专利名称：一种能产广谱抗生素的绿僵菌 gyya0601菌株及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种能产广谱抗生素的戴氏绿僵菌菌株 及其应用。
背景技术：
动植物、微生物在生物进化的历史长河中，为适应或抵御外界不良环境，形成了结 构和功能具有多样性特点的代谢产物。微生物代谢产物的多样性与生物活性的多样性是一 般合成化合物不能比拟的，几乎所有药物筛选模型都能从微生物中筛选到生理活性物。自 上世纪青霉素的发现与研制成功以来，人类已经从微生物代谢产物中发现了大量的医用或 农用药物。但已研究检测的微生物却仅占微生物种类的3%左右。此外，在天然药源中，微 生物具有种类多、代谢途径和代谢产物丰富、生产方式和药用方式多、轻道地、易实现工业 化生产等植物药无法媲美的优势，因此，微生物是创新药物的天然宝库和有效途径。抗生素 是微生物来源药物的主要组成部分之一。无论是医用抗生素还是农用抗生素，目前都无法 回避一个问题，即，如何获得高效、广谱、低毒、安全的抗生素。对医用抗生素而言，还有一个 更严重的耐药性问题。长期以来滥用抗生素带来的抗生素耐药性已可能威胁到人类生存发 展。因此，新结构、新靶点、新作用机理、尤其是抗耐药性抗生素类药物的研究是全球医药业 的重大课题。微生物作为创新药物的天然药源宝库，从中发现了数以千计的各种类型的抗 生素，为人类社会的发展的创造了一个又一个奇迹。而今所面临的新问题，除了利用化学修饰、基因工程等技术手段改造传统抗生素 或生产菌外，更重要是从绝大多数未曾发现的微生物资源中寻找新的有益资源，尤其是极 端环境微生物或特殊类型微生物。而虫草(虫生真菌)就是特殊类型微生物中的杰出代表 之一，它与昆虫或其它节肢动物形成寄生或共生关系，是生态圈中物种生态平衡的自然调 节者，或者说对有害昆虫是天然的生物农药。因此，很可能在某些种类的虫草中发掘结构新 颖、作用方式特殊的新型农用或医用抗微生物抗生素。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抑菌能力强、抗菌谱广的新的戴氏绿僵菌 菌株，该绿僵菌能产广谱性抗生素，可以用于制备抗细菌、抗真菌医用或农用抗生素类药 物。本发明新的戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株CGMCC NO. 2880。发明 人在贵州省贵阳市羊艾茶场土壤中采集到一种虫草，利用多途径多批次和次生子囊孢子微 循环产孢方法(参见梁宗琦.中国真菌志(第23卷)虫草属.北京科学出版社，2007.) 分离培养获得二十余株菌株，所采的虫草和分离获得的菌株经鉴定为戴氏虫草Cordyceps taii和戴氏绿僵菌Metarhizium taii。经抗生活性筛选，戴氏绿僵菌GYYA0601菌株抑菌 能力强、抑菌谱广。GYYA0601菌株已于2009年1月16日保藏在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 2880，分类命名为戴氏绿僵菌，拉丁文学名为Metarhizium taii。上述戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株的生物学形态特征描述为在 PDA培养基上，28°C培养12天后，菌丝有隔无色至暗色，平展，菌落中央白色，外围产孢结构 及分生孢子形成明显的8-10条墨绿色环带，分生孢子瓶梗(8. 0-22. 5umX0. 9-1. 8 um)近 柱形，具短尖，单生于气生菌丝或紧密地轮生于分生孢子梗或原瓶梗上，也可通过微循环产 孢直接从次生子囊孢子上产生，分生孢子(3.9-13. liimX2.4-3. 2iim)多串生，柱状，中部 稍缢缩，两端圆或一端稍细，未见双生孢子，由次生子囊孢子微循环产孢形成的分生孢子， 其形状大小基本与无性繁殖的分生孢子相同。本发明还提供了前述戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株用于发酵生产 抗生素的用途。本发明还提供了前述戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株的发酵方法(1)菌种活化将纯菌种接种于斜面菌种培养基上；(2) 一级种子制备挑取菌丝块到种子培养液中，26 28°C、转速150 180r/min
