一种survivin及其突变体转基因酵母系统及其应用的制作方法

专利名称：一种survivin及其突变体转基因酵母系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物分子功能研究、生物制药与酶工程领域，更具体地讲，本发明一方面开发了一种研究survivin及其突变体基因作用功能的酵母模型，同时还针对基因工程制药与酶工程等领域用于外源蛋白与酶高效生产的酵母表达生产体系。
背景技术：
基因表达体系是分子生物学及生命科学研究领域的重要内容，也是基因工程药物和疫苗研制等应用领域所必需的重要生物反应器。大肠杆菌(E.coli) —直被用作表达外源基因的宿主菌，并成功地表达了多种外源蛋白，但是，它不能表达结构复杂的蛋白质，且分泌型表达产量较低，而包涵体表达产物的完全复性尚存在诸多问题，在表达产物中还常伴有内毒素成分。哺乳动物细胞、昆虫细胞表达体系虽然能够表达结构复杂的蛋白质，但其操作复杂，培养成本较高，而其表达水平通常较低，特别是在培养过程中多采用加血清培养，不但增加了成本，而且还可能带来动物源性病源微生物污染的风险(如疯牛病朊粒等)， 目前我国在基因工程药物产业化生产中，由于昂贵的造价和技术方面的原因，无血清、大规模悬浮培养动物细胞，尚难于普遍使用。而获得稳定、高效表达生产外源蛋白的转基因动、 植物，不仅操作难度较大，而且成功率又很低。由于历史的原因及酿造工业的发展，人们对酵母的遗传背景和生物学特性研究得较透彻，其表达的产物安全性易被接受。随着生物技术的日新月异的发展，酵母作为真核生物蛋白的表达体系受到广泛的研究和应用，并日趋成熟。酵母是单细胞低等真核生物，它既具有原核生物的易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性，同时又具有真核生物的蛋白质后加工能力，有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工体系，还能分泌外源蛋白到培养液中，利于纯化。因此，最近二十年来，酵母被认为是一个很有前途的真核表达体系，受到广泛的研究和应用。酿酒酵母(S. cerevisiae)是首先被用来作为外源基因的表达宿主菌，然而， 人们在应用中逐步发现S.cerevisiae表达重组蛋白具有其局限性。甲醇营养型酵母 (Methylotrophic Yeast)表达体系，作为第二代酵母表达体系，它克服了传统酿酒酵母表达体系的诸多缺点和不足，成为国内外广泛而大量生产外源真核或者结构较为复杂的原核蛋白的一个较为理想的、最具有发展前途的表达体系，是实现基因工程疫苗、抗体、酶、激素和毒素等蛋白药物产业化生产的一个重要技术平台。然而，毕赤酵母表达系统在实际应用中也存在一些缺点，其中之一是毕赤酵母发酵表达外源蛋白所用的时间长，这个过程中由于可能有甲醇的毒性和生长条件和环境的因素，使其生长活力下降，这一过程伴随有凋亡现象，而不利于外源蛋白的高效表达。为了解决这一问题，需要从酵母产生凋亡的机制为切入点，分析酵母凋亡机制和凋亡基因，期望通过选择酵母抗凋亡蛋白BirIp的同源物Survivin对毕赤酵母进行分子重组与遗传改良，实现降低酵母正常生长的死亡率和凋亡率来提高毕赤酵母的生长密度和速率，为开发生长活力强、生长周期短，耐凋亡的毕赤酵母奠定基础，使该表达系统更好地应用于外源蛋白与酶高效生产。人Survivin基因定位于17q25，全长约151Λ，该基因有14796个氨基酸，由四个外显子和三个内含子组成。Survivin有两个主要的转录起始位点，位于在起始码ATG前-72 和-57/-61处。RNA全长约1. 9Kb，其中开放读码框架区(ORF)含似9个碱基，可翻译出一个142个氨基酸的蛋白。