专利名称：筛选用于改善皮肤功能的材料的方法
技术领域：
本申请涉及筛选用于改善皮肤功能的材料的方法。
背景技术：
表皮是皮肤的最外层。当由角质形成细胞组成的角质层处于正常状态时，表皮充当机体针对各种刺激的主要屏障并防止水分从机体散发。角质形成细胞在皮肤最内层的基底层中增殖，并在它们穿过棘层和颗粒层时逐渐分化。通过这种角质化过程，角质形成细胞产生天然保湿因子(NMF)和脂质(神经酰胺、胆固醇和脂肪酸)，并形成角质层，从而提供皮肤的屏障功能。然而，在皮肤疾病或不适(trouble)的情况下，由于若干原因而不再维持角质层的正常功能。结果，皮肤屏障被破坏，导致皮肤干燥，以及严重情况下的炎症。在此种皮肤疾病相关的炎症中，T辅助I(Thl)，T辅助2 (Th2)和T辅助17(Thl7) 细胞产生若干白介素，从而诱导免疫应答。膜结合蛋白17(MAP17)是17kDa大小的膜结合蛋白。首次观察到与正常的肾实质相比，MAP17基因在肾癌组织中过表达(Kocher et al.，Clinical Cancer Research, Vol. 1 :1209,1995)。由于在癌组织中过表达，MAP17蛋白被认为涉及过度增生 (hyperproliferation)，其是癌组织的特征。然而，当MAP17在结肠癌细胞系中过表达时， 据证实在体外条件下细胞增殖降低，而在体内条件下肿瘤增殖降低。因此，说明MAP17与细胞增殖不相关(Kocher et al.，Am. J. Pathol.，Vol. 149 :493，1996)。总而言之，至今还未确切地了解MAP17的作用。发明的内容技术问题因此，考虑上述问题而产生本发明，并且本发明的目的就是解决所述技术问题。本发明的目的是要提供新的筛选方法，其能够有效筛选用于改善皮肤功能的材料，所述材料改善皮肤屏障功能，促进皮肤保湿，或防止皮肤衰老。问题的解决方案根据所公开内容的筛选用于改善皮肤功能的材料的方法包括(a)用候选材料处理皮肤细胞；(b)检测膜结合蛋白17(MAP17)基因的相对表达水平的变化；和(c)挑选诱导该基因表达水平变化的候选材料作为用于改善皮肤功能的材料。发明的有利效果本公开提供了新的筛选方法，其能够有效筛选用于改善皮肤功能的材料，所述材料改善皮肤屏障功能，促进皮肤保湿，或防止皮肤衰老。如此所筛选的材料可足以被用做用于改善皮肤功能的组合物的有效成分。附图简述根据下列详细说明并结合附图可以更清楚的理解所公开的示例性实施方案的上述的和其他的方面、特征和优点，其中
图1显示了与未处理的对照组相比，源自T辅助I(Thl)、T辅助2 (Th2)和T辅助 17(Thl7)细胞的白介素引起的人角质形成细胞中MAP17基因的表达增加(A)和聚丝蛋白 (filaggrin)基因的表达降低(B)；图2图示了克隆MAP17基因(A)、以及全长MAP17和MAP17的羧基端(C端)片段 ⑶的方法；图3显示了当MAP17在人角质形成细胞(HaCaT细胞系)中过表达时，MAP17基因 (A)和聚丝蛋白基因⑶的表达；以及图4显示了在用或未用人参皂苷-Re处理的正常人角质形成细胞中，对MAP17基因(A)和聚丝蛋白基因(B)的表达的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的结果。实施本发明的最佳方式在下文中将参考附图(其中显示了示例性的实施方案)更全面的描述示例性的实施方案。然而，本公开可以采用许多不同的形式来实施，不应被理解为局限于其中所述的示例性实施方案。此外，提供这些示例性的实施方案以使本公开彻底和完整，并使本公开的范围全面地传达给本领域技术人员。在说明书中，可省略众所周知的特征和技术的细节以避免不必要地使所给出的实施方案不清楚。本文使用的术语的目的只是为了描述具体的实施方案，而不是要限制本公开。除非上下文明确另外指示，如本文使用的单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)” 旨在也包括其复数形式，。此外，术语一个(a)、一个(an)等的使用不表示数量的限制，而是表示至少一个所涉及的物品的存在。