培养3 4天；(3)发酵接种一级种子到发酵培养基中，26 28°C、转速150 180r/min培养 7 9天，得发酵产物。进一步的，上述发酵方法为(1)菌种活化将纯菌种接种于斜面菌种培养基上；(2) 一级种子制备挑取5 10mm2大小的菌丝块到100ml种子培养液中，26 28°C、转速150 180r/min培养3 4天；(3)发酵按发酵培养基总体积3 5%的比例接种一级种子到发酵培养基中， 26 28°C、转速150 180r/min培养7 9天，得发酵产物。前述发酵方法中所述斜面菌种培养基为沙氏培养基。前述发酵方法中所述种子培养液为葡萄糖40g、蛋白胨10g、KH2P04lg、 MgS040. 5g、蒸馏水 1L。前述发酵方法中所述发酵培养基为葡萄糖25g、黄豆粉5g、酵母膏2g、KH2P04lg、 MgS040. 5g、蒸馏水 1L。用前述发酵方法所得的戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株的发酵产 物，该发酵产物富含广谱抗生素物质。本发明的戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株具有如下的微生物学特 性1、形态学特性(1)无性世代(见图4)菌丝有隔无色至暗色，平展。菌落中央白色，外围产孢结 构及分生孢子形成明显的8 10条墨绿色环带。分生孢子瓶梗(8. 0 22. 5iimX0. 9 1.8um)近柱形，具短尖，单生于气生菌丝或紧密地轮生于分生孢子梗或原瓶梗上，也可通 过微循环产孢直接从次生子囊孢子上产生。分生孢子(3. 9 13. 1 ii mXO. 4 3. 2 ii m)多 串生，柱状，中部稍缢缩，两端圆或一端稍细，未见双生孢子。由次生子囊孢子微循环产孢形 成的分生孢子，形状大小基本与前者相同。
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(2)有性世代(见图5)戴氏绿僵菌GYYA0601菌株是戴氏虫草Cordyc印s taii (参见梁宗琦.中国真菌志(第23卷)虫草属.北京科学出版社，2007.)。2、培养性状(1)查氏(Czapek Dox)培养基，28°C培养3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落 直径分别为0. 98cm、1. 70cm、2. 50cm、3. 05cm、3. 80cm、4. 45cm, 13天时的菌落中央部分为黄 绿色，微隆起，周边大部分(4/5面积)为墨绿至草绿色产孢结构及孢子，粒状，环带不明显， 菌落边缘菌丝乳白至淡乳黄，绒状，平展。背面中央近芥黄，边缘乳白色。GYYA0601菌株的 菌落形态见图3(a)。(2)PDA培养基，28 °C培养3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落直径分别为 1. 21cm、2. 15cm、3. 10cm、4. 25cm、5. 35cm、5. 78cm, 13 天时的菌落有 8 10 条鲜明的墨绿色
产孢环带，粒状，最外层环带为淡黄绿至乳黄色，菌落边缘，由里朝外菌丝层绒状、平展，乳 黄至乳白色，最边缘的菌落成白色蜡状平展。背面中央色深，深黄褐至芥黄。GYYA0601菌株 的菌落形态见图3(b)。(3)沙氏(Sabouraud's)培养基，28°C培养3天、5天、7天、9天、11天、13天的菌落 直径分别为 1. 21cm、2. 03cm、3. 13cm、3. 85cm、4. 45cm、5. 25cm, 13 天时的菌落平展，有 5 6 条不同颜色的产孢环带，中央白色，近中央微隆起，米黄至黄绿色，周围是草绿粒状物环带， 然后是土黄、棕黄和黄绿的粒状物环带相间，产孢环带外围乳白至乳黄绒状菌丝层，最外缘 对光看有蜡状晕圈。菌落平板背面芥黄，中央皱缩。GYYA0601菌株的菌落形态见图3(c)。3、生理特性Metarhizium taii GYYA0601 菌株(CGMCC NO. 2880)产孢能力强，培养5-7天后均 能产生大量孢子，且无需特殊培养基。4、代谢特性Metarhizium taii GYYA0601 菌株(CGMCC NO. 2880)能代谢生成具广谱抗生活性
