一种同时检测24个运动相关基因上32个snp位点多态性的方法

专利名称：：一种同时检测24个运动相关基因上32个snp位点多态性的方法
技术领域：
：本发明涉及一种同时检测24个运动相关基因上32个SNP位点多态性的方法，属于医学分子生物学领域。
背景技术：
：早在1997年，Collins等(谢峰，徐峰，黄杨卿等，单核苷酸多态性与肝细胞癌遗传易感性，肝脏，2006，11(6)413-415)就提出了“常见疾病，常见变异”的假说，认为常见疾病的易患性是由于人群中某些位点，特别是在基因编码区或调控区的常见变异引起的。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的发生频率大于1%，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入或缺失等表现形式。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上，是人种之间、个体之间差异的遗传物质基础之一。SNP作为一种遗传标记得到广泛应用，主要源于以下几个特性(1)密度高SNP在人类基因组平均密度估计为500lOOObp，在整个基因组的分布达300万个以上，遗传距离为23cm，其密度比微卫星标记高出几个数量级，可以在任何待研究基因的内部或附近提供一系列标记。(2)代表性某些SNP可能在转录、翻译、拼接以及RNA稳定性等方面发挥重要作用，而某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或者表达水平，因此它们可能代表疾病遗传机制中的某些作用因素。(3)遗传稳定性SNP来源于数千年前发生的突变，随着人类世代繁衍稳定地遗传至今，和微卫星等重复序列多态标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性。(4)易测定性通常SNP都是二等位多态性，又称双等位基因标记，检测时能通过简单的“+/_”进行基因分型，而无需进行基因片段长度的分析，所以SNP的检测分析可以实现自动化。具备以上优点，SNP被认为是继第一代限制性片断长度多态性和第二代微卫星多态性之后的第三代分子遗传标记。目前已有多种方法可用于SNP检测，如微测序法、等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。这些技术虽在某种程度上能完成对SNP的检测，但由于它们必须通过凝胶电泳进行检测，因此，距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。DNA芯片技术是近年来新开发的一种DNA序列变异检测工具。DNA芯片大小与计算机上的CPU芯片相似，以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片，芯片上铺了一层肉眼看不见的DNA纤维“地毯”，即具有特定碱基序列的探针。待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上。由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。在我们的研究中，单核苷酸多态性检测采用的是液相芯片技术，仪器是贝克曼公司的GenomeLabSNPstream。该技术运用经典的单碱基引物延伸技术，结合多重PCR技术及荧光标记技术，同时引入384孔液相芯片杂交技术，原理简单，结果可靠，准确性超过了DNA测序，且每个SNP基因型分析只需170ng的DNA样本。主要优点有①更高、更灵活的通量384孔杂交芯片，每孔可同时检测48个SNP位点。每日检测通量可达4，608-800,000个SNP位点。384孔板上的每一个孔内都预先固定了48个序列已知的独特的寡核苷酸片段及4个对照标记(Tag)。板上的每一个Tag片段都能与48个含有Tag互补序列的SNP延伸引物中的一个互补，再加上4个对照的寡核苷酸片段，以确保结果的准确性。单碱基引物延伸反应完成后，将被转移到已含有特定寡核苷酸序列的微阵列芯片板上，由于Tag芯片技术能够严格按照已知的Tag序列设定杂交条件，所有杂交反应都是动态的液相杂交，良好的均一性和引物的高度特异性使得Tag芯片拥有比其它SNP筛查技术更高的准确性、杂交效率及重现性。②真正的多重SNP检测每对PCR引物及一个SNP延伸引物都由在线软件www.Autoprimer.com自动引物设计软件来完成。该软件可同时完成48对PCR引物及48个SNP延伸引物的设计以保证多重SNP检测的成功。每个设计完成的SNP延伸引物都自动连接有特定的Tag标签序列，此序列与预先种植在每个384孔板内的寡核苷酸探针序列互补，以便进行SNP位点的精确检测。③更低的成本，更高的效率5μ1的反应体系、48重的PCR反应不仅仅降低了PCR反应的费用，还提高了效率，其最终的结果既保证了一致，又可使每个SNP基因分型的成本降到最低。④更少的DNA用量，更精确的基因分型2ng的DNA可用于48个SNP位点的检测，准确率在99%以上。由于单个延伸的碱基带有荧光标记，检测结果可由荧光芯片扫描仪上的双色荧光读出并分析。由于SNP位点在基因组中数量多，分布稳定，且是一种双等位基因标记，易于使用高通量、自动化的技术平台检测。这一技术一定会在SNP与疾病的相关研究中发挥重要的作用。
发明内容(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种同时检测24个运动相关基因上32个SNP位点多态性的方法。这些基因和位点为ACE(rs4461142)，CKMM(rsl133190),ADRB2(rsl042718、rsl042713),ADRA2A(rs3750625)，GDF8(rs3791783)，CNTF(rs2515362)，HLA-A(rs3823342)，KCNA4(rs1323860)，CASQl(rs3747621)，CFTR(rs4148724)，PPARGClA(rs768695)，AMPDl(rs2268701)，ACTN3(rs540874)，BDKRB2(rs2069578)，IGF-I(rs972936,rs7956547)，UCP2(rs660339)，LEPR(rsl2037879、rsl2029311)，FABP2(rsll935130)，LEP(rsl2706832,rsll761556)，N0S3(rs3918188、rs7830)，MYLK(rs820325、rsl350152)，CNTFR(rs6476455),COLlAl(rs2586488、rs2696247)禾口VDR(rs4334089、rs4760648)。检测过程中，多重PCR是一个非常难控制的过程，它存在引物间、引物和产物间、及产物间的相互影响，降低这种影响是非常关键的问题。