专利名称：利用中肋骨条藻快速评价钻井液生物毒性的方法
技术领域：
本发明涉及钻井液的生物毒性评价方法，具体地说是利用中肋骨条藻快速评价钻 井液生物毒性的方法。
背景技术：
钻井液是一种由水以及各种化学处理剂组成的极其复杂的多相稳定胶态悬浮体， 其生物毒性主要来源于钻井液各组分。对于钻井液的生物毒性评价的研究始于20世纪60 年代，已发展了包括96h急性毒性和慢性毒性等多种评价方法，所采用的受试生物体多种 多样，包括糠虾、发光细菌、中肋骨条藻(如Skeletonema costatum，即本工作所选用的中 肋骨条藻)、桡脚类、蚤类和鱼类以及双贝类软体动物、片脚类动物。美国等国家主要检测 钻井液的毒性，以欧洲经济合作与发展组织(OECD)为代表的组织和国家则要求同时检测 钻井液及其组分的毒性。目前国内外对废弃钻井液的毒性检测及分级评价方法尚无统一标 准。20世纪70年代中期美国环保局(EPA)和石油工业协会(API)共同制订了巴西拟 糠虾(Mysidopsis bahia)%h急性毒性实验法，是美国环保局批准的钻井液毒性评价的唯 一方法，也是美国试验与材料学会(ASTM)和美国石油工业协会推荐的钻井液毒性的评价 标准。由于美国EPA推荐使用的巴西拟糠虾在我国无分布，我国学者致力于寻找新的可以 替代糠虾的受试生物。与美国EPA糠虾法的96h急性毒性试验时间相比，发光细菌法和发光海藻法测量 时间大大缩短。其中发光细菌法是根据发光细菌的发光度随样品毒性总体浓度的增高而呈 线性降低的特性，测定发光细菌在接触样品15min后的发光量，得出样品的毒性水平。该检 测方法具有简易、快速、实时的特点，但由于多数钻井液的黑褐色在发光细菌的发光波段有 吸收，需要校正才能应用。另外，该方法与糠虾法的相关性较低，仅为0.3。而发光海藻法采 用专用的毒性检测仪，如QwikLiteTM 200，利用夜光发光藻Pyrocystis lunula作为测试 物种，当海藻接触到污染物时，水中的毒性会杀死海藻，从死亡率预测污染物对人体和生态 环境危害的严重性，4 证时即可得出钻井液的毒性结果。但是发光海藻在实验室培养较 为困难，并且要求钻井液贮备液的PH在7. 5-8. 0，通常钻井液贮备液的pH值往往超出此范 围。2001年我国颁布的国家标准《海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法》GB/ T18420. 2-2001规定采用对虾的仔虾、卤虫幼体或蒙古裸腹蚤中的一种进行毒性实验。 《海洋石油勘探开发污染物生物毒性分级》GB/T18420. 1-2001规定，对于属于一级海区的渤 海、莱州湾，生物毒性容许值为3X 104mg · L-1，当96hLC50大于或等于3X104mg · L-1时，则 钻井液为符合生物毒性要求，可直接排放入海；小于3X 10 -Γ1时，为不符合生物毒性要 求，判定为有毒。在国家标准推荐的三种模式生物中，卤虫易保存、易孵化，是非常好的毒性 试验生物，但钻井液需要其与作用足够长的时间，如才能显示毒性。因此，寻求敏感生物指示物，其在短时间内与钻井液作用所显示出的毒性与国家 标准卤虫法试验得到的毒性具有好的相关性，从而建立钻井液毒性快速评价方法，乃实际生产所急需。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用中肋骨条藻快速评价钻井液生物毒性的方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为首先，选取渤海海域优势藻种中肋骨 条藻作为毒性试验的生物；第二，研究钻井液对中肋骨条藻的EC50与96hEC5(l的关系；第 三，研究快速评价指标以国家标准GB/T18420. 2-2001中卤虫法^hLC5tl的相关性。