专利名称：血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的应用的制作方法
血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的应用
技术领域：
本发明涉及医学分子生物学技术领域，更具体地讲，涉及血浆miR-208a在急性心 梗诊断早期标志物中的新用途。
背景技术：
MicroRNA (miRNA)是一类仅有18 25个核苷酸的内源性非编码小RNAs，广泛存 在于各种生物体内。miRNA通过与靶基因mRNA 3’非翻译区(3’ -UTR)结合，降解或抑制 mRNA翻译，调控靶基因的表达，参与调控多种生物学功能。1993年，Ambros首先在线虫中 发现了一段非编码的单链小分子RNA-lin4，具有调节线虫发育时相的作用。随后近20年的 科学研究，在人体中已发现了 721条miRNA(Sanger miRbase 14. 0)，这些miRNA在人体的许 多生命活动中起着重要的调节作用。真核生物的miRNA具有高度的序列保守性，表达时序性和组织细胞特异性等特 点。近年来的研究表明心肌特异性表达的miRNA在心肌细胞分化，心脏发育和功能维持中 扮演着重要角色。2007年，zhao等通过选择性敲除miR-1基因，发现miR-1能通过调控转 录因子Hand2的表达影响心脏的发育过程。同年，miR-1，miR-133a，miR-208等心脏中重要 的miRNA调控心肌肥厚病理进程也陆续被发现。这些科学发现说明miRNA表达水平的变化 与组织器官的发育以及其正常生理活动密切相关。近两年来，科学发现miRNA不仅在细胞内调节机体生理病理进程，而且还存在于 体液中，如血浆，脑脊液等。2008年，Mitchell等首先发现许多miRNA稳定存在于血浆中，其 中miR-141的水平可作为前列腺癌诊断的标志物。随后疾病诊断标志物的探索内容中增加 了 miRNA的研究，并且一些miRNA也陆续被研究发现可作为肿瘤，组织损伤等疾病的诊断标 志物，如miR-9^i可作为结肠癌的诊断标志物，miR-122可作为药物肝损伤的监控标志物。心血管疾病是危害人类健康的严重疾病，是造成死亡的主要原因之一。目前，在我 国居民的死亡谱中，心血管疾病已经成为仅次于恶性肿瘤的第二号杀手。急性心肌梗死是 由于持续而严重的心肌缺血而引起的部分心肌急性缺血性坏死，是心血管疾病中的一种非 常严重的疾病类型，死亡率较高，据统计，约有1/3 1/2的患者在送至医院之前死亡。因 此，心梗的早期诊断对于疾病的治疗具有重要作用。目前用于诊断急性心肌梗塞的标志物主要有肌钙蛋白troponin，肌酸激酶CK，肌 红蛋白Mb等，其中肌钙蛋白troponin在急性心梗后(3 6h)血中浓度很快升高，被认为是 目前最好的诊断标志物，已成为急性心梗的诊断“金标准”。但对于心梗早期(胸痛池内) 病人的诊断，目前尚无良好的特异标志物可用，因此寻找能用于早期诊断急性心梗的标志 物具有广阔的市场前景。
发明内容本发明的目的是提供血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的新用途。本发明的研究基础
1.人心脏中特异性表达的miRNA筛选与鉴定用经典的trizol法(美国MRC公司，cat. no. TRl 18)分别提取大鼠和人各组织的 总RNA，通过miRNA文库、miRNA基因芯片、Northern Blot、real_timePCR等技术，筛选并 鉴定了心肌特异表达的 miRNA (miR-208a、miR-499、miR-1、miR-133a)。图 1 为 miR_208a、 miR-499、miR-l、miR-133a 在大鼠各组织中的 Northern Blot 结果，miR_208a 和 miR-499 仅 在大鼠心肌中表达，miR-1和miR-133a仅在大鼠心肌和骨骼肌中有表达。图2为miR_208a、 miR-499、miR-l、miR-133a 在大鼠(A)和人(B)各组织中的 real-time PCR 结果，miR_208a 在大鼠和人的心肌中表达；miR-499除了在心肌表达外，在骨骼肌中也有微小的表达； miR-1和miR-133a在大鼠和人的心肌与骨骼肌组织中表达，且在骨骼肌的表达量比在心肌 中更高。这4个miRNAs在其他组织均无表达。 2.血浆总RNA的提取方法血浆中的RNA存在于一种相对特殊的环境，血浆中蛋白质，糖类等物质含量较多， 因此血浆的预处理和RNA的提取都不同于常规的方法。本发明对血浆采用两步离心的方 法，去除了血液中的血细胞以及细胞碎片，并采用美国MRC公司的产品TRI Reagent BD( — 种专门抽提血浆或血清中RNA的试剂)，按照其操作规程，并经过一定的优化，用来提取血 浆中的RNA，可用来作定量检测。由于血浆中RNA检测目前并无合适的参照可用，本方法在 RNA提取过程中添加了外源性的参照cel-miR-39和cel-miR-238 (线虫中表达的miRNA，在 人体内无该序列)，并在检测目标miRNA的同时，也对血浆中表达最高的miRNA(miR-451和 miR-16)进行了检测，以便于保证real-time PCR检测的准确性。血浆样本预处理方法抽取不同个体的血液，收集于EDTA抗凝管中，先经4°C， 820g离心10分钟，去除血细胞，上清再经4°C，16000g离心，去除细胞碎片，最后取上层血浆 于1. 5ml RNase/DNase-free的离心管中，在此，_80°C冻存备用。RNA抽提的具体步骤如下1.