我们采用BECKMAN公司提供的在线引物设计软件autoprimer，同时设计32个位点的引物，它可以同时考虑到32对引物之间及引物和产物间的相互作用，使设计结果更可靠。实验结果也证实我们的多重引物体系效果显著，是不可多得的多重PCR体系。(二)技术方案本发明所述方法的基本原理为运用经典的单碱基引物延伸技术，结合多重PCR技术及荧光标记技术，同时引入384孔液相芯片杂交技术，原理简单，结果可靠，准确性超过了DNA测序。本发明所述的方法，它包括下述步骤(1)提取基因组DNA采用Promega公司基因组DNA试剂盒提取外周血DNA，然后用DU800检测DNA纯度及浓度，-80°C冰箱保存。(2)设计引物文献报道血管紧张素转换酶I(ACE)、肌酸激酶(CKMM)、胰岛素样生长因子-l(IGF-l)、β2肾上腺素受体(ADRB2)、睫状神经营养因子(CNTF)、腺苷-磷酸脱氨酶1基因(AMPDl)等基因的单核苷酸多态性可能和人的运动能力紧密相关(RankinenT.BrayMS,HagbergJM,etal.TheHumanGeneMapforPerformanceandHealth-RelatedFitnessPhenotypes:The2005Update.MedSciSportsExerc,.2006,38(11)1863-1888.)。从Hapmap等网站上查阅这些基因上我们感兴趣SNP位点的标识号码，如rs4362、rs4461142、rsl133190和rsl042718等，将32个这样的rsnumber数字做成ExcelfiiAi^jifflWl^#autoprimer(http//www.autoprimer.com/)，i&i十弓|_，设计完后针对每个SNP位点有三条引物，分别是上游引物、下游引物和单碱基延伸引物(以下简称延伸引物)(见表1)，序列交由公司合成，PAGE胶纯化，-20°C储存备用。表1本发明针对24个基因的32个SNP位点所设计的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(3)准备基因组DNA实验前将所有样品DNA稀释到10ng/yL左右。(4)稀释引物PCR引物稀释将合成好的上游引物和下游引物分别稀释到240ymol/L，然后各取5yL加入到一个新的离心管中，作为新的多重PCR引物池，每条引物终浓度为2.5iiM。延伸引物稀释将合成好的所有单碱基延伸引物分别稀释到240i!mOl/L，然后各取10yL加入到一个新的离心管中，混合在一起，作为新的延伸引物池，每条延伸引物终浓度为5iiM。(5)PCR反应每块384板用量如下所示_合计1350iiL向384板每孔内加入3uL配好的PCRmix,再将稀释好的DNA加入到对应的孔内，每孔加2uL。然后进行如下反应程序①95°C15min94°C30sec、引物(每个2.5iiM)脱氧核糖核苷酸(每个10mM)10XPCR缓冲液IIMgCl2(25mM)金牌酶5U/mL双蒸水45uL20uL225uL450uL45uL565uL②55°C30sec1min40个循环72。C③4°C保存这一步实际是一个32重的PCR反应，同时扩增出32个SNP位点附近的序列,(6)PCR反应后纯化程序应程序按照下表中的体系，配制纯化试剂核酸外切酶I(10U/iiL)90uL虾碱性磷酸酶(1U/uL)448uL10X虾碱性磷酸酶缓冲液135uL双蒸水667uL合计1350iiL将PCR反应后的384板，再加入配置好的纯化试剂，每孔3uL，然后进行如下反应37°C30min(2)960ClOmin③4°C保存这一步是去掉反应体系中残留的引物等短核苷酸片段。(7)单碱基延伸反应按照下表所示的体系配置SNPware引物延伸反应混合物延伸稀释液(购自BECKMAN公司)延伸引物20X延伸荧光试剂(购自BECKMAN公司)双蒸水DNA聚合酶1692.5uL13.5uL90.OuL1336.5uL9.4uL合计3150.OuL向纯化好的每个孔中加入7yL配置好的引物延伸反应混合物，然后进行如下反96°C3min94°C20sec②}46个循环40°C11sec③4°C保存这一步是每个SNP位点的单碱基延伸引物与SNP位点上游序列结合，然后延伸到SNP位点停止下来，因为每条单碱基延伸引物在合成时就加上了与杂交板上已知序列互补结合的标签，所以在后续实验中可以识别每个位点的信息。(8)杂交杂交板是一块384孔板，可以同时在上面进行384个样品的实验。将引物延伸反应后的体系加入杂交液(50uL杂交试剂加到850uL杂交缓冲液中)，然后加到SNPware杂交板上，放入一个密封的盒子中，放在温箱中孵育。温箱温度设为42°C，孵育时间为2h(+/-15min)。(9)杂交反应结束后，清洗杂交板并用GenomeLabSNPstream仪器扫描，用配套软件分析数据并导出所得结果。本发明所述的方法用于检测运动相关的32个SNP位点的多态性。用本发明同时检测24个运动相关基因上32个SNP位点多态性的方法检测的32个单核苷酸多态性位点，运动员组的结果为ACE:rs4461142T>C,CKMM:rsll33190T<C,ADRB2:rsl042718C>A、rsl042713A<G,ADRA2A:rs3750625OA,GDF8:rs3791783T<C,CNTF:rs2515362A<G,HLA-A:rs3823342T<C,KCNA4:rsl323860T<C,CASQl:rs3747621T<C)，CFTR:rs4148724T>C,PPARGCIA:rs768695A<G,AMPDl:rs2268701T<G,ACTN3rs540874T>C,BDKRB2:rs2069578A<G,IGF-I:rs972936A>G,rs7956547T<C,UCP2:rs660339T>C,LEPR:rsl2037879A>G,rsl2029311A>G,FABP2:rsll935130C>A,LEP:rsl2706832A>G,rsll761556C<A,N0S3:rs3918188C>A,rs7830C>A,MYLK:rs820325A>G,rsl350152A>G,CNTFR:rs6476455T<C,COLlAl:rs2586488A>G,rs2696247A<G和VDR:rs4334089A>G,rs4760648T>C。(三)有益效果本发明所述的方法通过优化引物，实现可以同时检测32个运动相关的SNP位点多态性，该方法与直接测序的检测方法相比，效率高，操作快，成本低，结果判断直观，可用于大量样品的快速检测。本发明实验所用引物由赛百胜公司合成，脱氧核苷酸购自日本TaKaRa公司，金牌扩增酶购自瑞士Roche公司，外切酶I购自新英格兰BioLabs公司，虾硷性磷酸酶及其缓冲液、灭菌双蒸水购自美国Promega公司，其余试剂、溶液及杂交板等除已标注来源外均购自美国BeckmanCoulter公司。