肿瘤细胞恶性程度的评价方法

专利名称：肿瘤细胞恶性程度的评价方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤细胞恶性程度的评价方法。具体而言，本发明涉及的方法是 从含有肿瘤细胞的试样制备含受体酪氨酸激酶(receptor typetyrosine kinase,以下称 “RTK”)的细胞膜级分，在有RTK活性抑制剂和无RTK活性抑制剂的条件下测定该细胞膜级 分中的RTK酶活性，通过比较所得结果评价肿瘤细胞恶性程度的方法。
背景技术：
细胞的细胞膜中存在被称为RTK的激酶。已知这种激酶在细胞分化和增殖中发挥 着重要作用。作为RTK，已知有胰岛素样生长因子受体(IGFR)、血小板衍生的生长因子受体 (PDGFR)、人类表皮细胞生长因子受体(HER)、血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)等。根据迄今为止的研究，已发现某个特定的RTK会在某个特定的肿瘤细胞中过度表 达。比如已知HER中的一种——HER2在乳腺癌中基因和蛋白质的表达量增加。因此，一 般认为，通过调查乳腺癌患者的HER2的存在量可预测乳腺癌的复发可能性。据报告，作为 HER2抑制剂的抗体药物赫赛汀(注册商标；通用名曲妥珠单抗)对乳腺癌有治疗效果。同样，对其他RTK的基因和/或蛋白质的表达量与肿瘤细胞增殖和转移的关系也 在进行研究。对RTK靶向的抑制药剂抑制肿瘤细胞增殖的效果和抑制肿瘤细胞转移的效果 也在进行研究。比如，Sirotnak 等(临床癌症研究(Clinical Cancer Research)，vol. 6， p. 4885-4892，2000 ；非专利文献1)用RT-PCR法测定HER之一的HER1 (也称“EGFR”)的基 因在肺癌和前列腺癌肿瘤细胞中的表达量(参照上述文献的图1)。并对HER1抑制剂易瑞 沙(Iressa)(注册商标；通用名吉非替尼)对肿瘤细胞增殖的影响进行了研究(参考上 述文献的图3)。Sirotnak等人根据这些结果报告，HER1表达量最高的肿瘤细胞株(A-431) 的增殖因易瑞沙得到了最大程度的抑制。此结果显示，越是HER1表达量多的肿瘤细胞，易 瑞沙抑制增殖的效果越高。对此，Ciardiello等(临床癌症研究(Clinical Cancer Research), vol. 7, p. 1459-1465,2001 ；非专利文献2)表示，HER1的表达量与易瑞沙IC50(药物抑制50%细 胞增殖的浓度(PM))未必一定相关。具体而言，HER1的表达量在MCF-7ADR、0VCAR-3和 SW480株中很高，在ZR-75-1和KAT0III株中很低(参考上述文献的表1)。另一方面，易瑞 沙IC50的值在ZR-75-1和KAT0III株中和在MCF_7ADR、0VCAR_3和SW480株中一样低(参 考上述文献的表2)。因此可以知道，与HER1的表达量无关，这些细胞株被易瑞沙在同样程 度上抑制了增殖。这些研究结果表明，像HER1这种RTK基因和/或蛋白质的表达量与RTK抑制剂对 肿瘤细胞增殖的抑制效果之间未必一定有相关关系。非专利文献1 Francis M. Sirotnak等“抑制人类肿瘤异种移植的细胞毒性药物， 在通过一种叫做ZD1839(易瑞沙)的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的合成后，其 功效明显增强” (“Efficacy of Cytotoxic Agentsagainst Human Tumor Xenograftsls
4Markedly Enhanced By Coadministration of ZD1839(Iressa), a Inhibitor of EGFR Tyrosine Kinase”)，临床癌症研究(Clinical Cancer Research), vol. 6, p. 4885-4892, 2000非专利文献2 :Ciardiello等“通过ZD1839 (易瑞沙)，一种选择性表皮 生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，来抑制增长因子的生成和人体内癌细胞的血管生 成，，(“Inhibition of Growth Factor Production andAngiogenesis in Human Cancer Cells by ZD1839(Iressa), a SelectiveEpidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor”)，临床癌症研究(Clinical Cancer Research), vol. 7, p. 1459-1465, 200
发明内容