具体为(1)按体积比取1份钻井液加入9份海水，搅拌静置后取上层混悬液做为贮备液；(2)选择中肋骨条藻进行培养，中肋骨条藻的培养条件为(20士 l)°C，4000LuX，明 暗周期12 l i，F/2培养基；接种后密度为4X104个/mL;培养4d至平稳期，得到进入平 稳生长期后的中肋骨条藻藻液；(3)将贮备液加入盛有藻液的锥形瓶中进行混合培养；以每个锥形瓶中液体体积 为140mL计，藻液体积为IOOmL,所加入的贮备液体积从0至40mL梯度变化，每个浓度设置 4个平行样；若混合容器中藻液与贮备液的体积不足的，以过滤灭菌后的天然海水补充至 140mL ；(4)在和从锥形瓶中取样，测定680nm处的藻叶绿素荧光强度；(5)以未加贮备液的藻荧光强度作为对照，计算中肋骨条藻的相对死亡率中肋骨条藻的相对死亡率=(未加钻井液的藻荧光强度-加钻井液的藻荧光强 度)/未加钻井液的藻荧光强度；(6)半数有效浓度EC5tl的计算根据中肋骨条藻的相对死亡率，利用Microsoft Excel 2003软件分别绘制中肋骨 条藻死亡率与钻井液浓度关系曲线，得出中肋骨条藻致死率为50%所对应的钻井液贮备液 的体积V(mL)，根据EC50 = 0. IVX 1. 02X 103/0. 14(单位:mg .L-1)计算相应时间的EC50值， 其中，钻井液贮备液的密度近似地取海水密度1. 02g · mL—1。(7)根据中肋骨条藻的EC50值按照国家标准确定钻井液有无毒性。本发明具有如下优点1.快速。本发明建立的利用中肋骨条藻对水基钻井液毒性的评价方法，比常规 96h生物毒性实验时间缩短了 89h。2.准确。对钻井液的生物毒性评价结果与卤虫96h LC5tl的一致。具体实施实例本发明采用的技术方案工艺流程为(1)钻井液贮备液配制；(2)中肋骨条藻的培养；(3)不同种类钻井液对中肋骨条藻的和96h的毒性试验；(4)不同种类钻井液对卤虫96h的毒性试验；(5)基于中肋骨条藻的钻井液毒性快速评价方法与卤虫法的相关性。本发明主要研究内容包括(1)探讨钻井液对中肋骨条藻的几EC50与96h EC50的关系；
(2)考察钻井液对中肋骨条藻的EC5tl与水基钻井液对卤虫的96hLC5(1的相关性。实验包括样品准备、中肋骨条藻驯化培养、钻井液对中肋骨条藻毒性实验、钻井液 对卤虫幼体的毒性实验、钻井液毒性评价等五个部分。1.钻井液贮备液的制备按照中国国家标准《海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法》(GB/ T18420. 2-2001)配制。钻井液贮备液的制备按体积比取1份钻井液加入9份海水，3000r/min搅拌 15min，静置60min后取上层混悬液做为贮备液。本发明试验了胜利油田钻井院研制和现场使用过的6种不同种类的水基钻井液 样品及8种不同种类的钻井液用处理剂。2.中肋骨条藻驯化培养(1)中肋骨条藻来源渤海海域分离，驯化培养。(2)中肋骨条藻的培养预先驯化、接种中肋骨条藻，使其生长同步。培养确定培养条件为(20士 1)°C， 4000-7000Lux,明暗周期12h 12h，F/2培养基。接种后密度为4X IO4个/mL ；培养4d至
平稳期。本实验和中肋骨条藻毒性实验过程中使用的过滤海水以及锥形瓶、烧杯、量筒等 玻璃器具均经过高压灭菌处理。清洁海水经过滤灭菌后使用。3.钻井液对中肋骨条藻毒性实验培养中肋骨条藻2. 4L至平稳生长期，均分为M瓶，每瓶的体积为IOOmL,分别加 入钻井液贮备液0、5、10、20、30、40mL(四个平行样)，用过滤灭菌海水将藻液体积统一到 140mL ；在和时间取样，测定藻液在Em = 680nm处的荧光强度数值。4.钻井液对卤虫幼体的毒性实验(1)设置1个空白对照组和6个钻井液浓度梯度组50、1X102、2X102、5X102、 2. 5 X IO3U X104mg · Γ1 ；每组4个平行样。取80mL海水分别加入28个IOOmL烧杯中，分 别加入一定量的钻井液贮备液，用玻璃棒搅勻，将烧杯置于恒温槽中保持温度为27V。(2)加入卤虫为减少移取卤虫时吸取大量水分改变钻井液的浓度，吸去盛放卤 虫的烧杯中多余的水分，使卤虫聚集于烧杯底部。用胶头滴管随机吸取健康、趋光性好的卤 虫幼体，然后小心移入实验烧杯中，每个烧杯中投放10个，尽量减少分放的时间。(3)卤虫死亡和生长记录每隔一定时间记录卤虫幼体的死亡数目，持续96h。死 亡标准为在GL系列连续变倍体视显微镜下沉到烧杯底部的幼体在1 内仍不能游动者即 认为已死亡，移去死亡个体，将死亡个体数记录在原始记录表内。5.毒性评价(1)中肋骨条藻的相对死亡率的计算以未加钻井液的藻的荧光强度作为对照，计算中肋骨条藻的相对死亡率中肋骨条藻的相对死亡率=(未加钻井液的藻荧光强度-加钻井液的藻荧光强 度)/未加钻井液的藻荧光强度；(2)半数有效浓度EC5tl的计算半数有效浓度EC5tl 半效应(致死)浓度(EC5tl)是指在一定时间内，实验系统中或某一生态系统中50%的实验生物或某一生物种群表现出可观察到的不良效应(或死亡)时 毒性物质的浓度。