Survivn基因缺少TATAbox区，其启动子区由一段约250个核苷酸的经典CpG岛，3个细胞周期依赖元件(cell cycle d印endent elememts, CDEs), 1个细胞周期同源区(cell cyclehomology region, CHR)和数个SPl区组成。研究发现正常和肿瘤组织中，Survivin启动子区中的CpG岛多处于非甲基化状态，因此甲基化在Survivin 表达调控中并不起主要作用。当突变掉-171及-151位的SPI序列时，Survivin的转录活性约下降63. 82%。⑶E，CHR区则与Survivin在G2/M期的周期性表达有关。利用含⑶E/ CHR区的Survivin promoter-luciferase重组质粒检测发现，在G2/M期启动子活性比自然生长细胞高5-10倍，而缺少CDE/CHR区则启动子活性不表现周期性变化。Survivin的表达可以抑制由多种刺激如i^as，TNF, VPI6，Taxol等诱导的细胞凋亡。Grossman等利用转基因技术对小鼠皮肤基底层细胞研究发现，Survivin的表达并不影响角化层细胞的分化及增殖，但可以抑制UVB照射引起的细胞凋亡。利用Survivin反义核苷酸阻断Survivin的表达可抑制细胞增殖，使caspase活性增强并导致细胞自发性凋亡。 研究还发现Survivin的突变体如Cys84_Ala及Thr!M-Ala(SurvivinT34A)均可诱导肿瘤细胞发生自发性凋亡，目前对突变体在肿瘤治疗的作用进行研究，而且己取得较好的实验结果。SurvivinT34A的基因序列及其制备方法参见中国专利200510(^6847.8 (授权公告号CN 100424096C)。Survivin的抗凋亡特性在生物进化中是高度保守的，例如果蝇中的凋亡抑制因子Deterin就与Survivin高度同源。但与其它IAP家族成员相比，Survivin抗凋亡能力相对较弱。Survivin的抗凋亡机制目前尚不清楚。IAP家族成员的抗凋亡作用主要通过直接与caspase结合而使其失活。实验表明Survivin可与caspase 9及DIABL0/SMAC结合，因此Survivin有可能通过IAP家族传统的途径抑制细胞凋亡。但Survivin是否能与 easpase-3直接结合目前尚有争论。Siin等用E. coli表达Survivin重组蛋白，发现纯化后的Survivin重组蛋白以同源二聚体形式存在并可与caspase-7及caspase-3直接结合。 Suzuki等则认为Survivin并不与caspase-3直接结合，当受到Fas刺激或细胞增殖时， Survivin可进入胞核并与cdk4结合，促使p21释放，p21可与procaspase-3结合，进而抑制Fas介导的细胞凋亡。此外与其它IAP家族成员相比，Survivn的结构中缺乏位于B^序列上游能与caspase结合的“hook”区。因此Survivin即使能与caspase结合也必定是通过与其它IAP家族成员不同的方式进行。所以survivn的抗凋亡作用是通过IAP家族的途径抑或是通过其他途径进行还需进一步研究来证实。Survivin不仅具有抗凋亡能力，还参与了细胞分裂的调节。Li等研究发现 Survivin具有周期性表达特点，而且其在纺锤体形成中具有重要作用。利用Survivin反义核苷酸进行研究时也发现，阻断Survivin的表达不仅会引起细胞发生自发性凋亡而且还会出现多极纺锤体，多核及胞质分裂失败现象。基因敲除实验则证实了 Survivin在有丝分裂中所起的重要作用。在胚胎期3. 5天时同源敲除Survivin基因会导致微管组装缺陷，纺锤体缺失，形成多核细胞，至4. 5天时胚胎死亡。对C. elegans及酵母中的与Survivin同源的IAPs分子研究发现，它们在染色体分离，晚期有丝分裂及胞质分裂等方面与Survivin 作用相类似，但无抗凋亡功能。而研究还发现使用针对Survivin的胞内抗体并不影响胞质分裂，但会影响姐妹染色体分离，微管组装失败，纺锤体有丝分裂失调。