实施例以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1检测对象选择及样本的采集用本发明所述的方法同时检测运动员共856名，男495名，女361名。非运动员对照284名，男161名，女123名。运动员均为运动成绩优秀者，他们来自省级运动队或国家运动队。正常对照样品为解放军总医院健康体检中心留取的20-30岁的健康男性和女性的血标本。提取基因组DNA采用Promega公司基因组DNA试剂盒提取所采集到的外周血样的DNA，然后用DU800检测DNA纯度及浓度，-80°C冰箱保存。检测标本的32个SNP位点的单核苷酸多态性。结果，成功得到了此32个SNP位点的单核苷酸多态性，并分析他们的基因型频率和等位基因频率，发现运动员和对照组之间确实存在明显的单核苷酸多态性差异如表2和表3。表2所有运动员和正常对照组的基因型统计分析表W运动员-对照卡方~_XXXYYY_XXXYYY_rs783031040213890133501.33390.5133rs391818836639682119122310.7706|0.6802rs8203254453149213810638、1.80110.4063rs97293626342413472147492.61350.2707rs3750625239241914241242.53060.0000rs54087419427310096127410.70930.7014rs66033923841918683133630.36990.8312rs433408926143314799131482.15540.3404rsl270683244532475148100280.64550.7241rs269624786385371361281130.64550.3669rs382334225128128583110872.37340.3052rsll7615564929850423971592.22040.3295rs446114225042717083146490.83290.6594rs647645516943122846133934.78740.0913rsl042718336396114124118392.10380.3493rs476064814936214183135565.79420.0552rs379178347299405261081452.89740.2349rs76869550330395221091211.75820.4151rs4148724353362135109111615.00500.0819rsl35015221343518670136570.13320.9356rs251536271323347351409511.24420.0036rs7956547272525698721971.55990.4584rs226870117540624157127760.04940.9756rsll9351304453344516099103.03600.2191rs206957812338831447115981.60750.4477rsl32386064332440241101360.64450.7245rsl20293114602393415310967.52940.0232rsl20378795252525217074150.45850.7951rsl042713122017328489736.87730.0000rs3747621103363329291301091.11080.5739rs258648824742417379140600.16800.9194rsll331902816628013851550.40240.8177表3所有运动员和正常对照组的等位基因统计分析表^运动员jZ^_XY_XY_rs783010226783132331.33590.2478rs391818811285603601840.07780.7803rs82032512044983821821.82710.1765rs9729369506922912452.09540.1477rs37506257192593254531.51880.0000rs5408746614733192090.67390.4117rs6603398957912992590.04210.8374rs43340899557273292270.98010.3222rsl270683212144743961560.00670.9348rs269624755711272003541.70420.1917rs38233427838512762840.31190.5765rsll76155639613061434151.28930.2562rs44611429277673122440.32810.5668rs64764557698872253194.26130.0390rsl04271810686243661960.7320.3922rs47606486606443012472.87580.0899rs379178339311091603981.30390.2535rs76869543011201533511.27970.2580rs414872410686323292333.28010.0701rsl3501528618072762500.11650.7329rs2515362465101721033010.0440.0015rs79565473061390884661.34630.2459rs22687017568882412790.02070.8856rsll93513012244244191192.82990.0925rs206957863410162093110.52030.4707rsl32386046012121583820.6190.4314rsl202931111593074151210.62290.4300rsl203787913023564141040.46040.4975rsl0427134436610424244.51480.0000rs374762156910211883480.08850.7661rs25864889187702982600.16180.6875rs!133190222726111395_0.40980.5221序列表<110>中国人民解放军总医院<120>一种同时检测24个运动相关基因上32个SNP位点多态性的方法.