原始实验数据经上述计算得到中肋骨条藻死亡率，利用MicrosoftExcel 2003软件绘制几和96h的中肋骨条藻死亡率与钻井液浓度关系曲线，根据EC5tl = 0. 1VX1. 02X1070. HOng·!/1)计算各时间的EC5tl值，式中V(mL)是关系曲线得出的致死 率50%对应的钻井液贮备液的体积；钻井液贮备液的密度近似地取海水密度1. 02g · mL—1。(3)钻井液毒性结果根据我国国家标准《海洋石油勘探开发污染物生物毒性分级》(GB/ T18420. 1-2001)，对于属于一级海区的渤海、莱州湾，生物毒性容许值为3X 104mg化―1，以此 衡量钻井液是否有毒。当中肋骨条藻^1EC5tl大于或等于3X 104mg -Γ1时，则钻井液为符合 生物毒性要求，可直接排放入海；小于3X IO^ig · Γ1时，为不符合生物毒性要求，判定为有实验结果按上述方法，分别试验了 6种不同种类的水基钻井液样品及7种钻井液用处理剂， 得到如下结果(1)中肋骨条藻在快速评价钻井液的生物毒性与评价钻井液的生物毒性结 果一致，其中有毒的水基钻井液对中肋骨条藻的96hEC5(1和^1EC5tl的比值在0. 43 1。据 此提出了以中肋骨条藻^1EC5tl快速评价钻井液急性毒性的方法，该方法重现性理想。(2)中肋骨条藻法与国标卤虫法存在相关性，相关系数R大于0.9。结论本发明建立的中肋骨条藻法对水基钻井液的毒性评价结果与卤虫的96h LC5tl的一 致，比常规96h生物毒性实验时间缩短了 89h，且能够在现场使用。
权利要求
利用中肋骨条藻快速评价钻井液生物毒性的方法，其特征在于
1.实验室培养中肋骨条藻，中肋骨条藻的培养条件为(20士l)°C，4000Lux，明暗周期 12 :12h, F/2培养基；接种后密度为4X IO4个/mL ；培养4d至平稳期，得到进入平稳生长期 后的中肋骨条藻藻液；
2.按体积比取1份钻井液加入9份海水，搅拌静置后取上层混悬液做为贮备液；
3.将钻井液贮备液藻液加入进入平稳生长期后的中肋骨条藻藻液中，以每个锥形瓶中 液体体积为140mL计，藻液体积为IOOmL,所加入的贮备液体积从0至40mL梯度变化，每个 浓度设置4个平行样；若混合容器中藻液与贮备液的体积不足的，以过滤灭菌后的天然海 水补充至140mL ；
4.后取样，测定680nm处的藻叶绿素荧光强度；
5.以未加贮备液的藻荧光强度作为对照，计算中肋骨条藻的相对死亡率中肋骨条藻的相对死亡率=(未加钻井液的藻荧光强度-加钻井液的藻荧光强度)/ 未加钻井液的藻荧光强度；
6.半数有效浓度EC5tl的计算根据中肋骨条藻的相对死亡率，利用Microsoft Excel 2003软件分别绘制中肋骨条藻 死亡率与钻井液浓度关系曲线，得出中肋骨条藻致死率为50%所对应的钻井液贮备液的体 积 V(mL)，根据 EC50 = 0. IVX 1. 02X 103/0. 14(单位:mg · L-1)计算相应时间的 EC50 值，其 中，钻井液贮备液的密度近似地取海水密度1. 02g · mL—1。
7.根据中肋骨条藻EC5tl值按照国家标准确定钻井液有无毒性。
全文摘要
本发明公开了一种钻井液的生物毒性评价的方法，具体地说是利用中肋骨条藻快速评价钻井液生物毒性的方法，将钻井液贮备液加入平稳生长期的中肋骨条藻液中，7h后取样测定680nm处的藻叶绿素荧光强度；以未加贮备液的藻荧光强度作为对照，计算中肋骨条藻的相对死亡率，利用Microsoft Excel 2003软件绘制中肋骨条藻死亡率与钻井液浓度关系曲线，根据7h EC50值按照国家标准确定钻井液有无毒性。本发明建立的中肋骨条藻对钻井液的毒性评价结果与卤虫的96h LC50的一致，比常规96h生物毒性实验时间缩短了89h。
文档编号C12Q1/02GK102134582SQ201010100558
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月25日 优先权日2010年1月25日
发明者何兴贵, 周守菊, 张妍, 李公让, 杨景利, 薛玉志 申请人:中国石化集团胜利石油管理局钻井工艺研究院, 中国石油化工集团