这表明Survivin不仅参与胞质分裂，而且有可能作用于有丝分裂的多个方面并在微管功能中起重要作用。多细胞生物主要是通过两个途径发生凋亡，一是“外源性”途径，主要由TNFa/ TNFRl，FaS/FaSL等介导，通过细胞膜的死亡受体而触发，如肿瘤坏死因子受体(TNF- Rl) 和FAS。另一个是“内源性”途径，即“线粒体”途径，通过线粒体释放细胞色素c和Smac/ DIABLO进行调控，由细胞内外凋亡刺激信号发动引起线粒体渗透性增加，释放细胞色素C 和SMAC/DIABL0。这两个凋亡路径通过信号转导，最后触发了细胞凋亡的中心环节caspase 的激活，形成级联反应，使细胞发生凋亡。这一途径主要被Bcl-2家族的蛋白所控制，包括分别影响线粒体动态平衡和细胞色素c释放的抗凋亡分子和前凋亡分子。而且，凋亡抑制蛋白家族(IAP)中的其他蛋白质，包括ML-IAP，XIAP，cIAPl，cIAP2，NIAP，apollon和 Survivin,能够通过抑制终末效应物caspase_3和caspase_7来阻断线粒体细胞色素c释放过程中处于下游的一个共有步骤，干扰caspase-9的活化和后续过程的进行。凋亡是多基因严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、 caspase家族、癌基因如C_myC、抑癌基因P53等，随着分子生物学技术的发展对多种细胞凋亡的过程有了相当的认识，但是迄今为止凋亡过程确切机制尚不完全清楚。活性氧(ROS)是常用的凋亡诱导剂。应用低剂量H2A处理培养的哺乳动物细胞， 可诱发凋亡级联反应。此外去除神经生长因子或钾离子，可使神经细胞产生的ROS作为凋亡通路的晚期信号，激活下流的Bax和caspases。将S. Ceresiviase用低剂量H2A处理，或耗尽其谷胱甘肽以引起氧化应激，可诱导凋亡。敲除酵母细胞的YCAl基因，增强细胞对H2O2的抵抗能力。进一步的研究发现，即使在无细胞外氧化应激存在的情况下，当酵母细胞发生凋亡时，细胞内ROS生成同样增加。 表达Bax和cdcS565G的酵母突变体，用dihydrorhodaminel23染色时显示强阳性，说明细胞内有ROS的积聚。由于氧自由基是酵母细胞凋亡所必需的，所以ROS在酵母凋亡时起重要的作用。当阻断囊泡融合形成时，酵母细胞对H2O2更加敏感，更易诱导凋亡。因此，⑶C48突变体可能通过促进自由基的产生和阻断囊泡融合这两种截然不同的、可相互协同的途径启动凋亡。而Abudugupur发现自噬细胞的死亡可能也与酵母凋亡有关，但可能是通过⑶C48 突变体相反的方式引起的。因为他发现通过诱变ADP-核糖化样蛋白1(能引起囊泡形成障碍，破坏膜转运)可阻断Bax诱导的细胞死亡，而不是促进其凋亡。研究酵母凋亡具有主要的生理学意义。ROS在调节凋亡中的重要作用可能显示了酵母细胞自杀死亡的生理意义。ROS是需氧生物在呼吸过程中产生的。由于ROS能与蛋白、 脂质、核酸发生作用，因此ROS诱导的细胞损害很常见。细胞在进化中，也形成了一套清除 ROS毒性损伤的机制，但这只能减轻损害的发生，不能完全阻止致死性的细胞损害。大多数受损伤的细胞即使已不再有繁殖能力，也能持续存活一段时间。如果这些细胞发生主动、快速的死亡将有助于为邻近细胞节省代谢能量，既使是在具有相同基因的、同一菌落的单细胞生物中。因此单细胞生物的自杀死亡可能有助于其基因组的进化。酵母细胞复制的周期是有限的，S. Cerevisiae在最适条件时的复制周期是25-35次，或大约3天，随着复制周期的增加，细胞内ROS积聚，细胞死亡，并可见典型的凋亡表现。HerKer也发现老化的酵母