术语“第一”、“第二”等等的使用不表示任何具体顺序，而是将它们列入以标识单个元件。另外，术语第一、第二等的使用不表示任何顺序或重要性，而是使用术语第一、第二等来将一个元件与另一个区别。还应了解当用于本说明书时，术语“包括(comprises)”和 / 或“包括(comprising) ”，或“包含(includes) ” 和 / 或 “包含(including)”阐明了所指定的特征、区域、整数、步骤、操作、元件和/或成分的存在， 但不排除一或更多个其他特征、区域、整数、步骤、操作、元件、成分和/或其组群的存在或加入。除非另外限定，所有本文使用的术语(包括技术和科学术语)具有与本领域技术人员通常所理解的相同的含义。还应了解术语(诸如在通常使用的词典中定义的那些)应当被解释为具有与其在相关领域背景和本公开中的含义相一致的含义，不应被解释为理想化或过于正式的含义，除非本文明确如此定义。根据所述公开的筛选用于改善皮肤功能的材料的方法包括(a)用候选材料处理皮肤细胞；(b)检测膜结合蛋白17(MAP17)基因的相对表达水平的变化；和(c)挑选诱导该基因表达水平变化的候选材料作为用于改善皮肤功能的材料。在(a)中，用候选材料处理皮肤细胞。为了评价候选材料防御外部刺激、防止水分蒸发、和维持皮肤屏障功能的作用，皮肤细胞可以是例如人表皮新生的角质形成细胞。在(b)中，检测MAP 17基因的相对表达水平是否由于候选材料而变化。所述相对表达水平是指与未处理的皮肤细胞组进行比较的候选材料处理的皮肤细胞组中所述基因的表达水平。在整个说明书中，表达水平可表示所述基因的相对表达水平。本发明人已确定可以通过测量作为标记物的基因(尤其是MAP17基因)表达水平的变化来筛选用于改善皮肤功能的材料。所述MAP17基因的表达水平可以被提高，例如，通过选自由以下组成的组的一或多种白介素源自τ辅助1 (Thl)细胞的干扰素-、(IFN- Y )，源自T辅助2 (Th2)细胞的白介素-4(IL-4)，源自T辅助17(Thl7)细胞的白介素_17A(IL-17A)，白介素-17F(IL-17F)， 白介素-22(IL-2》和白介素-6(IL-6)。如下列实施例所证明的那样，本发明人已经确定MAP17基因的表达被源自Thl细胞、Th2细胞和Thl7细胞的白介素显著增加，所述白介素涉及皮肤保湿因子的减少、皮肤的屏障功能的损坏、皮肤防御能力的降低、以及炎症应答。由此，验证了所述MAP17基因受白介素(其由皮肤炎症或皮肤屏障的损坏而增加) 的调节。还确认了所述MAP17基因可能是在皮肤炎症或皮肤屏障的损坏中起重要作用的蛋白。因此，用候选材料处理的皮肤细胞中所述MAP17基因表达水平的显著降低可表明所述候选材料可被有效地用于改善皮肤屏障功能、促进皮肤保湿、或防止皮肤衰老。因此， 所述MAP17基因表达水平变化的检测可用于筛选改善皮肤功能的材料。在另一个实施方案中，聚丝蛋白基因也可被用作标记物。在该情况下，用于筛选的方法还可包括检测所述聚丝蛋白基因表达水平的变化。当用候选材料处理皮肤细胞时，与未处理的皮肤细胞组相比，所述聚丝蛋白基因的表达水平可增加。所述聚丝蛋白基因表达水平的增加可能对皮肤屏障功能的改善有显著的效果。通过转录后修饰过程，聚丝蛋白可以被降解为若干亲水氨基酸。所得的氨基酸库构成天然保湿因子(NMF)，其帮助维持角质层的湿润。然而，最近发现聚丝蛋白基因的突变可导致皮肤保湿因子的减少、皮肤屏障功能的损坏、皮肤防御能力的降低、以及通过T辅助细胞活化的急性或慢性炎症。在这点上，如下列实施例所证明的那样，本发明人首次发现聚丝蛋白基因的表达与MAP17基因的表达水平相关。他们确定了如果MAP17基因的表达增加，则聚丝蛋白基因的表达水平可降低。MAP17基因的结构如下。膜结合位点出现在氨基端(N端)，而PDZ [突触后密集区蛋白(PSD95)，果蝇disc large肿瘤抑制物(DlgA)，和紧密粘连蛋白-1 (zo_l)]结构域结合位点出现在羧基端(C端)。位于MAP17C端的PDZ结构域结合位点提供了各种蛋白_蛋白相互作用的可能性，并且可能通过其进行信号转导。