发明要解决的课题本发明者们着眼于测定RTK的酶活性(以下称“RTK活性”)，而非RTK的基因和蛋 白质的量——即表达量。因此，本发明的课题是提供一种根据RTK活性的测定结果评价肿 瘤细胞恶性程度的方法。解决问题的手段本发明提供一种评价肿瘤细胞恶性程度的方法，包括以下步骤(1)从含有肿瘤细胞的试样中制备含有RTK的细胞膜级分(membrancefraction)，(2)使在步骤(1)获得的细胞膜级分与RTK活性抑制剂接触，(3)使在步骤(2)获得的与RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与与至少针对二种 RTK的底物接触，通过测定被磷酸化的底物，测定在有第一 RTK活性抑制剂的情况下的RTK 活性(第一 RTK活性)，(4)使在步骤(1)获得的细胞膜与在步骤(3)使用的底物同样的底物接触，而不 接触第一 RTK活性抑制剂，通过测定被磷酸化的底物，测定在没有RTK活性抑制剂情况下的 RTK活性(对照RTK活性)，(5)根据上述第一 RTK活性和对照RTK活性，评价有第一 RTK活性抑制剂情况下的 上述肿瘤细胞的恶性程度。发明效果按照本发明的方法，通过测定含肿瘤细胞的试样的RTK活性，就可方便地评价在 RTK活性抑制剂存在的条件下肿瘤细胞的增殖能力、转移能力等恶性程度。根据本发明的 方法，从患者身上采集肿瘤细胞，测定该肿瘤细胞的RTK活性，就可以在短时间内简便地知 道该患者的癌症恶性程度。因此易于获得决定对患者的有效治疗方针(如所用抗癌药的种 类)等的指标。


图1为显示实施例1结果的雷达图。图2为显示实施例1结果的雷达图。图3为关于细胞增殖能力的比较例1的结果图。图4为关于肿瘤大小的比较例2的结果图。
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图5为关于细胞生存能力的比较例3的结果图。图6为关于细胞VEGF分泌能力的比较例4的结果图。图7为关于细胞浸润能力的比较例5的结果图。图8为关于细胞趋化能力的比较例6的结果图。
具体实施例方式本发明者们着眼于测定RTK活性，而非RTK的基因和蛋白质的表达量。而且，本发 明者们还着眼于这样的报告—RTK有很多种类， -RTK受配体的刺激而形成同型二聚体，进行信号传递。但是，RTK不仅如此，还形 成包括异型二聚体或四聚体在内的多聚体，这些都参与肿瘤细胞的增殖，—HER1和HER2以外的RTK也参与癌细胞增殖和/或转移。因此，本发明者们认为，不仅测定特定的RTK(比如HER1和HER2)，也测定多种 RTK(如PDGFR、VEGFR等)的活性对于更正确地获得有关肿瘤细胞增殖和转移的信息是很 重要的。因此，本发明提供的方法用对至少二种RTK有特异性的底物测定有RTK活性抑制 剂时和没有RTK活性抑制剂时的RTK活性，以此能够测定多种RTK活性。在本说明书中，所谓“肿瘤细胞的恶性程度”包括肿瘤细胞的增殖能力、转移能力 等。最好肿瘤细胞的恶性程度就是肿瘤细胞的增殖能力和/或转移能力。上述“增殖能力” 包括细胞生存的能力、细胞通过增大其体积而生长的能力等。上述“转移能力”包括肿瘤细 胞从原病灶移走，依附于其他组织和器官的能力、肿瘤细胞分泌VEGF(血管内皮细胞生长 因子)的分泌能力、肿瘤细胞的趋化性(游走性；肿瘤细胞移动的能力)及浸润能力(肿瘤 细胞浸润到组织的能力)等。在本说明书中，RTK是存在于细胞膜的受体型酪氨酸激酶，也称跨膜型酪氨酸激 酶。RTK包括胰岛素受体(IR)、胰岛素样生长因子受体(IGFR)、血小板衍生的生长因子受 体(PDGFR)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、人类表皮细胞生长因子受体(HER)、血管内 皮细胞生长因子受体(VEGFR)等。这些受体分别已知有几个亚族，比如HER已知有HER1、HER2、HER3、HER4等。在本发明的方法中，首先是从含有肿瘤细胞的试样制备含有RTK的细胞膜级分。上述含有肿瘤细胞的试样可以来源于生物体的样本，也可以来源于培养细胞系肿 瘤细胞获得的培养物。来自生物体的样本比如有从生物体(患者)采集的组织(肿瘤组织、 器官组织、淋巴结组织、血液等)或体腔清洗液等。含有RTK的细胞膜级分的制备可以采取从含有上述肿瘤细胞的试样中分离细胞 质的方法、即从细胞质分离出RTK结合的细胞膜级分的方法。最好方法中包括将上述肿瘤 细胞在适当的缓冲液(以下称“均质化试剂”)中破碎，从所得破碎液中获取非溶性级分，将 该非溶性级分和含有表面活性剂的增溶剂混合，从所得混合液中获取可溶性级分。使用上述均质化试剂破碎获得的破碎液用离心分离等适当方法可以区分出可溶 性级分(如上清)和非溶性级分(如沉淀物)。该可溶性级分包括来源于细胞质的蛋白质 等，该非溶性级分包括保持有各种RTK的细胞膜碎片。
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可以通过比如离心分离等适当的方法将上述混合液区分为可溶性级分(如上清) 和非溶性级分(如沉淀物)。该可溶性级分包含被表面活性剂溶解(胶粒化)的、保持有各 种RTK的细胞膜，该非溶性级分含有非溶性蛋白质和DNA等。含有RTK的细胞膜级分最好所含RTK可以形成同型二聚体和异型二聚体这种多聚 体、在保持立体结构的状态下保持在细胞膜中。最好这种RTK在保持在细胞膜中的状态下 被表面活性剂胶粒化，分散在溶液中。如上所述，制备含有RTK的细胞膜级分可以测定肿瘤细胞所具有的各种RTK的酶活性。上述细胞破碎可以通过能将细胞膜断成片的方法进行。比如一些众所周知的方 法吸移管吸入排出、通过冷冻溶解破碎细胞、涡动搅拌器搅拌、用搅切器破碎、用杵加压、 用超声波处理装置进行超声波处理等。上述均质化试剂在破碎细胞时为防止RTK变性而使用。