5细胞死亡时细胞出现凋亡标记、氧自由基积聚、Caspase活化等。老化诱导的细胞凋亡可被 YAPl (在氧应激时出现的一个关键的转录活化因子)的表达所延滞。被YCAl (相当于哺乳动物细胞的caspase)的表达所破坏。然而凋亡机制的紊乱可减弱再生能力，在长时间的直接竞争性的实验中，野生型细胞比YCAl破坏细胞活的时间更长，提示凋亡通过清除不适应细胞，对整个种群具有“清洁”效应。有趣的是，增加肌动球蛋白动力的突变能延长酵母的生命，而降低肌动球蛋白动力增强Caspase的活性，改变线粒体功能，导致细胞死亡。人survivin中含有一个BIR结构域，而在酵母Birlp中含有2个BIR结构域。 而酵母Birlp基因相对较长，克隆和表达相对survivin略有难度，survivin相对较短，研究深入。二者均对真核细胞的凋亡有密切的关系。将人survivin及其突变体构建入酵母， 整合在其基因组上，对于研究survivin又是一个很合适的简便的模型。

发明内容
本发明的目的在于提供一种耐凋亡转基因酵母系统。本发明的第二个目的是提供一种促凋亡转基因酵母系统。本发明的第三个目的是提供所述转基因酵母系统的构建方法。本发明的第四个目的是提供所述转基因酵母系统在研究survivin及其突变体作用与功能中的应用。本发明的第四个目的是提供所述转基因酵母系统在外源蛋白与酶高效生产中的应用。为实现以上目的，本发明公开以下技术方案一种耐凋亡转基因酵母系统，其特征在于，所转基因为survivin基因，所用载体为组成型质粒pGAPZA或者诱导型质粒pPICZA。一种促凋亡转基因酵母系统，其特征在于，所转基因为survivin第34位突变体基因，所用载体为诱导型质粒PPICZA或者组成型质粒pGAPZA。转基因酵母系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤
(1)构建重组质粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin(T;34A)、pGAPZA_survivin 或者 pGAPZA-survivin(T34A)，分别对原始质粒 pREST-survivin (T34A)和 pGEM-T-survivin 进行双酶切处理，所用内切酶为EcoRI和BioI，然后利用TAKARA公司生产的"Γ4 DNA Ligase 试剂盒将基因片段和载体片段进行连接，获得重组质粒，所述载体为诱导型质粒PPICZA或者组成型质粒PGAPZA ；
(2)将步骤(1)获得的重组质粒分别利用电穿孔方式转化进入毕赤酵母，经过同源重组整合到毕赤酵母基因组中，获得目标转基因酵母系统。所述转基因酵母系统在研究survivin及其突变体作用与功能中的应用。所述转基因酵母系统在外源蛋白与酶高效生产中的应用。本发明的优点在于本发明提供的转基因酵母具有与原来不同的生长特性与用途，这既显示了 survivin及其突变体在酵母中的作用，可以此作为研究其作用与功能的一个模型，同时又获得了可以通过对毕赤酵母的分子重组与遗传改良，实现降低酵母正常生长的死亡率和凋亡率来提高毕赤酵母的生长密度和速率，从而开发出具有生长活力强、生长周期短、耐凋亡的毕赤酵母表达系统，使其更好地应用于外源蛋白与酶高效生产。


图1为pPICZA-surViVin(T34A)质粒的构建流程示意图。图 2 为 pPICZA-survivin(T34A)质粒的菌落 PCR 鉴定图，其中 1 :2000bp 的 marker ； 2 :PCR 产物。图 3 为 pPICZA_survivin(T34A)质粒的 XhoI 和 EcoRI 双酶切鉴定图。图4为pPICZA-survivin质粒的构建流程示意图。图5为pPICZA-survivin质粒的菌落PCR鉴定图。图6为pPICZA-survivin质粒的XhoI和EcoRI双酶切鉴定图。图7为pGAPZA-survivin (T34A)质粒的构建流程示意图。