)。较小序列是相同的AGPAY(SEQIDNo.il)。总结,人突变才朱纯化RumC的方案示于图9中。纯化RumC的生产被极大简化。4.RumC肽的表征4丄对不同菌抹的抗微生物活性测试RumC对不同Gram+和Gram-治病菌一朱的抗微生物活性，在第一阶段利用来自菌抹活泼瘤胃球菌El的单菌大鼠的盲肠内含物的浓缩上清液(SNCCEl)。然后用两种对抗对SNCCEl敏感的菌抹的纯化组分进行其它试验。结果示于表6中。表6:RumC对抗不同致病菌抹的活性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>所测试的所有产气荚膜梭菌菌株对RumC肽都是敏感的。4.2.对产气荚膜梭菌的抗微生物功效通过估计每种纯化RumC馏分的"体内"最小抑制浓度并使其与曱硝唑-所使用的对抗产气荚膜梭菌的参比抗生素——的最小抑制浓度比较，也评价了RumC的抗微生物功效。为进行此工作，制备"双峰"和"单峰"馏分两倍连续稀释(可达1/512稀荚膜梭菌活性试验(结果未显示)。根据该实验，曱硝唑的最小抑制浓度是25)ig/mL。该结果与先前由Dabard等(Dabard等，Appl.Environ.Microbiol"67,4111-4118,2001)获得的结果一致。关于"双峰，，和"单峰"馏分，仅有浓溶液(稀释1)是活性的。尽管并没有精确地知晓这些溶液的浓度，根据Edman测序，其可以被估计为大约40|ig/mL。RumC对产气荚膜梭菌的抗微生物功效因此显示与曱硝唑的相当。4.3.温度耐受性通过在不同的温度下温育相同数量的肽15分钟，进行RumC耐热性的第一初步试验。对于两种"体内"RumC馏分("双峰"和"单峰"馏分)，在75°C下15分钟的处理对活性没有影响。然而，在100。C,肽在15分钟内完全灭活。利用从菌林9-17的培养上清液纯化的RumC样品，完成这些试验。在不同温度下的温育时间是5分钟。在100°C下的温育时间是15分钟。测试的第一温度是80°C。利用活性CM馏分进行第一试验，该活性CM馏分是含有三种肽的预纯化馏分。与"双峰"和"单峰"馏分相反，活性CM馏分耐受100。C下15分钟的处理。然后测试馏分GF47-50。这种仅含有4235Da肽的纯馏分对IO(TC下15分钟的处理是敏感的。其对90。C下5分钟的处理也是每丈感的(表7)。表7:温度耐受性测试的总结表温育条件"体内"RumC"体外，，RumC溫度时间双峰单峰活性CM馏分GF47-5050。C15分钟RR//75。C15分钟RR//80°C5分钟//R/85°C5分钟//R/90°C5分钟//RS<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>R=抗性的；s:敏感的；/=未测试4.4.对pH的抵抗性在pH2、pH4.4和pH7下，还测试了活性CM馏分中存在的肽对pH的抗性。在pH2观察到的活性与pH7时观察的活性相当。在4。C温育24小时之后，在pH2没有观察到活性损失。本发明的肽因此对酸性pH有抗性并且特别适合用在动物养分或药物领域。权利要求1.一种具有抗微生物活性的肽，其特征在于其包括选自下述肽的肽-序列SEQIDNo.1的肽，-肽，其包含与SEQIDNo.1的多肽具有至少80％同一性的肽，-序列SEQIDNo.2的肽，-肽，其包含与SEQIDNo.2的多肽具有至少80％同一性的肽。2.根据权利要求1所述的肽，3.根据权利要求1所述的肽,No.5或SEQIDNo.6的肽的肽。还包括序列SEQIDNo.3的肽。包括选自序歹llSEQIDNo.4、SEQID4.