专利名称：：荧光定量pcr溶解曲线在监测tcrcdr3谱系漂移中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及监测TCRCDR3谱系漂移
技术领域：
，特别是涉及用荧光定量PCR溶解曲线来监测TCRCDR3谱系漂移的应用。
背景技术：
：近年来，随着用于特异T细胞研究的四聚体技术、TCR免疫扫描谱型分析技术(ImmunoscopeSpectratyping)、转特异TCR基因小鼠技术等的发展和应用，T细胞的生长、分化、增殖在分子水平上的整体画面逐渐清晰，这使得对临床疾病整体样本中克隆增殖的肿瘤T细胞、特异应答/耐受T细胞的监测成为可能。这些技术中，能从整体水平上去分析特异T细胞的主要方法是TCRCDR3谱系多态性和长度分析技术(TCRCDR3谱系漂移分析技术或称T细胞免疫指纹技术)和ELISpot技术等，其中T细胞TCRe链的CDR3谱型分析技术应用较广，目前已在感染性疾病(HIV、病毒性肝炎、麻疹等)、肿瘤(白血病、大肠癌、黑色素瘤等)、移植(肾和骨髓移植等)、自身免疫病(SLE、类风湿性关节炎等)中研究报道。荧光定量PCR技术因具有特异性、准确性、全封闭反应等优点，已经成为分子生物学、分子免疫学等实验研究中的重要手段，近年来FQ-PCR中的SYBYGreen荧光染料因能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，适用于多种目的产物的检测，其中的FQ-PCR溶解曲线分析法是把PCR产物从一定的温度开始缓慢上升至95。C，扩增产物双链DNA随温度升高逐渐变性解链产生单链，嵌到双链中的荧光染料SYBRGreen释放出来，反应中的荧光信号随之衰减，仪器自动检测反应管内荧光信号的变化，最后绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的溶解曲线，对荧光信号强度变化的负一次导数与温度作图，则得到相应PCR产物的溶解曲线峰图。目前，荧光定量PCR溶解曲线主要应用于监测PCR反应产物的特异性。国内外目前监测TCRCDR3谱系漂移采用的是基因扫描分析技术，即对TCRCDR3谱系进行"PCR"和"PCR产物扫描"分析，对标记的PCR产物进行测序仪的凝胶扫描或毛细管电泳PCR分析，了解TCRCDR3谱系漂移情况，但该方法成本高，操作复杂，因需进行两步的分析，干扰结果的因素也会增加。
发明内容理论上，不同大小、不同基因所得到的PC財广增产物的荧光定量PCR溶解曲线峰型图是不一样的，该PCR溶解曲线与TCRCDR3谱系漂移存在某种关系，本发明所要解决的技术问题就是提供荧光定量PCR溶解曲线在监测TCRCDR3谱系漂移中的应用。为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案荧光定量PCR溶解曲线在监测TCRCDR3谱系漂移中的应用将荧光定量PCR溶解曲线用于监测TCRCDR3谱系漂移。上述荧光定量PCR溶解曲线应用于监测人体的TCRCDR3谱系漂移。前述监测的方法为分析荧光定量PCR溶解曲线，当该曲线出现单峰、寡峰或偏峰时，即存在TCRCDR3谱系漂移。前述荧光定量PCR溶解曲线是这样得到的首先对待测样本加入荧光染料进行PC財广增，扩增产物以0.2。C/秒的速度从75。C增至95。C，每秒读取一次荧光值，100cycle,绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的溶解曲线，对荧光信号强度变化的负一次导数与温度作图，即得待测样本的荧光定量PCR溶解曲线。比如:TCR6链CDR3谱系的溶解曲线分析技术是根据TCR基因重排规则，TRBV基因家族特点，设计26个e链特异性上游引物及l个共同下游引物TRBC，经荧光定量PC財广增后，75°C95。C时每升高0.2度读取一次荧光值(100cycles)得到每个家族溶解曲线图，从图上即可分析TCRCDR3的单/寡/多克隆性增生情况(谱系漂移)。与现有技术相比，本发明将荧光定量PCR溶解曲线应用于TCRCDR3谱系漂移的监测，其中的"PCR"和"CDR3谱型"分析在封闭管中一步完成，因同时能对每个TRBV或TCRAV家族的CDR3PCR产物进行相对定量和克隆增生情况分析，是一种较为简便的适用于临床样本研究的方法，特别适用于临床外周血和组织样本TCRCDR3谱系漂移的监测，经实验证实该方法准确、经济、简便、快速，在肿瘤、感染患者的T细胞应答机制上具有很好的理论和应用价值。图l:正常人-1PBMC中26个TRBV家族CDR3溶解曲线谱型图。