的抗生素。与现有技术相比，本发明是一种新的戴氏绿僵菌菌株，发明人对其广谱抗生活性 进行了一系列检测1、待测定物质戴氏绿僵菌 Metarhizium taii GYYA0601 菌株(CGMCC NO. 2880) 菌丝体的乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮提取部位和菌丝体粗多糖；戴氏绿僵菌Metarhizium taiiGYYA0601菌株发酵浓缩液的乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮提取部位和胞外粗多糖。2、待测定病原细菌包括⑴金黄色葡萄球菌、⑵枯草芽孢杆菌、(3)肺炎克雷伯 氏菌、(4)大肠埃希氏菌、(5)粪肠球菌和(6)铜绿假单胞，病原真菌包括(7)法式念珠菌、 (8)镰刀菌和(9)立枯丝核菌(法式念珠菌是直接在临床上分离到的病原菌株)。3、方法3. 1纯培养菌株发酵产物的分级分离发酵终止后，6层滤纸抽滤，用蒸馏水洗3 次后的菌丝体60°C真空干燥至恒重，再粉碎至60 100目。发酵液减压浓缩到原体积的 1/4 1/8。(1)准确称取各纯培养菌株发酵所得的菌丝体粉50g，然后加入250 500ml 乙醚常温浸提12小时，过滤后的残渣再加入250 500ml乙醚浸提12小时。过滤后合并 滤液，挥发干后获得乙醚提取部分。乙醚提取后的残渣按lg 5 10ml的比例加入氯仿， 60°C恒温水浴萃取2小时，过滤，滤后的残渣再加入5 10倍量的氯仿提取1次，过滤后合
5并滤液，45-60°C减压浓缩，获得氯仿提取部分。氯仿提取后的残渣再依次用乙酸乙酯和丙 酮萃取，条件同氯仿提取条件，获得相应的乙酸乙酯和丙酮部分，丙酮提取后的残渣用蒸馏 水提取，即按lg 5 10ml的比例加入蒸馏水，70°C恒温水浴萃取3小时，过滤后同条件 再提取2次，合并滤液，55 65°C减压浓缩至原体积的1/5 1/10，加入终浓度85%乙醇 醇析，沉淀依次用70%乙醇和乙醚洗涤1次，获得菌丝体粗多糖部分；(2)各纯培养菌株的 发酵浓缩液分别加入分液漏斗后，按1 5 10的体积比加入乙醚常温萃取12小时，其间 剧烈振荡10次左右，分离出有机相部分，然后再加入5 10倍量乙醚，萃取12小时，分离 并合并有机相，挥发干后即为乙醚提取部位，按乙醚的萃取方法依次加入氯仿、乙酸乙酯和 丙酮，获得氯仿、乙酸乙酯和丙酮提取部位。丙酮萃取后的水相部分浓缩至1/3 1/5体积， 加入终浓度85%乙醇醇析，沉淀用依次用70%乙醇和乙醚洗涤1次，获得胞外粗多糖部位。3. 2抗细菌的测定方法采用双层琼脂扩散法(参见陈奇.中药药理研究方法学 (第2版).北京人民卫生出版社，2006.)，分离纯培养菌株发酵液和菌丝体的各萃取部位 的浓度为1. 56 50mg/ml，同时设置阳性对照30 u g/100ml的头孢曲松钠和阴性对照，37°C 培养24小时，十字交叉法测量并记录抑菌圈直径大小。3. 3抗真菌测定方法除法式念珠菌采用双层琼脂扩散法外，其它采用平板稀释 法(参见 Ernst EJ & Rogers PD. Antifungal Agents :Methods and Protocols. USA, New Jersey :Human Press. 2005.)，分离纯培养菌株发酵液和菌丝体的各萃取部位的浓度为 4mg/ml,同时设置阳性对照20 u g/disc广谱抗真菌药尹曲康唑和阴性对照，28°C培养48 72小时，十字交叉法测量并记录菌落直径大小，真菌生长抑制率=(阴性对照菌落直径_待 测物菌落直径大小)/阴性对照菌落直径X 100%。3. 4双层琼脂扩散法用无菌生理盐水洗下已被活化3代的供试病原细菌(金黄 色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、铜绿假单胞)和病 原真菌法式念珠菌斜面，转入三角瓶中，充分振荡摇勻，调节至1. 5 4. 5乂108个/!^浓度 的菌悬液。然后取15mL灭菌后的MH药敏培养基到入9cm无菌培养皿中，凝固后再倒入10mL 混菌培养基。混菌培养基是按照菌悬液与MH药敏培养基体积比25 1的比例配置而成的。各分离纯培养菌株所制备的乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和多糖部位浸膏配制成 1. 56 50mg/mL浓度待用。制备好的双层培养基用无菌打孔器在平板上打孔(6 6mm)，每一平板上打7个 孔，挖去培养基，分别在孔内注入50 yl待测药液。同时设置对照。病原细菌阳性对照用 30ug/100ml头孢曲松钠，病原真菌阳性对照用20 y g/disc广谱抗真菌药尹曲康唑，阴性 对照采用配制药物相应的溶剂，37°C培养24 72小时，十字交叉法测量并记录抑菌圈直径 大小。3. 5平板稀释法病原真菌镰刀菌和立枯丝核菌活化2代后，斜面用0. 05%吐温 80无菌生理盐水洗后，转入经灭菌的带玻璃珠三角瓶中，充分振荡，制成均一的菌悬液。然 后取500 u 1涂布在PDA平板上，26 28°C培养4 7天，然后用无菌打孔器在平板上打孔 (小6mm)，取带病原菌的琼脂块置于待用的混药培养基平板上，26 28°C培养48 72小时 观察菌落生长情况。十字交叉法测量并记录菌落直径大小，真菌生长抑制率=(阴性对照 菌落直径-待测物菌落直径)/阴性对照菌落直径X 100%。4、检测结果