均质化试剂的pH以不 使RTK变性和失活、可以在稳定状态下回收的范围即可，无特别限定。均质化试剂的pH以 pH4. 0-9. 0 为宜，pH4. 5-8. 5 更好，最好是 pH 5. 0-8. 0。均质化试剂最好含有缓冲剂。缓冲剂有磷酸缓冲剂、醋酸缓冲剂、柠檬酸缓冲齐U、 MOPS (3-吗啉代丙烷磺酸)、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)_1_哌嗪]乙磺酸)、Tris (三羟甲基 氨基甲烷)、tricine(N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸))等。上述增溶剂中所含表面活性剂无特别限定，只要能够胶粒化已断片化的细胞膜、 不使细胞膜中所含RTK分解和变性即可。带电荷的表面活性剂有可能与RTK结合使其立 体结构发生变化，因此，最好使用不与RTK结合的非离子型表面活性剂。这种非离子型表 面活性剂比如可列举出基本构造有十二烷基醚、十六烷基醚、十八烷基醚、p-t-辛基苯基 醚等的活性剂。具体而言，非离子型表面活性剂有乙基苯基聚乙二醇(NP-40，壳牌国际石 油有P艮公司(Shell International Petroleum Company Limited)的注册商标)、曲拉通 (Triton)-X(联合碳化化学品及塑料公司(Union Carbide Chemicals&PlasticsInc.)的注 册商标)、吐温(Tween) (ICI美国公司(ICIAmericasInc.)的注册商标)、Brij (ICI美国公 司(ICIAmericas Inc.)的注册商标)、Emulgen (花王的注册商标)等。增溶剂中的表面活 性剂浓度以0. 05-5%为宜，0. 1-3%更好，最好是0. 1-1%。上述增溶剂最好含有与用于均质化试剂的缓冲剂同样的缓冲剂。该增溶剂最好有 与均质化试剂同样的PH值。上述均质化试剂和增溶剂也可以含有蛋白酶抑制剂、脱磷酸化酶抑制剂、防止SH 基氧化的试剂(以下称“SH基稳定剂”)等。蛋白酶抑制剂可以用于防止RTK被细胞中所含蛋白酶分解。蛋白酶抑制剂比如 有诸如乙二胺四乙酸(EDTA)和乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)那样的金属蛋白酶抑制 剂；苯甲基磺酰氟(PMSF)、胰朊酶抑制剂、胰凝乳朊酶等丝氨酸蛋白酶抑制剂；碘代乙酰胺 和E-64等半胱氨酸蛋白酶抑制剂等。这些蛋白酶抑制剂可单独使用也可混合使用。也可以使用蛋白酶抑制剂混合液(SIGMA公司)那种事先将多种蛋白酶抑制剂混 合在一起的市场销售品。脱磷酸化酶抑制剂可以用于防止RTK的活性因细胞内所含脱磷酸化酶而下降。脱 磷酸化酶抑制剂比如有正钒酸钠(Na3VO4)、氟化纳(NaF)和冈田酸等。脱磷酸化抑制剂既
7可单独使用也可混合使用。SH基稳定剂可用于防止RTK失活。酶所具有的SH基被氧化，易于形成稳定的二硫 化物。二硫化物的形成会引起酶的立体结构发生变化，有时会成为酶失活的原因。用于防 止SH基的氧化的SH基稳定剂可以使用含有SH基的试剂。SH基稳定剂比如有二硫苏糖醇 (DTT)、2_巯基乙醇、谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸、辅酶A和二氢硫辛酸等。当SH基稳定剂为DTT时，上述均质化试剂和/或增溶剂中的SH基稳定剂浓度应 为0. 05 2mM，0. 07 1. 7mM更好，最好为0. 1 1. 5mM。比如，如果SH基稳定剂为2-巯 基乙醇,则以0. 1 15mM为宜，0. 3 13mM更好，最好为0. 5 12mM。使按以上所述制备的、含RTK的细胞膜级分与RTK活性抑制剂接触。RTK活性抑制 剂只要能抑制RTK的活性即可，无特别限定。RTK活性抑制剂已知有与RTK的三磷酸腺苷 (ATP)结合位点结合的抑制剂(以下称“ATP竞争抑制剂”或“ATP竞争RTK活性抑制剂”)、 与RTK的底物结合位点结合的抑制剂、与RTK胞外域(如配体结合位点)结合的抑制剂等。 最好RTK活性抑制剂是RTK的ATP竞争抑制剂。RTK的ATP竞争抑制剂比如有易瑞沙(阿斯利康公司)、格列卫(GLIVEC，NOVARTIS 公司)、特罗凯(tarceva, OSI 公司)、PD153035 (Calbiochem 公司)、AG1478 (Calbiochem 公司)、4557W(EGFR/ErbB-2抑制剂)(Calbiochem公司)、PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂 III (Calbiochem公司)、VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂III (Calbiochem公司)等。与RTK底物结合位点结合的抑制剂有酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin ； Calbiochem 公司)等。与RTK胞外域结合的抑制剂有赫赛汀(Genentech公司)、爱必妥(Cetuximab ；英 克隆(ImClone)公司)、帕妥珠单抗(pertuzumab ；Genentech公司)等。上述接触通常在溶液中进行。