图 8 为 pGAPZA-survivin (ΤΙΜΑ)质粒的酶切示意图，其中，1 :pGAPZA 用 EcoRI 和 XhoI 双酶切图；2 :pREST-survivin(T34A)用 EcoRI 和 XhoI 双酶切图；3:2000 的 marker 图 9 为pGAPZA-survivin (ΤΙΜΑ)质粒的菌落 PCR 鉴定图，其中，1 :2000 的 marker; 2、3、4、5 :PCR鉴定产物。图10为pGAPZA-survivin(T34A)质粒的XhoI和EcoRI双酶切鉴定图，其中，1:用 EcoRI 和 XhoI 的双酶切图；2: 2000 的 marker 图11为pGAPZA-survivin质粒的构建流程示意图。图12为pGAPZA-survivin质粒的酶切示意图，其中，l:pGAPZA用EcoRI和XhoI的双酶切图；2 :pGEM-T-survivin 用 EcoRI 和 XhoI 的双酶切图；3 :2000bp 的 marker。图13为pGAPZA-survivin质粒的菌落PCR鉴定图，其中，1、2、3、4 :PCR产生的片段；5 :2000bp 的 marker。图14为pGAPZA-survivin质粒的XhoI和EcoRI双酶切鉴定图，其中，1:连接产物用 EcoRI 和 XhoI 双酶切图；2 :2000bp 的 marker 图15为诱导型转基因酵母PCR鉴定图。图16为诱导型转基因酵母生长曲线图。图17为MTT法测定诱导型转基因酵母凋亡抑制率，其中，正值为抑制率，而负值为促生长率。图18为诱导型转基因酵母流式细胞仪双参数点图。图19为组成型转基因酵母PCR鉴定图。图20为组成型转基因酵母生长曲线图。图21为MTT法测定组成型转基因酵母凋亡抑制率，其中，正值为抑制率，而负值为促生长率。图22为组成型转基因酵母流式细胞仪双参数点图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。实施例一诱导型重组质粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin (T34A)的构建。为了证实survivin基因的一些性质与功能，验证survivin对酵母细胞的凋亡的影响，将该基因和该基因的突变体通过双酶切以及连接反应克隆至诱导型表达载体PPICZA 中，获得重组质粒pPICZA-survivin和pPICZA-survivin (T34A)。其中两个载体分别携带目的基因survivin和其34位点的突变形式survivin (T34A)。重组质粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin (T34A)的构建采用限制性内切酶EcoRI和BioI，分别对本实验室保存的原始质粒pREST-survivin (T34A)和 pGEM-T-survivin进行双酶切处理，然后利用TAKARA公司生产的T4 DNA Ligase试剂盒将基因片段和载体片段进行连接，获得重组质粒。原始质粒pREST-survivin (T34A)和pGEM-T-survivin的制备参见中国专利 200510026847. 8 (授权公告号CN 100424096C)。pPICZA-survivin(T34A)质粒的构建流程示意图见图1。利用XhoI和XhoI双酶切pREST-survivin (T34A)，回收目标片段，用同样酶切的载体进行连接，转化大肠杆菌Dffia后，涂板于带有kocin的LLB平板上筛选阳性菌落，然后挑取阳性单菌落于5mlLLB培养基中过夜培养，抽提质粒，进行菌落PCR鉴定和B10I和 EcoRI双酶切鉴定。菌落PCR鉴定选取阳性克隆于5ml LLB培养基中过夜培养，第二天菌液在100° C煮3-5min，然后进行PCR鉴定，然后通过1%的琼脂糖凝胶电泳后，鉴定结果如图 2所示，由图2可知，PCR结果与目的片段大小基本一致，表明构建质粒中已经存在目的片段。