根据前述权利要求任一项所述的肽，其具有通过质语法测定的4000与4600Da之间的分子量。5.根据前述权利要求任一项所述的肽，其分离自活泼瘤胃球菌的突变株。6.根据权利要求5所述的肽，其分离自于2006年12月19日以编号CNCM1-3705保藏在CNCM(法国巴斯德研究所国家微生物菌种中心,红色医生路25号，F-75015巴黎)的活泼瘤胃球菌菌抹。7.—种编码抗微生物活性的多核苦酸，其特征在于包括选自下述的多核芬酸-按照序列SEQIDNo.7、8或9中任一种的多核苷酸，-多核苷酸，其与按照序列SEQIDNo.7、8或9中任一种的所述多核苷酸杂交，-多核苷酸，其编码根据权利要求l-6任一项所述的多肽。8.表达盒，其特征在于其在转录方向包括-启动子，其在宿主生物中起作用，-根据权利要求7所述的多核苷酸，和-在同一宿主生物中的终止子序列。9.载体，其包含根据权利要求7所述的多核苷酸和/或根据权利要求8所述的表达盒。10.宿主生物，其用根据权利要求7所述的多核苷酸、根据权利要求8所述的表达盒和/或根据权利要求9所述的载体转化。11.活泼瘤胃球菌的菌株，其于2006年12月19日以编号CNCM1-3705保藏在CNCM(法国巴斯德研究所国家孩i生物菌种中心，红色医生路25号，F-75015巴黎)。12.蛋白质混合物或发酵添加剂，其能够通过根据权利要求10所述的宿主生物或通过根据权利要求11所述的菌林获得。13.组合物，其包括根据权利要求1至6任一项所述的肽、根据权利要求10所述的宿主生物、根据权利要求11所述的菌抹、根据权利要求IO所述的宿主生物的发酵添加剂或者根据权利要求11所述的菌抹的发酵5恭力口剂。14.根据权利要求13所述的组合物，其是液体形式或粉末形式。15.营养添加剂，其包括根据权利要求1至6任一项所述的肽、根据权利要求10所述的宿主生物、根据权利要求11所述的菌林、根据权利要求10所述的宿主生物的发酵添加剂或者根据权利要求11所述的菌抹的发酵添加剂。16.根据权利要求15所述的营养添加剂，其是液体形式或粉末形式。17.动物伺料，其特征在于其包括用于动物的营养基和根据权利要求15或16所述的营养添加剂。18.根据权利要求1至6任一项所述的肽、根据权利要求10所述的宿主生物、根据权利要求11所述的菌抹、根据权利要求10所述的宿主生物的发酵添加剂或者根据权利要求11所述的菌抹的发酵添加剂用于制造药物、营养添加剂或动物饲料的应用。19.根据权利要求18所述的应用，其用于制造用以预防或治疗猪或家禽中的坏死性肠炎的药物或营养添加剂。20.根据权利要求18所述的应用，其用于制造用以预防或治疗人胃肠疾病的药物或营养添加剂。21.根据权利要求1至6中任一项所述的肽用于治疗动物的非治疗应用。22.根据权利要求21所述的应用，根据所述应用，所述肽得自所述动物的内源菌林或得自所述动物的外源菌抹。23.根据权利要求21所述的应用，动物的内源菌冲朱，以及#^居所述应用，促进。24.根据权利要求21所述的应用，动物的内源菌抹，以及根据所述应用，根据所述应用，所述肽得自所述借助所述内源菌林的肽的生产被根据所述应用，所述肽得自所述所述内源菌株的生长被促进。全文摘要本发明涉及具有抗微生物活性的肽RumC1、RumC2和RumC3，以及还涉及编码这些肽并分离自活泼瘤胃球菌E1的基因。文档编号C07K7/04GK101679984SQ200880017926公开日2010年3月24日申请日期2008年5月16日优先权日2007年5月29日发明者埃马纽埃尔·克罗斯,皮埃尔·安德烈·热阿特,米歇尔·冯斯申请人:安迪苏法国联合股份有限公司