溶液中的RTK活性抑剂浓度可以根据该抑制剂的种类、底物的浓度、后述磷酸基 供应体(如ATP)等适当设定。比如当使用ATP竞争抑制剂作为RTK活性抑制剂时，抑制剂 的浓度可以设定为是磷酸基供应体(具体地说就是ATP)的浓度的0. 1 10倍。在本发明的方法中，让与上述RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与至少针对二种 RTK的底物接触，通过测定磷酸化底物，测定有RTK活性抑制剂存在条件下RTK活性(第一 RTK活性)。该测定最好是混合上述细胞膜级分、上述底物和磷酸基供应体，测定被RTK活性 磷酸化的底物。通过此RTK介入的反应，磷酸基供应体的磷酸基被取入底物，测定磷酸化的 底物就可以测定RTK的活性。上述至少针对二种RTK的底物最好是对RTK种类特异性低的底物(以下称“通用 底物”)或者对特定RTK特异性高的底物几种组合在一起的底物混合物。用这种底物测定 RTK活性，可以测定试样中所含数种RTK的活性。对特定RTK特异性高的底物，比如可以是对HERl特异性高的底物Grb2、髓鞘碱性 蛋白(MBP)、组朊 H2B (HH2B)、磷脂酶 C- γ 等。像 GST-EGFR 基板(GST-EGFR substrate) (Stratagene公司)这种市场出售的底物也可以作为对HERl有高特异性的底物使用。 GST-EGFR基板(GST-EGFR substrate)是谷胱甘肽_S_转移酶(GST)和被HERl的酶活性磷 酸化的合成底物的融合蛋白质。
上述通用底物对RTK种类的特异性很低，即是针对多种RTK的底物。因此，合成 的通用底物最好是对RTK种类的特异性很低的众所周知的合成肽。合成肽具体而言最好 是由含谷氨酸残基和酪氨酸残基的氨基酸序列组成，该合成肽比如有聚(Poly) (Glu4-Tyr) (生物素共轭(biotin conjugate), UPSTATE公司)这种市场销售的合成肽。此外，合成 肽，如有Norio Sasaki 等，1985，生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry), Vol. 260，No. 17,9793 9804、Sergei Braun 等，1984，生物化学杂志(The Journal ofBiological Chemistry)，Vol. 259，No. 4，2051 2054 以及 Μ. Abdel-Ghany 等，1990，国 家禾斗学院项目(Proceeding of The National Academy ofScience), Vol. 87, 7061 7065 等文献中作为酪氨酸激酶的底物列举的合成肽。这些文献记载的合成肽由含谷氨酸残基 (Glu)和酪氨酸残基(Tyr)的氨基酸序列组成，合成为Tyr被二种以上酪氨酸激酶磷酸化。上述合成肽的氨基酸序列具体而言可举出以下序列由四个Glu和一个Tyr组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称“氨 基酸序列a”)；由一个Glu和一个Tyr组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以后称“氨 基酸序列b”)；由六个Glu、一个Tyr和三个氨基丙酸残基(Ala)组成的序列重复二次以上形成的 氨基酸序列(以后称“氨基酸序列c”)；由一个Glu、一个Tyr和一个Ala组成的序列重复二次以上形成的氨基酸序列(以 后称“氨基酸序列d”)；由二个Glu、一个Tyr、六个Ala和五个赖氨酸残基(Lys)组成的序列重复二次以 上形成的氨基酸序列(以后称“氨基酸序列e”)。Tony Hunter，1982，生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)，Vol. 257，No. 9,4843 4848 的文献中，有报告说酸 性氨基酸残基对酪氨酸激酶磷酸化Tyr很重要。因此，用含有大量酸性氨基酸残基Glu的 氨基酸序列a和氨基酸序列c作为上述底物特别理想。上述磷酸基供应体如有腺苷三磷酸(ATP)、腺苷5’ -0-(3-硫代三磷酸) (ATP- γ S)、32P标记的腺苷5，-0-(3-三磷酸)(y- (32P) -ATP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷单 磷酸(AMP)等。上述磷酸化底物的测定最好是从其他蛋白质分离出磷酸化底物，检测该底物。为要从其他蛋白质分离出磷酸化底物，上述底物可以有亲和标记。通过使用有亲 和标记的底物和有可与亲和标记结合的物质(以下称“结合物”)的固相可以使从其他蛋白 质分离出磷酸化底物并加以回收这一操作变得很容易。具体而言，回收磷酸化底物与上述 固相的复合物，分解该复合物中的亲和标记和固相所具有的结合物之间的结合，即可回收 底物。上述亲和标记只要具有相应结合物、且不妨碍底物与RTK的结合和底物磷酸化即 可，无特别限定。亲和标记比如可用多肽、半抗原等。具体而言，可以使用GST、组氨酸、麦 芽糖结合蛋白质、FLAG肽(SIGMA公司)、Myc标记、血凝素(HA)标记、链球菌(Str印)标记 (IBA GmbH公司)、生物素、亲和素和链亲和素等。