每例个体取 200μ 1 血菜，加入 750μ 1 TRI Reagent BD(cat. no. TB126)和 20 μ 1醋酸(5mol/L)，混勻后，剧烈振荡30秒，室温静置5分钟。2.加入200μ1氯仿，振荡混勻，室温静置5分钟，4°C，12000g离心15分钟。3.抽取等体积上清液，加入等量的外源性参照物cel-miR-39和cel-miR-238，混 勻后加入核酸共沉剂，再混勻后加入异丙醇，_20°C静置30分钟，4°C，12000g离心15分钟。4.弃上清，加入75%乙醇(DEPC处理水配制)清洗沉淀，4°C，7500g离心5分钟。5.弃上清，于室温晾干后加入DNase/RNase-free的水充分溶解，用分光光度计测 定所得RNA的浓度。3.血菜 miRNA 的 real-time PCR 检测使用美国应用生物公司的miRNA检测试剂盒(包括反转录试剂盒，特异性miRNA 引物及探针，荧光定量检测试剂盒等)检测miR-208a和其他参照miRNA的相对水平。具体 过程如下1.反转录反应使用 TaciMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Ρ/Ν 4366596)和目标miRNA特异性反转录引物进行反转录反应，具体操作如下1)配制反应体系2μ 1提取的血浆总RNA，0. 15μ 1的dNIPs (各0. 25mmol/L)， 1 μ 1 的反转录酶(3. 33U/ μ 1)，0. 19 μ 1 的 RNase 抑制剂(0. 25U/ μ 1)，1. 5 μ 1 反转录缓冲液(10 X)，3 μ 1 特异性的 miRNA 反转录引物(P/N :4427975)，7. 16 μ 1 水(DNase/ RNase-free)。2)反转录反应在 Bio-rad 公司的 PCR 仪(S1000 thermal cycler)上进行 反转录反应，反应参数为:16°C，30分钟；42°C，30分钟；85°C，5分钟。2. real-time PCRTaqMan Universal PCR MasterMix (P/N :4324018) 和目标miRNA特异性探针和引物进行荧光实时定量PCR反应。具体操作如下1)配制反应体系5 μ 1反转录产物(适当比例稀释)，1μ1特异性的miRNA反 应引物和 Tac1Man 探针(P/N :4427975)，10 μ 1 TaqMan Universal PCR MasterMix, 4 μ 1 水(DNase/RNase-free)。2) Real-time PCR 反应在 Qiagen 公司的实时定量荧光 PCR 仪 (RG-3000A)上进行real-time PCR反应95°C预变性10分钟，循环参数为95°C，15秒； 60°C，1分钟，循环次数为40。所有反应重复三次，每次取固定的荧光阈值，取得的平均值即 为该样品中目标miRNA的Ct值。3. real-time PCR结果的分析用上述方法可测得的样品血浆中目标miRNA和参 照 miRNA(如 miR-16, miR-451, cel-miR-39 等)的 Ct 值。以 cel-miR-39 为参照，求得其 它miRNA在血浆中的相对含量，以PCR检测中经典的2_Δα的方式表示血浆中miR_208a的 水平(Δ Ct为目标miRNA与参照cel-miR-39的Ct值之差)。4.血浆中miRNA的表达分布作为一个良好的疾病诊断标志物，首要的前提是在健康人群血浆中检测不到或者 相对稳定存在。因此本发明首先通过miRNA芯片的方法检测了 4位健康人血浆中miRNA 的表达水平，结果如图3。大约有170多种miRNA在健康人血浆中可被miRNA芯片检测到， miR-451和miR-16在健康人血浆含量最高，且相对稳定。miR_133a也能被检测，但表达较 低，而miR-I，miR-499和miR_208a都不能被检测到。同时，本发明通过更为精确的方法(real-time PCR)重点检测了 miR-208a、 miR-499、miR-1、miR_133a、miR-16 和 miR-451 在血菜中的水平，结果如表 1。Real-time PCR是一种较基因芯片更为精确的检测方法，miRNA芯片检测到高水平的miR-451和miR-16 在real-time PCR中也出现了较小的Ct值(水平较高)；并且对于miRNA检测不到信号的 miR-1和miR-499，real-time PCR也检测到了微弱的稳定信号；而miR_208a在两种检测方 法中都不能被检测到，说明miR-208a在健康人血浆中的水平极低。表1. miRNA芯片和real-time PCR检测信号的比较。
权利要求
1.血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的应用。
2.一种急性心梗诊断早期标志物，其特征在于，所述标志物为血浆miR-208a。
全文摘要
本发明公开了血浆miR-208a在急性心梗诊断早期标志物中的新用途，miRNA本身仅有18～25个核苷酸，其成熟体稳定存在于细胞浆中，因此在急性心梗后miRNA早于结构蛋白类物质(如肌钙蛋白troponin)释放进入循环血中，可在心梗早期被检测到水平的升高，作为急性心梗诊断的早期标志物。对于心梗早期(胸痛3h内)病人的诊断，目前尚无良好的特异标志物可用，因此寻找能用于早期诊断急性心梗的标志物具有广阔的市场前景。
文档编号C12Q1/68GK102134585SQ201010101280
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者朱嘉琦, 王国坤, 秦永文, 荆清 申请人:中国人民解放军第二军医大学