<160>96<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs820325SNP位点的上游引物<400>1GCACAAAAATAGCCCCAAG19<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs820325SNP位点的下游引物<400>2TCTCCTGCCTGCCCCTTC18<210>3<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs820325SNP位点的延伸引物<400>3CGATCACCTCACTAGAACAAGTCATGTACACAAGGGTAGGGCAGA45<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs972936SNP位点的上游引物<400>4TCCATGGAAGTGTTTTCTGC20<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs8972936SNP位点的下游引物<400>5AAGGGGTCTCTTTCTCTTAGCC22<210>6<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs972936SNP位点的反向延伸引物<400>6ACAAGAACTCCATGACTCAATATCTGGCCTGAACTTCTGCATTTC45<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3750625SNP位点的上游引物<400>7TTACCTAGCCCTGGCTAATTC21<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3750625SNP位点的下游引物<400>8ATGTGTGCTATCAAAAATAGTGTATATTTAC31<210>9<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3750625SNP位点的反向延伸引物<400>9CTAACTAAGCTACGCCGACAAGCGGGGGATGGGGAGGGCAGGCAG45<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs540874SNP位点的上游引物<400>10ATGGAGATGAGGCAAGCTC19<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs540874SNP位点的下游引物<400>11GGCTGGAGACCAAGCCTG18<210>12<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs540874SNP位点的延伸引物<400>12TACCTATGACCAGCAAGCACGTCATCAGGCTCCATCATCCCATTC45<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs660339SNP位点的上游引物<400>13ATGGAGATGAGGCAAGCTC19<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs660339SNP位点的下游引物<400>14GGCTGGAGACCAAGCCTG18<210>15<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs660339SNP位点的延伸引物<400>15TACCTATGACCAGCAAGCACGTCATCAGGCTCCATCATCCCATTC45<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4334089SNP位点的上游引物<400>16TCTGAGATGGGCAGGGCT18<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4334089SNP位点的下游引物<400>17ACTAATAACCTAGAAGATGGAGACG25<210>18<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4334089SNP位点的延伸引物<400>18CAGAATAGCCACGCCTAGATCTCCACCAGGCAGCTCCGGTCCCAT45<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2706832SNP位点的上游引物<400>19CTGCTTCAGTAGCACTCAGAGG22<210>20<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2706832SNP位点的下游引物<400>20ATCAGCTGTCTGCCTGAGC19<210>21<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2706832SNP位点的反向延伸引物<400>21CAGAACATCCTCAGAAGCAACTGCCATTTTCTTAGAGTTAAAAGA45<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2696247SNP位点的上游引物<400>22TTCACCTGGAGGACCAGC18<210>23<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2696247SNP位点的下游引物<400>23TGGTCTCTTCCAGATTCTAAACC23<210>24<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2696247SNP位点的延伸引物<400>24CAAGCAACGACCTACTACAAACCAGGGAGACCCTGTAGGTGGGAA45<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs7830SNP位点的上游引物<400>25CCTCTGTCCCTAGATTGTGT20<210>26<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs7830SNP位点的下游引物<400>26ATTCTGGCAGGAGCGGCT18<210>27<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs7830SNP位点的延伸引物<400>27AATAAGCTCACCACCGTCAAACTCCCTTCAGGCAGTCCTTTAGTC45<210>28<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3823342SNP位点的上游引物<400>28TGCCCAGGGCTCTGATGT18<210>29<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3823342SNP位点的下游引物<400>29AAAGAAACCCCATAGCACAG20<210>30<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3823342SNP位点的反向延伸引物<400>30GCAAGCCATCAGCTAATACACACCCAACACACATTAGGTCCTCCA45<210>31<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3918188SNP位点的上游引物<400>31CCCAGCTGAAGCATTTAAAA20<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3918188SNP位点的下游引物<400>32TGAAGGGCAGCTCGGTGG18<210>33<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3918188SNP位点的延伸引物<400>33CACGACAAGACAACAGATACTGGGAGCAAGGCACACGTACAAGGG45<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll761556SNP位点的上游引物<400>34TTTTGTTGGAAGGTTTGGTG20<210>35<211>31<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll761556SNP位点的下游引物<400>35TACTCTTAACTCCTTTAATATCAAACTTCTT31<210>36<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll761556SNP位点的延伸引物<400>36CGCAGAAGCAACTCACTTCTGGCAGAGAAAGAAGAGACAGGAGGG45<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4461142SNP位点的上游引物<400>37TCAGCCAAGTCCAGATCAG19<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4461142SNP位点的下游引物<400>38GAGATGGGAGTTTTCAGTCCA21<210>39<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4461142SNP位点的延伸引物<400>39CCATAACAACTTACCAGCCACTCTCACTTGAGACAGGAAGAGGAC45<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs6476455SNP位点的上游引物<400>40GATATGAGCCCCACAACGT19<210>41<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs6476455SNP位点的下游引物<400>41TACACAAAGACTAGGAGTTTAAAGTTCA28<210>42<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs6476455SNP位点的延伸引物<400>42CAACAAGACATAACAACGCAGTAAGCCCCTAGACCCTAGAAGGAG45<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl042718SNP位点的上游引物<400>43TGTGTCAGGCCTTACCTCC19<210>44<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl042718SNP位点的下游引物<400>44GTCTCATTGGCATAGCAGTTG21<210>45<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl042718SNP位点的延伸引物<400>45GATCCATCAACAGACATCACCTTGCCCATTCAGATGCACTGGTAC45<210>46<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4760648SNP位点的上游引物<400>46TTGAATAATTTTCCTAGTGGAGAAC25<210>47<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4760648SNP位点的下游引物<400>47TTTGTCTAACATGGCTACAAAGAG24<210>48<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4760648SNP位点的延伸引物<400>48GCAACATAAGACCGCTCAACAGCTCTGTATCATGCACAGATGGAA45<210>49<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3791783SNP位点的上游引物<400>49AATGCTAAGGCAGCTCAGAA20<210>50<211>30<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3791783SNP位点的下游引物<400>50TGTATATATTTCTTTGTGGAATACTCCTAA30<210>51<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3791783SNP位点的反向延伸引物<400>51CCACTCAACTCCACGAATACCTCCTAATAAAATTTCAAGTTACAT45<210>52<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs768695SNP位点的上游引物<400>52TTTGGTCTTTACTGAGTTTTTTTCA25<210>53<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs768695SNP位点的下游引物<400>53TTGAAGCCAGTGTAATTTAAGAATT25<210>54<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs768695SNP位点的延伸引物<400>54ACAATCAACATACGAACAGCAATTACAGTCTCAATCATAAAAAAC45<210>55<