有上述亲和标记的底物比如可以是上述底物和上述亲和标记进行化学结合的产 物。或者，当亲和标记是多肽时，也可以将含有编码底物和亲和标记的融合蛋白质的重组基因的载体导入宿主，回收宿主产生的融合蛋白质进行使用。对于与上述亲和标记相应的结合物，没有特别限定，只要是能与亲和标记可逆性 结合的物质即可，如有谷胱甘肽、镍、直链淀粉、抗FLAG抗体(SIGMA公司)、抗Myc抗体、 抗 HA 抗体、Str印-Tactin (IBA GmbH 公司)等。上述固相只要是能与上述结合物结合的载体即可，无特别限定。固相材质如有多 糖类、塑料、玻璃等。固相的形态如微球(Beads)、凝胶等。固相具体来说如有琼脂糖凝胶 球、琼脂糖球、磁性微球、玻璃微球、硅凝胶等。这些固相也可填充到柱中使用。亲和标记与有结合物的固相的组合举例如下当选择GST为亲和标记时，固相可以用谷胱苷肽琼脂糖凝胶球(以下称“谷胱苷肽 球”)。在此组合情况下的具体的RTK活性测定比如可如下进行。使与RTK活性抑制剂接触 过的细胞膜级分与GST所结合的底物接触，在此加入谷胱苷肽球，获得磷酸化底物结合的 谷胱苷肽球。回收此谷胱苷肽球后，添加还原型谷胱苷肽，则得以分解GST与谷胱苷肽球的 结合，回收底物。或者先让GST结合的底物与谷胱苷肽球接触，获得该底物与谷胱苷肽球的复合 物。让已与RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与该复合物接触并将其回收。在此添加还原 型谷胱苷肽，分解GST和谷胱苷肽球的结合，也可以回收到底物。如果选择组氨酸作为亲和标记，则有结合物的固相可以用镍琼脂糖球。组氨酸与 镍的结合比如可以用甘氨酸-HCl等酸或咪唑分离。若选麦芽糖结合蛋白质作为亲和标记，则有结合物的固相可以用直链淀粉磁球。 麦芽糖结合蛋白质与直链淀粉的结合可以添加游离的直链淀粉来分解。如果选FLAG肽作为亲和标记，则有结合物的固相可以用FLAG亲和凝胶(SIGMA公 司)。FLAG肽与FLAG亲和凝胶的结合比如可以用甘氨酸-HCl等酸或3XFLAG肽(SIGMA 公司)来分解。如果选Myc标记作为亲和标记，则有结合物的固相可以用结合了抗Myc抗体的琼 脂糖球。如果选择HA标记作为亲和标记，则有结合物的固相可以用结合了抗HA抗体的琼 脂糖球。Myc标记和抗Myc抗体的结合、HA标记和抗HA抗体的结合都可以通过例如添加酸 或碱使蛋白质变性来使之分解。此时，最好选择可以将变性的蛋白质还原的酸或碱，具体而 言，如酸可用盐酸等，碱可用苛性钠等。如果选择Str印标记作为亲和标记，则有结合物的固相可以用Str印-Tactin固相 凝胶柱(IBA GmbH公司)。Str印标记和Str印-Tactin的结合比如可以用与链亲和素可逆 性反应的脱硫生物素来分解。也可以在让RTK与上述底物接触后，在回收磷酸化的底物之前用加热处理、冷却 处理或添加EDTA等酶抑制剂等处理停止酶反应。酶反应再进行下去有可能造成各个试样 的测定结果参差不齐，如上所述停止酶反应，可以避免出现这种情况。最好让标记物结合到如上所述从固相分离出来的、磷酸化的底物，通过检测该标 记物，来测定磷酸化的底物。标记物如有荧光物质、酶、放射性同位素等，但不限于此。荧光 物质如有荧光素、香豆素、曙红、菲绕啉、芘、若丹明等。酶如有碱性磷酸酶、过氧化物酶等。
10放射性同位素如有 32P、33P、131I、125I、3H、14C、35S 等。如果以酶为标记物，上述检测可以通过检测与这些酶的底物反应产生的显色来实 现。当酶是碱性磷酸酶时，底物可以是氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚基 磷酸盐(BCIP)的混合物等。如果酶是过氧化物酶(PO)，底物则可以是二氨基联苯胺(DAB)。磷酸化底物与标记物的结合可以采用通常的方式。比如可以使用有标记物并能够 与磷酸化底物特异性结合的抗体(以下称“磷酸化底物识别抗体”)，使标记物与磷酸化底 物结合。磷酸化底物与标记物的结合还可以使用磷酸化底物识别抗体和能与该磷酸化底 物识别抗体结合且有标记物的抗体(以下称“二次抗体”)。此时，通过磷酸化底物识别抗 体和二次抗体可以将标记物结合到磷酸化底物。磷酸化底物和标记物的结合还可以使用磷酸化底物识别抗体、有生物素的二次抗 体和有标记物的亲和素。此时可以通过磷酸化底物识别抗体、二次抗体、生物素和亲和素使 标记物结合到磷酸化底物。二次抗体可以有亲和素，生物素可以有标记物。磷酸化底物和标记物的结合还可以使用有生物素的磷酸化底物识别抗体和有标 记物的亲和素或用有亲和素的磷酸化底物识别抗体和有标记物的生物素。使用以上标记物，检测该标记物产生的信号，以此可检出磷酸化底物，测定RTK活 性。上述磷酸化底物识别抗体和二次抗体可以是用众所周知的方法制备的的抗体。获 得抗体的方法，比如有从接种抗原进行免疫的动物血液获得、重组基因获得等。该抗体可以 是多克隆抗体或单克隆抗体中任意一种，也可以是抗体的碎片及其诱导体。也可以将这些 抗体二种以上混合起来使用。抗体碎片及其诱导体如有Fab碎片、F(ab’)碎片、？(油)2碎 片、sFv 碎片等(Blazar 等，1997，免疫学杂志(Journal of Immunology), 159 5821-5833 及Bird等，1988，科学(Science)，242 :423_426)等。