双酶切鉴定，将PCR鉴定后的阳性克隆的菌液，提取质粒，然后进行双酶切，然后通过1%的琼脂糖凝胶电泳后，结果如图3所示。由图3可知，双酶切鉴定结果的目的片段的大小与预期一致，这已经基本确定质粒构建成功。pPICZA-survivin质粒的构建流程示意图见图4。利用BioI和BioI双酶切pGEM-T-survivin，回收目标片段，用同样酶切的载体 PPICZA连接，转化大肠杆菌Dffia后，涂板于带有kocin的LLB平板上筛选阳性菌落，然后挑取阳性单菌落于5mlLLB培养基中过夜培养，抽提质粒，进行菌落PCR鉴定和B10I和 EcoRI双酶切鉴定。在双酶切过程中，由于pGEM-T载体有两个BioI酶切位点，那么会产生 EcoRI-XhoI (1) ,EcoRI-XhoI (2)和XhoI-XhoI (3)三个片段，在此采用寻找目的片段，连接后通过测序比对完全确定目的片段是否完全连接上。菌落PCR鉴定，选取阳性克隆于5ml LLB培养基中过夜培养，第二天菌液在100° C 煮3-5min，进行PCR鉴定，然后通过1%的琼脂糖凝胶电泳后，鉴定结果如图5所示。由图5 可知，PCR结果与目的片段大小基本一致，表明构建质粒中已经存在目的片段。双酶切鉴定，将PCR鉴定后的阳性克隆的菌液，提取质粒，进行双酶切，然后通过 1%的琼脂糖凝胶电泳后，结果如图6可知，双酶切鉴定结果的目的片段的大小与预期一致， 这已经基本确定质粒构建成功。测序结果比对，将上述挑取培养的2个阳性克隆送样至公司测序。得测序结果，利用信息学比对软件，进行比对，序列完全一致。实施例二组成型重组质粒pGAPZA-survivin 和 pGAPZA-survivin(T;34A)的构建。为了验证survivin对酵母细胞的凋亡的影响，将该基因和其突变体通过双酶切以及连接反应克隆至组成型表达载体PGAPZA中，获得重组质粒pGAPZA-survivin和 pGAPZA-survivin (T34A)。其中两个载体分别携带目的基因survivin和其34位点的突变形式 survivin (T34A)。重组质粒 pGAPZA-survivin、pGAPZA-survivin (TiMA)的构建采用限制性内切酶EcoRI和)(hoI，分别对本实验室保存的原始质粒pREST-SurViVin(T34A)和 pGEM-T-survivin进行双酶切处理，然后利用TAKARA公司生产的T4 DNA Ligase试剂盒将基因片段和载体片段进行连接，获得重组质粒。pGAPZA-SUrvivin(T34A)质粒的构建流程示意图见图7。利用BioI和BioI双酶切pREST-survivin (T34A)，回收目标片段，用同样酶切的载体pGAPZA进行连接，转化大肠杆菌Dffia后，涂板于带有kocin的LLB平板上筛选阳性菌落，然后挑取阳性单菌落于5ml LLB培养基中过夜培养，抽提质粒，进行菌落PCR鉴定和 XhoI和EcoRI双酶切鉴定。酶切示意图如图8所示。菌落PCR鉴定，选取阳性克隆于5ml LLB培养基中过夜培养，第二天菌液在100°C 煮3-5min，进行PCR鉴定，然后通过1%的琼脂糖凝胶电泳后，鉴定结果如图9所示。由图9 可知，PCR结果与目的片段大小基本一致，表明构建质粒中已经存在目的片段。双酶切鉴定，将PCR鉴定后的阳性克隆的菌液，提取质粒，双酶切鉴定体系进行双酶切，然后通过1%的琼脂糖凝胶电泳后，结果如图10可知，双酶切鉴定结果的目的片段的大小与预期一致，这已确定质粒构建成功。pGAPZA-survivin质粒的构建流程示意图见图11。利用BioI和BioI双酶切 pGEM-T-survivin,回收目标片段，用同样酶切的载体pGAPZA连接，转化大肠杆菌Dffia后， 涂板于带有kocin的LLB平板上筛选阳性菌落，然后挑取阳性单菌落于5mlLLB培养基中过夜培养，抽提质粒，进行菌落PCR鉴定(图)和BioI和EcoRI双酶切鉴定。