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4148724SNP位点的上游引物<400>55TAAGAGTCTTGTGTTTTCTTCCG23<210>56<211>27<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4148724SNP位点的下游引物<400>56TATAAACATGCTTATGGTATAAATGGG27<210>57<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs4148724SNP位点的延伸引物<400>57AACATACAGACGCACTCCTCTACAAACTCTTCCCCCTTGTCAACA45<210>58<211>27<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl350152SNP位点的上游引物<400>58AAAAGAAGAAGAAAAAAAGAATGTCTG27<210>59<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl350152SNP位点的下游引物<400>59AGTGAGTGAGTGATTGATTGAATG24<210>60<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl350152SNP位点的延伸引物<400>60CAACAATACGAGCCAGCAAGCAACAGCTAAGGCAGGCATCCAGAA45<210>61<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2515362SNP位点的上游引物<400>61TATAAGCCGTGCCCAACC18<210>62<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2515362SNP位点的下游引物<400>62TGAACTTTGGAAGCTGGG18<210>63<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2515362SNP位点的反向延伸引物<400>63CCAGATCCTCACCATGTAAGATGTTTAGTAATACAGCCTGGTTTT45<210>64<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs7956547SNP位点的上游引物<400>64AAAGTCTTTAAGCAAGCTCAGTGT24<210>65<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs7956547SNP位点的下游引物<400>65ATATCACTTTACATTGAGACCACCC25<210>66<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs7956547SNP位点的反向延伸引物<400>66CCGCCAGTAAGACCTAGACGTTCAGAATGCTCACTCAGTATCACT45<210>67<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2268701SNP位点的上游引物<400>67TAATGTGTAGCATTGGTCAAACA23<210>68<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2268701SNP位点的下游引物<400>68AAGTTATGAATCAATTCCTGTCATC25<210>69<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2268701SNP位点的延伸引物<400>69AGACTTCTACGCAAGCACTGAGATAATACATGATATGACTTAGTA45<210>70<211>29<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll935130SNP位点的上游引物<400>70TTGTGCAATATATAATGTAGACAAACTTC29<210>71<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll935130SNP位点的下游引物<400>71AAATGATTTCTGCTCTATTTCATTG25<210>72<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll935130SNP位点的延伸引物<400>72ACAACTCACGCAAGTACCATTGGCTTCTTCAGTTAGTGAAGGAGA45<210>73<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2069578SNP位点的上游引物<400>73AGAAGAAGGGCACATTCCTG20<210>74<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2069578SNP位点的下游引物<400>74ATTGCTGTCTGATCCACTGG20<210>75<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2069578SNP位点的延伸引物<400>75TACAAGCACGCACTAGACATTATCCCAGATGAACTTGGAAGTGAA45<210>76<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl323860SNP位点的上游引物<400>76AAGAGCCATGTGGGCCAT18<210>77<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl323860SNP位点的下游引物<400>77AATATTTTCAAGAGTATGGGGCA23<210>78<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl323860SNP位点的延伸引物<400>78TCCAGAATAGACAACAGACGGTGGAGAGAGGAAAAATAATTGAGT45<210>79<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2029311SNP位点的上游引物<400>79TCATCATTTACACCTCAAATCTTTT25<210>80<