抗体的类型可以是IgG、IgM等。检测磷酸化底物的方法可根据标记物种类适当选择。例如，当标记物是荧光物或 酶时，可用免疫印迹法检测磷酸化底物。将SDS-PAGE等电泳分离的磷酸化底物印迹到膜 上，在含有磷酸化底物识别抗体的缓冲液中培养该膜，使该抗体与磷酸化底物结合，再让有 标记物的二次抗体与磷酸化底物识别抗体结合，通过检测此标记物即可测定磷酸化底物。 当磷酸化底物有上述亲和标记时，可以使用该亲和标记分离磷酸化底物，通过狭线印迹法 取代免疫印迹法，和用免疫印迹法时同样地测定磷酸化底物。当标记物是荧光物时，也可以将含磷酸化底物的溶液装入试管，加入有荧光物的 磷酸化底物识别抗体并使其与磷酸化底物结合，测定荧光强度，以此检测磷酸化底物。如果标记物是酶，则可以用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测磷酸化底物。ELISA 法含直接吸附法和夹心法。直接吸附法是一种包括将磷酸化底物直接吸附于固相的方法，如将磷酸化底物吸 附于固相表面，使含酶的磷酸化底物识别抗体与磷酸化底物结合，用酶的底物使磷酸化底 物识别抗体含有的所述酶显色，检测该显色即可。夹心法是一种用识别磷酸化底物不同位点的二种磷酸化底物识别抗体检测磷酸 化底物的方法。这种方法比如可以让磷酸化底物识别抗体结合到固相(以后称“固相抗 体”)，让磷酸化底物与固相抗体结合。让含有酶的磷酸化底物识别抗体(以后称“标记抗
11体”)与该磷酸化底物结合，该标记抗体所具有的酶与该酶的底物发生反应而显色，检测该 显色即可。如果标记物为放射性同位素，则可以用放射线免疫分析法(RIA)检测磷酸化底 物。具体而言，可以使有放射性同位素的磷酸化底物识别抗体与磷酸化底物结合，用闪烁计 数器等测定放射线，检测磷酸化底物。本发明的方法中所包含的测定没有RTK活性抑制剂情况下的RTK活性(对照RTK 活性)的步骤除不让上述细胞膜级分与上述RTK活性抑制剂接触这一点外，均与上述第一 RTK活性的测定步骤相同。本发明的方法包括根据上述第一 RTK活性和对照RTK活性评价在有RTK活性抑制 剂条件下的肿瘤细胞恶性程度的步骤。上述评价步骤最好根据述第一 RTK活性和对照RTK活性，算出肿瘤细胞所含RTK 活性的相对值，通过比较该相对值和阈值(以下将详述)来评价在有RTK活性抑制剂条件 下的该肿瘤细胞的恶性程度。上述相对值应为最好是第一 RTK活性和对照RTK活性的差或第一 RTK活性除以对 照RTK活性的商(第一 RTK活性/对照RTK活性)，最好是第一 RTK活性除以对照RTK活性 的商。上述所谓阈值可以根据RTK活性抑制剂种类和肿瘤细胞种类适当设定。阈值比如 可以用已在临床上评价过其恶性程度的肿瘤细胞和某种特定RTK活性抑制剂，按照与本发 明方法同样的方法测定第一 RTK活性和对照RTK活性，通过计算其相对值求出。在上述评价步骤中，当上述相对值为从对照RTK活性减去第一 RTK活性的差时，比 较相对值和阈值，如果相对值高于阈值，则可以评价为在RTK抑制剂存在的条件下肿瘤细 胞恶性程度低。当上述相对值为第一 RTK活性除以对照RTK活性的商(第一 RTK活性/对 照RTK活性)时，比较相对值和阈值，如果相对值低于阈值，则可以评价为在RTK抑制剂存 在的条件下肿瘤细胞恶性程度低。本发明的方法最好还包括以下步骤(a)让含有从含有上述肿瘤细胞的试样制备的RTK的细胞膜级分与不同与第一 RTK活性抑制剂的第二 RTK活性抑制剂接触；(b)让在步骤(a)获得的与上述第二 RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与在上述 第一 RTK活性测定中使用的底物同样的底物接触，通过测定磷酸化底物，测定在有上述第 二 RTK活性抑制剂情况下的RTK活性(第二 RTK活性)。在本发明测定第二 RTK活性的方法中，评价步骤是根据第一 RTK活性、第二 RTK活 性和对照RTK活性评价在有各种RTK活性抑制剂情况下的肿瘤细胞的恶性程度。上述第一 RTK活性抑制剂和第二 RTK活性抑制剂的组合，可以从上面列举的PTK 活性抑制剂中任意选择，最好是从上述RTK的ATP竞争抑制剂的例示中选择数种。上述评价步骤最好包括以下步骤(a)根据上述第一 RTK活性和上述对照RTK活性，算出关于上述肿瘤细胞所具有的 RTK活性的第一相对值；(b)根据上述第二RTK活性和上述对照RTK活性，算出关于上述肿瘤细胞所具有的 RTK活性的第二相对值；
(c)将步骤(a)和(b)算出的各相对值与其对应的各阈值进行比较，据此评价在有 RTK活性抑制剂情况下肿瘤细胞的恶性程度。上述第一相对值和第二相对值应当是第一 RTK活性或第二 RTK活性和对照RTK活 性的差、或者是第一 RTK活性或第二 RTK活性除以对照RTK活性的商(第一 RTK活性或第 二 RTK活性/对照RTK活性)，最好是第一 RTK活性或第二 RTK活性除以对照RTK活性的商。决定上述阈值时的方式可以与本发明中测定第一 RTK活性和对照RTK活性的方式 相同。如此，用多种RTK活性抑制剂评价肿瘤细胞的恶性程度，可以进行更精密的全面 的评价。以此可以更确切地获得指标，并据此指标决定对患者的有效的治疗方针(比如所 用抗癌药的种类)等，有可能使临床上的治疗选择更加广泛。实施例下面以实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例所限定。(至少针对二种RTK的底物)使用了聚(Glu4_Tyr)(生物素共轭(biotinconjugate)，UPSTATE 公司)作 为至少针对二种RTK的底物。此聚(Glu4-Tyr)是一种对跨膜型酪氨酸激酶种类特异性 很低的底物，具体而言，是由四个谷氨酸残基和一个酪氨酸残基构成的序列重复5次而 形成的氨基酸序列所构成的肽和生物素的融合蛋白质(以下称“生物素-聚(Glu、Tyr) [Biotin-Poly(Glu、Tyr)]底物”)。实施例1 :ATP竞争抑制剂对RTK的影响在本实施例中，不是从培养肿瘤细胞中提纯RTK，而是制备含有RTK的细胞膜级 分。使所得细胞膜级分与RTK活性抑制剂——ATP竞争RTK抑制剂接触或不接触，用上述 生物素"聚(Glu、Tyr)底物测定RTK活性。(制备细胞膜级分)将13 种培养细胞(A-431、KF、MDA-MB-468、RMUG-L, BT-474、ES2、MDA-MB453、 SK-Br-3、SNG-S、K-562、MDA-MB-231、MCF7 和 T47D)分别与 Iml 均质化试剂(含 20mM HEPES ρΗ7· 4,0. 2%蛋白酶抑制剂(PI)、10 %甘油、200 μ MNa3VO4、和50mMNaF)混合，用杵加压来 破坏细胞膜，制备细胞破碎液。离心分离(20000Xg、20分钟)所得细胞破碎液，弃上清， 回收沉淀物。在回收的沉淀物中添加增溶剂(含20mM HEPES pH7. 4,1% NP40.0. 2% PI, 10%甘油、200μΜ Na3VO4、和50mM NaF)并混合，用杵加压使细胞膜可溶化，进行离心分离 (20000Xg、20分钟)。回收上清作为细胞膜级分，调制至总蛋白质量为40μ g/ml后，将该 细胞膜级分用于以下实验。A-431为来源于鳞状细胞癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜 级分A-431。KF是来源于卵巢癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分KF。MDA-MB-468是来源于乳腺癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜 级分 MDA-MB-468。RMUG-L是来源于卵巢癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分 RMUG-L0
13
BT-474是来源于乳腺癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分 BT-474。ES2是来源于卵巢癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分 ES2。MDA-MB-453是来源于乳腺癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜 级分 MDA-MB-453。SK-Br-3是来源于乳腺癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级 分 SK-Br-3。SNG-S是来源于子宫癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分 SNG-S。K-562是来源于白血病的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分 K-562。MDA-MB-231是来源于乳腺癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜 级分 MDA-MB-231。MCF7是来源于乳腺癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分 MCF7。T47D是来源于乳腺癌的培养细胞，由此细胞制备的细胞膜级分称为细胞膜级分 T47D。(生物素-聚(Glu、Tyr)底物结合到ELISA板)ELISA试验用板使用的是亲和素包被板[具有SuperBlock封闭缓冲液的 NeutrAvidin HBC 白色96 孔板(NeutrAvidin HBC White 96-ffell Plates WithSuperBlock Blocking Buffer (PIERCE 公司))]。首先用 TBS-T (含 25mM Tris、150mM NaCl 和 0.05% Tween-20)清洗该板的各孔三遍。再将50 μ 1含上述生物素-聚(GliuTyr)底物的底物溶 液1(含lyg/ml的生物素-聚(GliuTyr)底物的TBS)注入各孔，边轻摇，边在25 °C培养1 小时30分钟。培养后各孔用TBS-T清洗三遍。如此使生物素-聚(GliuTyr)底物结合到 ELISA板的孔的表面。用此ELISA板进行以下酶反应。(RTK与ATP竞争抑制剂接触)本例使用了 ATP竞争RTK活性抑制剂PD153035(HER1抑制剂)(Calbiochem公司)、 AG1478 (HER1 抑制剂)(Calbiochem 公司)、4557W(HER1/HER2 抑制剂)(Calbiochem 公司)、 PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂III (以下称“PDGFR抑制剂” )(Calbiochem公司)和VEGF受 体酪氨酸激酶抑制剂III(以下称“VEGFR抑制剂”)(Calbiochem公司)。还使用了对非受 体型酪氨酸激酶Src的ATP竞争抑制剂Src抑制剂(inhibi tor)(以下称“Src抑制剂”) (Calbiochem公司)。各抑制剂的结构式如下。[化1]