TRBV1TRBV24呈不规则的多峰图型，无单峰、寡峰、偏峰及极低水平或缺失现象，对照的TRBC、e-actin、GAPDH呈明显的单峰图型，阴性对照无溶解曲线峰(图中列出TRBV1TRBV2GAPDHControl)。图2:大肠癌患者-1PBMC中26个TRBV家族CDR3溶解曲线谱型图。TRBV1TRBV24图中呈现数量不等的单峰(TRBV17TRVV20)、双峰(TRBV11TRBV13-1)、偏峰(TRBV16)及极低水平或家族缺失(TRBV3TRBV18)现象，对照的TRBC、p-actin、GAPDH呈单峰图型，阴性对照无溶解曲线峰(图中列出TRBV1TRBV20TRBV11TRBV16GAPDHControl)。图3:正常人-1PBMC中32个TRAV家族CDR3溶解曲线谱型图。TRAV1.1TRAV32呈不规则多峰图型，无单峰、寡峰、偏峰及极低水平或缺失现象，对照的GAPDH呈明显的单峰图型，阴性对照无溶解曲线峰(图中列出TRAVl.1TRAV1.2GAPDHControl)。图4:大肠癌患者-1PBMC中32个TRAV家族CDR3溶解曲线谱型图。TRAV1.1TRAV32呈现数量不等的单峰(TRAV4.2、TRAV10)、双峰(TRAV9、TRAV12、TRAV19)、偏峰(TRAV16)、及极低7K平或缺失(TRAV8、TRAVll、TRAV13、TRAV18、TRAV32)现象，对照的GAPDH呈明显的单峰图型，阴性对照无溶解曲线峰(图中列出TRAVl.1TRAV10TRAV9TRAV12GAPDHControl)。具体实施例方式以分析人的TCRa和{3链CDR3谱系漂移为例。实施例l:正常人12例外周血标本的TCRCDR3谱系漂移(同时监测26个TRBV基因家族和34个TRAV基因家族的CDR3谱系漂移情况)1、设计并合成引物设计并合成人TRBV基因家族上游引物26条，共同的TRBC下游引物1条，对照TRBC上游引物一条，对照的GAPDH、e-Actin上、下游引物(见表l)。设计并合成人TRAV基因家族上游引物34条，共同的TRAC下游引物1条，对照的GAPDH上、下游引物(见表2)。表l:TCRe链CDR3谱系26个家族的TRBV引物及对照的TRBC、GAPDH、Actin上下游弓<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>Ul、纯水7ul，总体积20ul;标准曲线选取JEC细胞株的GAPDH表达量为相对量标准；(2)扩增反应条件一94°C3min，1cycles;94°C30sec，55°C30sec，72°C50sec，45cycles;72°C10min1cycles;二溶解曲线分析75°C95°C以O.2"C/秒的速度升温，每秒读取荧光值一次，100cycle,三溶解曲线分析后的PCR产物按步骤①的反应条件，将45cycles改成5cycles进行PCR，PCR产物8ml在l.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，余-2(TC保存备用。4、TRAV家族CDR3区段cDNA的FQ-PC財广增(1)每例样本做36个PCR反应管，第l至34管分别加入TRAVl至TRAV32上游引物ly1(各引物浓度均为10mmol/L，TRAVl和TRAV4分别为两个亚家族)，l-34管每管加入TRAC下游引物lyl，第35管加GAPDH上、下游引物lyl，第36管为无引物的阴性对照管；每个PCR反应管分别加样品lyl、荧光定量MixlOy1、纯水7yl，总体积20yl;标准曲线选取JEC细胞株的GAPDH表达量为相对量标准；(2)反应条件①94。C3min，1cycles;94。C30sec，55。C30sec，72。C50sec，45cycles;72°C10min，lcycles;②溶解曲线分析扩增产物以O.2'C/秒的速度从75'C增至95。C，每秒读取一次荧光值，100cycle,绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的溶解曲线，对荧光信号强度变化的负一次导数与温度作图，即得待测样本的荧光定量PCR溶解曲线;③溶解曲线分析后的PCR产物按步骤①的反应条件，将45cycles改成5cycles进行PCR，PCR产物8yl在l.5%琼脂糖凝胶将进行电泳，余-2(TC保存备用。