具体来说，本发明人已经确定，与全长MAP17过表达时相比，当MAP17基因的C端片段被过表达时，MAP17基因的表达可被进一步提高，而聚丝蛋白基因的表达水平则可相应地显著减少。由于可以通过MAP17基因的表达直接和/或间接地调节聚丝蛋白基因(其涉及皮肤屏障功能的改善)的表达水平，则验证了 MAP17基因表达水平的调节也与皮肤屏障功能的改善密切相关，并且所述表达水平的调节可有效地被用于筛选改善皮肤功能的材料。在(c)中，诱导MAP17基因表达水平变化的候选材料被挑选作为用于改善皮肤功能的材料。本发明人已经确定了 MAP17基因表达水平的变化与皮肤功能的改善之间的关系， 并选择MAP17基因作为标记物，其可用于筛选改善皮肤功能的材料。在(c)中，例如，如果用候选材料处理皮肤细胞，则降低MAP17基因表达水平的候选材料可被挑选为用于改善皮肤功能的材料。皮肤功能的改善可以是指，例如，皮肤屏障功能的改善、皮肤保湿的促进、皮肤衰老的预防、或皮肤不适的改善，这是通过降低MAP17基因表达水平的方法。发明实施方式现在将描述实施例。下列实施例只是用于说明目的，而非旨在限制本公开的范围。^MM 1 :由炎症相关白介素引fe的MAP17iS因表汰的夺化人角质形成细胞(人表皮新生的角质形成细胞)购自Lonzadnc. (ffalkersville, MD, USA)，并按照厂商的推荐进行传代培养。在(X)2培养箱中于37°C和5% CO2的条件下温育细胞。根据Lonza，Inc.的指导制备细胞培养物。将KGM_2bullet试剂盒[牛垂体提取物(BPE,2mL)、人表皮生长因子(hEGF，0. 5mL)、胰岛素(0. 5mL)、氢化可的松(0. 5mL)、运铁蛋白(0. 5mL)、肾上腺素(0. 5mL)、庆大霉素硫酸盐+两性霉素B (GA-1000，0. 5mL)]添加到 KBM-2 (Clonetics CC-3103)培养基中(500mL)。未经任何处理的培养的人角质形成细胞被用作对照组。对于试验组，在添加 IFN-Y (200 单位 /mL),或 IL-4、IL-6、IL-17A、IL-17F 或 IL-22 (50ng/mL)后将人角质形成细胞进一步培养M小时。源自不同T辅助(Th)细胞的白介素购自R&D Systems (Minneapolis,丽，USA)，并根据厂商的指导将其制备为溶液。在白介素处理 M小时后，用IOmL的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)将细胞洗涤两次，并使用Trizol试剂 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从细胞分离总 RNA。使用 Qiagen RNeasy 试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)将分离的 RNA 再纯化一次，并使用 Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)验证 RNA 质量。 使用 Superscript Reverse Transcriptase(RT)II 试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)从分离的 RNA 合成 cDNA，并通过实时逆转录聚合酶链反应(Q-RT-PCR)的方法定量分析膜结合蛋白17(MAP17)和聚丝蛋白基因的表达。利用iTaqMan 基因表达测定试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)评价MAP17(Hs00173779_ml)和聚丝蛋白(Hs00856927_gl)的表达模式的变化(其是人角质形成细胞的分化标记基因)，并显示于图1。从图1可以见，源自Thl、Th2和Thl7细胞的白介素显著增加MAP17基因的表达 ㈧。相反，它们抑制聚丝蛋白基因的表达(B)。