权利要求
一种评价肿瘤细胞恶性程度的方法，包括以下步骤(1)从含有肿瘤细胞的试样中制备含有受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞膜级分；(2)使在步骤(1)获得的细胞膜级分与第一RTK活性抑制剂接触；(3)使在步骤(2)获得的与RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与至少针对二种RTK的底物接触，通过测定被磷酸化的底物，测定在有第一RTK活性抑制剂情况下的RTK活性(第一RTK活性)；(4)使在步骤(1)获得的细胞膜与和步骤(3)同样的底物接触，而不接触第一RTK活性抑制剂，通过测定被磷酸化的底物，测定在没有RTK活性抑制剂情况下的RTK活性(对照RTK活性)；(5)根据所述第一RTK活性和对照RTK活性，评价在有第一RTK活性抑制剂情况下的所述肿瘤细胞的恶性程度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于 所述步骤(1)包含(la)在缓冲液中破碎肿瘤细胞的步骤；(lb)从步骤(la)所得破碎液中获取非溶性级分的步骤；(lc)在步骤(lb)所得非溶性级分中添加含有表面活性剂的增溶剂并加以混合的步骤；(Id)从步骤(lc)所得混合液中获取可溶性级分的步骤。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于在所述步骤(3)和(4)中 的底物是多种对特定RTK特异性高的底物组合在一起的底物混合物或是对RTK种类特异性 低的底物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述对RTK种类特异性低的底物包括由 含有谷氨酸残基和酪氨酸残基的氨基酸序列所构成的肽。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中的RTK活性抑制剂是针 对RTK的三磷酸腺苷(ATP)竞争抑制剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于 所述步骤(5)包括以下步骤(5a)根据所述第一 RTK活性和所述对照RTK活性，算出所述肿瘤细胞具有的RTK活性 的相对值；(5b)通过比较步骤(5a)算出的相对值和阈值，评价在有RTK抑制剂情况下所述肿瘤细 胞的恶性程度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述相对值是所述第一 RTK活性除以所述对照RTK活性所得商，当所述相对值低于所述阈值时，评价在有RTK抑制剂情况下所述肿瘤细胞的恶性程度低。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述肿瘤细胞的恶性程度指所述肿瘤细 胞的增殖能力和/或转移能力。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于还包括步骤(6)，使在所述步骤(1)制备 的细胞膜级分与不同于所述第一 RTK活性抑制剂的第二 RTK活性抑制剂接触；步骤(7)，使在步骤(6)获得的与第二RTK活性抑制剂接触的细胞膜级分与同于所述步 骤(3)的底物接触，通过测定被磷酸化的底物，测定在有第二 RTK活性抑制剂情况下的RTK 活性(第二 RTK活性)；所述步骤(5)根据所述第一 RTK活性、第二 RTK活性和对照RTK活性，评价在有RTK抑 制剂情况下所述肿瘤细胞的恶性程度。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤(5)还包括以下步骤 (5a’ )根据所述第一 RTK活性和所述对照RTK活性，算出关于所述肿瘤细胞所具有的 RTK活性的第一相对值；(5b’ )根据所述第二 RTK活性和所述对照RTK活性，算出关于所述肿瘤细胞所具有的 RTK活性的第二相对值；(5c’ )通过将在步骤(5a’ )和(5b’ )算出的各相对值与各阈值进行比较，评价在有 RTK抑制剂情况下所述肿瘤细胞的恶性程度。
全文摘要
本发明提供一种评价肿瘤细胞的恶性程度的方法，该方法是从含有肿瘤细胞的试样中制备含有受体酪氨酸激酶(RTK)的细胞膜级分，在有及没有RTK活性抑制剂情况下测定此细胞膜的RTK的酶活性，通过比较所得结果来评价肿瘤细胞的恶性程度。
文档编号C12N9/12GK101981203SQ200980111398
公开日2011年2月23日 申请日期2009年3月23日 优先权日2008年3月28日
发明者伦崇, 佐藤淳, 石原英干, 能登谷 申请人:希森美康株式会社