Metarhizium taii GYYA0601 菌株(CGMCC NO. 2880)发酵菌丝体和发酵液的氯仿、 乙酸乙酯、丙酮等萃取部位对本发明测定的病原真菌均有明显的抑制病原真菌生长效应。 而拮抗病原细菌的主要有效部位是胞外乙酸乙酯、胞内氯仿和胞内丙酮萃取部位，胞外氯 仿和胞内乙酸乙酯萃取部位仅对个别种类的病原细菌有一定的拮抗作用。另外，菌丝体和 发酵液的乙醚萃取部位均无明显的抗细菌和抗真菌作用，这不同于焦彦朝和梁宗琦报道的 一株戴氏虫草的菌丝体乙醚萃取部位对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有明显的抗菌活性 (参见焦彦朝，梁宗琦.西南农业学报，1992，5 (4) :46-48)。总之，戴氏绿僵菌Metarhizium taiiGYYA0601菌株是一种极有抗细菌、抗真菌医用或农用抗生素药物开发潜力的真菌资 源。
本发明的戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株已于2009年1月16 号保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.2880。图1 (a)为戴氏绿僵菌GYYA0601菌株有效部位抑制立枯丝核病原真菌的生长(作 用24小时)。图1 (b)为戴氏绿僵菌GYYA0601菌株有效部位抑制镰刀病原真菌的生长(作用72 小时)。图2(a)为戴氏绿僵菌GYYA0601菌株胞外乙酸乙酯有效部位使多种病原细菌形成 抑菌圈(① 25mg/ml ；② 12. 5mg/ml ；③ 6. 25mg/ml ；④ 3. 13mg/ml ；⑤ 1. 56mg/ml ；⑥阴性对 照；⑦阳性对照)。图2(b)为戴氏绿僵菌GYYA0601菌株胞内丙酮有效部位使多种病原细菌形成抑菌 圈(① 50mg/ml ；② 25mg/ml ；③ 12. 5mg/ml ；④ 6. 25mg/ml ；⑤ 3. 13mg/ml ；⑥阴性对照；⑦ 阳性对照)。图2(c)为戴氏绿僵菌GYYA0601菌株胞内氯仿有效部位使多种病原细菌形成抑菌 圈(① 50mg/ml ；② 25mg/ml ；③ 12. 5mg/ml ；④ 6. 25mg/ml ；⑤ 3. 13mg/ml ；⑥阴性对照；⑦ 阳性对照)。图3为戴氏绿僵菌GYYA0601菌株的菌落形态特征。(a)查氏培养基上；(b) :PDA 培养基上；(c)沙氏培养基上。图4为戴氏绿僵菌GYYA0601菌株营养菌丝、产孢结构和分生孢子(①菌丝体、② 孢子梗、③分生孢子)。图5为戴氏绿僵菌GYYA0601菌株有性型的形态图。
具体实施例方式实施例1 本发明戴氏绿僵菌菌株的获得在贵州省贵阳市羊艾茶场采集到一种虫草，置于无菌试管中，带回实验室按以下 两种方法分离和培养。方法一根据组织分离法(方中达，植物病原研究法(第3版).北京中国农业出 版社，1998)，将采集到的虫草用水清洗表面泥污，阴干，分别用无菌小刀把菌核和子实体切
7开，从中用无菌接种针挑取小块组织，70%酒精或0. 升汞液消毒，无菌蒸馏水清洗2-3 次后置入PDA培养基平板，25-28°C培养2-4天，挑取单菌落，即获得纯培养菌株。置于沙氏 培养基斜面中，4°C保存。方法二、根据次生子囊孢子微循环法分离(参见梁宗琦.中国真菌志(第23卷) 虫草属.北京科学出版社，2007.)。表面消毒虫草，让其子实体中的子囊自动弹射子囊孢 子到PDA培养基平板中，25-28°C培养2-4天，挑取单菌落，即获得纯培养菌株。从6根虫草 中一共分离到21株纯培养菌株，4°C保存在沙氏培养基斜面中。实施例2 :GYYA0601菌株发酵产物的制备各菌株活化后，挑取约5-10mm2大小的菌丝块到装有100mL种子培养液(沙氏培养 基葡萄糖40g，蛋白胨10g，KH2P04lg，MgS040. 5g，蒸馏水1L)的250mL摇瓶中，26_28°C培养 3-4天，转速150-180r/min。发酵终止后，把培养好的种子培养物按3 5% (v/v)比例接种 到装有200mL发酵培养液(发酵培养基为改良沙氏培养基葡萄糖25g，黄豆粉5g，酵母膏 2g，KH2P04lg, MgS040. 5g，蒸馏水 1L)的 500mL 摇瓶中，26_28°C培养 7-9 天，转速 150-180r/ min，发酵终止后，即得发酵产物，发酵产物具有广谱抗生活性。