在双酶切过程中，由于pGEM-T载体有两个)(ho I酶切位点，那么会产生EcoRI-XhoI (1)、EcoRI-Xho I (2)和 XhoI-XhoI (3)三个片段，在此采用寻找目的片段，连接后通过测序比对完全确定目的片段是否完全连接上。酶切示意图如图12所示。菌落PCR鉴定，选取阳性克隆于5ml LLB培养基中过夜培养，第二天菌液在100° C 煮3-5min，进行PCR鉴定，然后通过1%的琼脂糖凝胶电泳后，鉴定结果如图13所示。由图 13可知，PCR结果与目的片段大小基本一致，表明构建质粒中已经存在目的片段。双酶切鉴定，将PCR鉴定后的阳性克隆的菌液，提取质粒，然后进行双酶切鉴定， 然后通过1%的琼脂糖凝胶电泳后，结果如图14所示。由图14可知，双酶切鉴定结果的目的片段的大小与预期一致，这已经初步部确定质粒构建成功。经过测序比对，将上述挑取培养的阳性克隆送样至公司测序。得测序结果，利用信息学比对软件，进行比对，序列完全一致。实施例三诱导型survivin与survivin (T34A)转基因酵母及其特性。采用试剂将质粒转化入酵母，采用筛选培养基YPD中的^ocin抗性浓度的使用进行筛选。按照操作步骤将涂布的平板置于30° C条件下培养4-5天，挑取长出的阳性克隆。kocin的浓度开始使用100微克/毫升，后来经几次的浓度的梯度筛选，按照25微克 /毫升进行筛选将取得最佳效果。抗性浓度太高适合筛选高通量的克隆，抗性浓度太低菌落会因为太多实验无法继续进行。酵母基因组的提取及PCR鉴定。因为酵母具有较厚的细胞壁，一般处理细菌的破壁方法，无法将酵母基因组释放出，而试剂盒成本较高，此步骤作为一个验证过程，需要简化步骤又要切实可行。经参考文献，总结出一套粗提取酵母基因组，用于PCR鉴定的模板。 首先离心取得适量菌体，加入PBS，煮沸10分钟，离心，取得上清，然后加入PBS相同体积的
9异丙醇，放置2-3分钟，12000rpm离心2分钟，倒掉上清，空气中放置5分钟，至残留异丙醇完全挥发，加入20微升TE buffer备用。按照上述PCR鉴定体系，进行PCR。得到结果图如图15所示，将PCR产物回收，送至公司测序，然后通过生物信息学比对软件进行比对，序
列完全一致。将转化好的重组酵母按照，条件进行培养，设置对照组，对照组为未进行任何突变或者转化的野生型毕赤酵母X33。按照常规方法进行取样，使用紫外-可见分光光度计测定600 nm处的吸收值。标准生长曲线以600 nm处的吸收值为纵坐标(y)，时间为横坐标(X)，绘制标准曲线，如图16所示。注意，该标准曲线测定测定过程中，可见分光光度计最高测量值为3. 000，当OD值超过3. 000时，需要使用原始的培养基进行10X，20X，30X的稀释，最后OD值需乘以相应倍数进行计算。按照MTT法的步骤测定酵母细胞的死活比率，计算在选定时间M小时、48小时、72 小时的抑制率。测定酵母凋亡抑制率过程中，注意OD的稀释问题，测定前需将酵母细胞浓度稀释至OD值为1，测定490nm时的结果。图17为MTT法测定酵母凋亡抑制率结果。在菌体培养过程中，菌液通过用培养基稀释至OD值为1，然后用MTT法测样，利用计算抑制率的公式抑制率=(突变组-对照组)/对照组，在M小时，48小时，72小时，突变组的抑制率分别为8. 815%、12. 948%、16. 859%。而未突变组的负抑制率，即促生长率为5. 466%,7. 289%、 11. 395%。流式细胞仪分析结果，将构建的毕赤酵母菌按照诱导条件培养，在90小时的时候取样，按照Armexin V vs PI的双染色法进行染色，然后用流式细胞仪上样，结果如图18所