实施例2 由MAP17过表达引起的聚丝蛋白基因表达的定量具有MAP17 基因的克隆(Clone id :hmu001988)购自 Korea UniGene (21C Human Gene Bank, Genome Research Center，KRIBB，Daejeon，Korea)。为了在哺乳动物细胞中表达MAP17基因，通过聚合酶链反应(PC 扩增全长MAP17 (1-345的碱基对，115个氨基酸) 和羧基端(C端)片段(177-345的碱基对，55个氨基酸)。全长基因的N端引物是5' -GAA GAA TTC ATG TCG GCC CTC AGC-3'，包括EcoRl限制性内切酶位点。以及，C端片段的N端引物是5' -GAA GAA TTC GAG CCT GCA CAC ATG-3'，包括EcoRl限制性内切酶位点。全长MAP17基因和C端片段的C端引物是5' -GAA CTC GAG TTA CAT CGG GGT GCT-3 ‘，包 Xhol限制性内切酶位点。PCR混合溶液包括0. 1 μ g DNA模板，0. 2mM dNTP，0· 2μΜ引物和 0. 5 单位 Taq DNA 聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)(图 2，A)。PCR条件为95 V 1分钟；30个循环的95 V 1分钟、55 V 30秒、和72 V 1分钟；然后72 °C 5分钟。使用QIAquik PCR纯化试剂盒Oliagen，USA)纯化PCR产物，并使用 pcDNATM4/His 载体(Invitrogen, Carlsbad, CA)以及 EcoRl 和 XhoI 限制性内切酶将其在37 °C片段化(fragment) 2小时。使用T4 DNA聚合酶在16 °C过夜进行质粒连接。在质粒连接后，将产物转化到DH5 α细胞内，使细胞在包含50yg mL—1氨苄青霉素的 Luria-Bertani (LB)琼脂培养基中生长。从生长的细胞集落制备新重组的质粒，并通过DNA 测序确认结果(图2，B)。在37°C和5% CO2的条件下，在包含10%胎牛血清(FBS)和抗生素(Cambrex， ffalkersville, MD, USA)的 Dulbecco ‘ s 改良 Eagle ‘ s 培养基(DMEM)中培养人角质形成细胞(HaCaT 细胞系，获自 Dr. N. E. Fusenig, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg，Germany)。将所述HaCaT细胞在6孔板上以2X104细胞/cm2培养。24小时后，使用FuGENE6转染试剂来转染Iug的MAP17全长质粒和C端片段质粒。M小时后，更换细胞培养基。转染72小时后，用IOmL PBS将细胞洗涤两次，并使用Trizol试剂 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从细胞分离总 RNA。使用 Qiagen RNeasy 试剂盒 ^!iagen， Valencia, CA)将分离的 RNA 再纯化一次，并使用 Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara，CA，USA)验证 RNA 质量。使用 Superscript RT II 试剂盒 (Invitrogen, Carlsbad, CA)从分离的RNA合成cDNA，并通过Q-RT-PCR的方法进行定量分析。利用TaqMan 基因表达测定试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)评价 MAP17(Hs00173779_ml)和聚丝蛋白(Hs00856927_gl)的表达模式的变化(其是人角质形成细胞的分化标记基因)，并示于图3。从图3可见，当全长MAP17和C端片段过表达时，MAP17基因的表达显著增加(A)。 相反，与全长MAP17过表达时相比，当MAP17C端片段过表达时，聚丝蛋白基因的表达显著降低(B)。