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权利要求
戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株，其保藏编号为CGMCC NO.2880。
2.按照权利要求1所述的戴氏绿僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株，其特征在于 生物学形态特征描述为在PDA培养基上，28°C培养12天后，菌丝有隔无色至暗色，平展，菌落中央白色，外围产孢结构及分生孢子形成明显的8-10条墨绿色环带，分生孢子瓶 梗近柱形，具短尖，单生于气生菌丝或紧密地轮生于分生孢子梗或原瓶梗上，也可通过微循 环产孢直接从次生子囊孢子上产生，分生孢子多串生，柱状，中部稍缢缩，两端圆或一端稍 细，未见双生孢子，由次生子囊孢子微循环产孢形成的分生孢子，其形状大小基本与无性繁 殖的分生孢子相同。
3.戴氏绿僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株用于发酵生产抗生素的用途。
4.一种戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株的发酵方法，其特征在于(1)菌种活化将纯菌种接种于斜面菌种培养基上；(2)—级种子制备挑取菌丝块到种子培养液中，26 28°C、转速150 180r/min培养3 4天；(3)发酵接种一级种子到发酵培养基中，26 28°C、转速150 180r/min培养7 9 天，得发酵产物。
5.按照权利要求4所述戴氏绿僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株的发酵方法，其 特征在于(1)菌种活化将纯菌种接种于斜面菌种培养基上；(2)—级种子制备挑取5 10mm2大小的菌丝块到100ml种子培养液中，26 28°C、 转速150 180r/min培养3 4天；(3)发酵按发酵培养基总体积3 5%的比例接种一级种子到发酵培养基中，26 28°C、转速150 180r/min培养7 9天，得发酵产物。
6.按照权利要求4或5所述戴氏绿僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株的发酵方 法，其特征在于所述斜面菌种培养基为沙氏培养基。
7.按照权利要求4或5所述戴氏绿僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株的发酵方 法，其特征在于所述种子培养液为葡萄糖40g、蛋白胨10g、KH2P041g、MgS040. 5g、蒸馏水 1L。
8.按照权利要求4或5所述戴氏绿僵菌Metarhiziumtaii GYYA0601菌株的发酵方法， 其特征在于所述发酵培养基为葡萄糖25g、黄豆粉5g、酵母膏2g、KH2P041g、MgS040. 5g、 蒸馏水1L。
9.利用权利要求4至8任一项所述戴氏绿僵菌MetarhiziumtaiiGYYA0601菌株的发 酵方法所得的发酵产物。
全文摘要
本发明公开了一种能产广谱抗生素的戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601菌株及其用途，戴氏绿僵菌Metarhizium taii GYYA0601的保藏编号为CGMCC NO.2880，用于发酵生产抗生素，发酵方法包括菌种活化、一级种子制备和发酵步骤，所得的发酵产物具有广谱抗生活性。
文档编号C12N1/14GK101857842SQ200910301440
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月9日 优先权日2009年4月9日
发明者肖代敏, 肖建辉, 钟建江 申请人:遵义医学院附属医院