5、所得荧光定量PCR溶解曲线如图1和图3(正常人-1的PCR溶解曲线图)所示，根据各家族的溶解曲线，详细分析TCRCDR3谱系的漂移根据溶解曲线的峰型来判断，命名为CDR3谱系溶解曲线峰(meltingcurvespectratypingofCDR3):(1)单峰出现显著的单个峰;(2)寡峰出现明显的2条或2条以上异常峰；(3)偏峰在非标准的正态分布家族中，出现较显著的异常峰；(4)多峰，规则的正态分布峰。当出现了单峰、寡峰或偏峰时，即可判断产生了谱系漂移。实施例2:按照实施例1的方法监测大肠癌患者12例的外周血和手术切除的癌周围组织样本的TCRCDR3谱系漂移(同时监测26个TRBV基因家族和34个TRAV基因家族的CDR3谱系漂移情况)。所得荧光定量PCR溶解曲线示例如图2和图4所示(其中一名大肠癌患者的PCR溶解曲线图)。在12例患者中，发现多个TCRCDR3漂移家族，目前共得到单克隆增生家族20多个，并已测序出各特异的TCRCDR3基因序列。实施例3:按照实施例1的方法监测乙型肝炎患者24例的外周血和肝组织样本的TCRCDR3谱系漂移(同时监测26个TRBV基因家族和34个TRAV基因家族的CDR3谱系漂移情况)。在24例患者中，发现多个TCRCDR3漂移家族，目前共得到单克隆增生家族30多个，并已测序出各特异的TCRCDR3基因序列。实施例4:按照实施例1的方法监测淋巴癌患者10例的组织标本和10例的T细胞白细胞患者外周血标本的TCRCDR3谱系漂移(同时监测26个TRBV基因家族和34个TRAV基因家族的CDR3谱系漂移情况)。在10例患者中，发现多个TCRCDR3漂移家族，目前共得到单克隆增生家族IO多个，并已测序出各特异的TCRCDR3基因序列。实施例5:按照实施例1的方法监测流行性出血热患者15例的外周血标本的TCRCDR3谱系漂移(同时监测26个TRBV基因家族和34个TRAV基因家族的CDR3谱系漂移情况)。在15例患者中，发现多个TCRCDR3漂移家族，目前共得到单克隆增生家族30多个，并已测序出各特异的TCRCDR3基因序列。从实施例1至5可以看出正常人PBMC的标本中发现正常人PBMC的26个TRBVCDR3谱型和34个TCRAVCDR3谱型荧光定量PCR溶解曲线分析结果提示，26个TRBV和34个TCRAV家族均呈多克隆增生(多峰)，与前期建立的GeneScan分析方法所得结果相同，而对照管的TRBC、f3-actin、GAPDH为单峰图型，说明各个TRBV家族CDR3中存在多种CDR3产物，提示溶解曲线法适宜分析荧光定量PCR产物的多态性，可用于TCRCDR3的谱型分析。临床肿瘤感染患者的外周血和组织样本26个TRBV和34个TCRAV家族族均存在不同的单克隆(单峰)、寡克隆(双峰/偏峰)、多克隆(多峰)增生及表达，部分家族消失(无峰)c临床患者的单克隆增生家族的TRBV和TRAV均能测序出TCR基因序列，分别翻译成氨基酸序列，模拟出结构，可用于相应疾病的个体化诊断和治疗。权利要求1.荧光定量PCR溶解曲线在监测TCRCDR3谱系漂移中的应用，其特征在于将荧光定量PCR溶解曲线用于监测TCRCDR3谱系漂移。2.按照权利要求l所述的应用，其特征在于将荧光定量PCR溶解曲线用于监测人体的TCRCDR3谱系漂移。3.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述监测的方法为:分析荧光定量PCR溶解曲线，当该曲线出现单峰、寡峰或偏峰时，即存在TCRCDR3谱系漂移。4.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于首先对待测样本加入荧光染料进行PC財广增，扩增产物以O.2"C/秒的速度从75。C增至95。C，每秒读取一次荧光值，100cycle,绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的溶解曲线，对荧光信号强度变化的负一次导数与温度作图，即得待测样本的荧光定量PCR溶解曲线。全文摘要本发明公开了一种荧光定量PCR溶解曲线在监测TCRCDR3谱系漂移中的应用，将荧光定量PCR溶解曲线应用于TCRCDR3谱系漂移的监测，其中的“PCR”和“CDR3谱型”分析在封闭管中一步完成，因同时能对每个TRBV或TCRAV家族的CDR3PCR产物进行相对定量和克隆增生情况分析，是一种较为简便的适用于临床样本研究的方法，特别适用于临床外周血和组织样本TCRCDR3谱系漂移的监测，经实验证实该方法准确、经济、简便、快速，在肿瘤、感染患者的T细胞应答机制上具有很好的理论和应用价值。文档编号C12Q1/68GK101619363SQ20091030246公开日2010年1月6日申请日期2009年5月20日优先权日2009年5月20日发明者姚新生,汤贤英,明覃,锐马申请人:遵义医学院