实施例3 人参皂苷-Re对MAP17和聚丝蛋白基因表达水平调节的证实用多种材料处理各种人角质形成细胞，并监测MAP17和聚丝蛋白基因表达的变化。研究了人参皂苷-Re (—种源自人参的果实的ginsenoid)是否调节MAP17和聚丝蛋白基因的表达。人角质形成细胞购自Lonza，Inc.，并在37°C和5% CO2的条件下的(X)2培养箱中于KBM-2培养基(Clonetics CC-3103)中培养。未经任何处理的培养的人角质形成细胞被用作对照组。对于试验组，在添加人参皂苷-Re(IOuM)后将人角质形成细胞进一步培养M小时。人参皂苷-Re购自 Wako (Kanagawa, Japan)，并根据厂商的指导制备为溶液。在人参皂苷-Re处理完M小时后，用IOmL PBS将细胞洗涤两次，并使用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从细胞分离总RNA。使用Qiagen RNeasy 试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)将分离的 RNA 再纯化一次，并使用 Agilent 2100 BioAnalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)验证 RNA 质量和浓度。使用 Superscript RT II 试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)从分离的 RNA 合成cDNA，并通过Q-RT-PCR的方法定量分析基因表达的变化。利用TaqMan 基因表达测定试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)评价 MAP17 (Hs00173779_ml)和聚丝蛋白(Hs00856927_gl)的表达模式的变化，并示于图4。从图4可见，人参皂苷-Re显著降低人角质形成细胞中MAP17基因的表达(A)。相反，它增加人角质形成细胞中聚丝蛋白基因的表达(B)。尽管已经说明和描述了示例性的实施方案，本领域技术人员应当了解，可以对其做出形式和细节的各种变化，而不脱离所附权利要求所定义的本公开的精神和范围。此外，可以进行许多修改以使特定的情况或材料适应本公开的教导而不脱离其实质范围。因此，本公开不限于具体的示例性实施方案(预期作为实现所述公开的最佳方式而公开)，而本公开将包括落入所附权利要求范围内的全部实施方案。
权利要求
1.一种筛选用于改善皮肤功能的材料的方法，包括用候选材料处理皮肤细胞；检测膜结合蛋白17(MAP17)基因的相对表达水平的变化; 以及挑选诱导所述基因表达水平变化的候选材料作为用于改善皮肤功能的材料。
2.如权利要求1所述的筛选用于改善皮肤功能的材料的方法，其中所述皮肤细胞是人角质形成细胞。
3.如权利要求1所述的筛选用于改善皮肤功能的材料的方法，其中，在所述挑选用于改善皮肤功能的材料时，降低MAP17基因表达水平的候选材料被挑选为用于改善皮肤功能的材料。
4.如权利要求1所述的筛选用于改善皮肤功能的材料的方法，其中用于改善皮肤功能的材料改善皮肤屏障功能、促进皮肤保湿、防止皮肤衰老、或改善皮肤不适。
全文摘要
筛选用于改善皮肤功能的材料的方法，包括(a)用候选材料处理皮肤细胞；(b)检测膜结合蛋白17(MAP17)基因的相对表达水平的变化；以及(c)挑选诱导所述基因表达水平变化的候选材料作为改善皮肤功能的材料。也即，基于MAP17基因表达水平的变化，使用MAP17基因作为标记物来筛选用于改善皮肤功能的材料。可有效地筛选出用于改善皮肤功能的材料，其可用于改善皮肤功能、促进皮肤保湿、防止皮肤衰老或改善皮肤不适。
文档编号C12Q1/68GK102209790SQ200980144493
公开日2011年10月5日 申请日期2009年8月28日 优先权日2008年11月7日
发明者卢旻秀, 吕炫周, 朴宣美, 李炯昊, 申东旭, 金汉坤 申请人:株式会社爱茉莉太平洋