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2029311SNP位点的下游引物<400>80ACGAGTTAGACTAGAATGATGGTGA25<210>81<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2029311SNP位点的延伸引物<400>81CAACAAGTAATCCGCAGACTGTTGTAGCTTTGAATAATAGTCTTC45<210>82<211>25<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2037879SNP位点的上游引物<400>82AATTAAAAACACACAAGCACACATA25<210>83<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2037879SNP位点的下游引物<400>83ATGGAAACACATAAAGTGCAATT23<210>84<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl2037879SNP位点的延伸引物<400>84CAGCCATCCATTCACTATCTGCAGAACACAGTACAGAAAATTGCC45<210>85<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl042713SNP位点的上游引物<400>85TCACCTGCCAGACTGCGC18<210>86<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl042713SNP位点的下游引物<400>86ACACCTCGTCCCTTTCCT18<210>87<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsl042713SNP位点的延伸引物<400>87ATCTAACGCACCTACGACCTCAGCGCCTTCTTGCTGGCACCCAAT45<210>88<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3747621SNP位点的上游引物<400>88AGGAGGTGGGTGGGGCAA18<210>89<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3747621SNP位点的下游引物<400>89ATGATCCCAGGCTTCCCA18<210>90<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs3747621SNP位点的延伸引物<400>90CTCAGACTACGAATCCACGTATGTGGGGCCCCGGTGATTATCAAA45<210>91<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2586488SNP位点的上游引物<400>91GCGGAAGTTCCATTGGCA18<210>92<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2586488SNP位点的下游引物<400>92CCGTGGCCCCGCCGTAAGTA20<210>93<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs2586488SNP位点的反向延伸引物<400>93CAGCACTATTACCATCACGTTACCCTGCTGTGTCCCCCATGCCTT45<210>94<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll33190SNP位点的上游引物<400>94TCCTGATCTCCCACCCGC18<210>95<211>18<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rsll33190SNP位点的下游引物<400>95TTGATGCTGCGGCCAGTG18<210>96<211>45<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述本发明设计用于扩增rs1133190SNP位点的反向延伸引物<400>96ATACCTACCACGCTACAGCCGGACGCGGCTGCTGAGCACGTAGTT4权利要求一种同时检测24个运动相关基因上32个SNP位点多态性的方法，其特征在于它包括下述步骤(1)确定24个运动相关基因上的单核苷酸多态性位点，这些基因和位点为ACErs4461142，CKMMrs1133190，ADRB2rs1042718，rs1042713，ADRA2Ars3750625，GDF8rs3791783，CNTFrs2515362，HLA-Ars3823342，KCNA4rs1323860，CASQ1rs3747621，CFTRrs4148724，PPARGC1Ars768695，AMPD1rs2268701，ACTN3rs540874，BDKRB2rs2069578，IGF-1rs972936、rs7956547，UCP2rs660339，LEPRrs12037879、rs12029311，FABP2rs11935130，LEPrs12706832、rs11761556，NOS3rs3918188、rs7830，MYLKrs820325、rs1350152，CNTFRrs6476455，COL1A1rs2586488、rs2696247和VDRrs4334089、rs4760648；(2)设计每个单核苷酸多态性位点的PCR引物和单碱基延伸引物见序列1-96所述引物序列，交由生物技术公司合成；(3)收集国家优秀运动员的抗凝全血标本，提取基因组DNA，-80℃冷冻保存。当标本量达到一定数量后，进行后续的实验步骤；(4)在PCR仪上进行多重PCR以扩增目的序列，并进行多重单碱基延伸反应；然后与样品板上已有探针进行杂交反应；最后通过基因分型系统对每个标本中的单核苷酸多态性位点进行基因分型、分析、导出数据。全文摘要本发明提供了一种同时检测24个运动相关基因上32个SNP位点多态性的方法。它运用多重PCR、液体芯片和核酸杂交的方法在同一反应体系中实现了同时对32个单核苷酸多态性位点的检测。本发明所述的方法与传统的测序等其他检测方法相比，具有高通量，快速，自动化程度高，准确度和灵敏度高等优点。文档编号C12Q1/68GK101805790SQ20101010075公开日2010年8月18日申请日期2010年1月26日优先权日2010年1月26日发明者李立青,田亚平申请人:中国人民解放军总医院