7J\ ο由图18可以看出，001为对照组，004和005分别为含有基因survivin和 survivin (T34A)的酵母，图004中的死亡细胞的象限和凋亡细胞的象限的点均比对照组要少，而005中死亡细胞的象限区域明显比对照组要多出很多点。由此可以看出，含有基因 survivin (T34A)的酵母明显发生的促凋亡现象，导致在相同条件和情况下，酵母细胞死亡数相对较多，而含有基因survivin的酵母也能看出其死细胞的数目略有减少的现象，即证明其促生长作用。将酵母的抗凋亡蛋白Birlp的同源类似物Survivin和其突变体Survivin (T34A) 构建至原核生物和真核生物穿梭质粒PPICZA中，并将构建的重组质粒转化到毕赤酵母中， 使其同源重组，将基因片段整合到毕赤酵母X33的基因组上。毕赤酵母会以诱导形式的表达Survivin蛋白和Survivin(T34A)蛋白。按照培养毕赤酵母的最佳条件0. 5%的甲醇诱导，28° C进行培养，并测定其生长曲线，含有促生长的survivin基因的重组毕赤酵母X33 的生长率和最终稳定期菌液OD值均比含有具有促细胞凋亡的survivin(T34A)基因的重组毕赤酵母X33的OD值要高，而对照组的检测值处于二者之间。在M小时、48小时、72小时取样利用MTT法测定酵母凋亡的抑制率，突变组的抑制率分别为8. 815%、12. 948%、16. 859%。 而未突变组的负抑制率，即促生长率为5. 466%、7. 289%U1. 395%。实施例四组成型survivin与survivin(T34A)转基因酵母及其特性。重组质粒转化酵母及鉴定。酵母的转化采用的杰美公司的小量酵母转化试剂盒， 进行酵母转化质粒，在最后筛选培养基YPD中的^ocin抗性浓度的使用进行选择。按照操作步骤将涂布的平板置于30°C条件下培养4-5天，挑取长出的阳性克隆。kocin的浓度开始使用100微克/毫升，后来经几次的浓度的梯度筛选，按照25微克/毫升进行筛选将取得最佳效果。抗性浓度太高适合筛选高通量的克隆，抗性浓度太低菌落会因为太多实验无法继续进行。酵母基因组的提取及PCR鉴定。提取酵母基因组，用于PCR鉴定的模板。首先离心取得适量菌体，加入PBS，煮沸10分钟，离心，取得上清，然后加入PBS相同体积的异丙醇， 放置2-3分钟，12000rpm离心2分钟，倒掉上清，空气中放置5分钟，至残留异丙醇完全挥发，加入20微升TE buffer，备用。按照上述提及的PCR鉴定体系，进行PCR。得到结果如图19所示。将PCR产物回收，送至公司测序，然后通过生物信息学比对软件进行比对，序列完全一致。将转化好的重组酵母按照，条件进行培养，设置对照组，对照组为未进行任何突变或者转化的野生型毕赤酵母X33。按照常规方法进行取样，使用紫外-可见分光光度计测定600 nm处的吸收值。标准生长曲线以600 nm处的吸收值为纵坐标(y)，时间为横坐标(X)，绘制标准曲线，见图20。注意，该标准曲线测定测定过程中，可见分光光度计最高测量值为3. 000，当OD值超过3. 000时，需要使用原始的培养基进行10X，20X，30X的稀释，最后OD值需乘以相应倍数进行计算。菌液生长过程中，按照时间M小时、48小时、72小时取样进行测定。在菌体培养过程中，菌液通过用培养基稀释至OD值为1，然后用MTT法测样，利用计算抑制率的公式，在 24小时，48小时，72小时，突变组的抑制率分别为5. 577%、10. 401%、14. 239%。而未突变组的负抑制率，即促生长率为4. 615%,6. 721%,9. 255%，图21为MTT法测定酵母凋亡抑制率结果。将构建的毕赤酵母菌按照诱导条件培养，在90小时的时候取样，按照Armexin V vs PI的双染色法进行染色，然后用流式细胞仪上样，得到的流式细胞仪分析结果如图22所示。由图22可以看出，001为对照组，002和003分别为含有基因survivin和 survivin (34)的酵母，图002中的死亡细胞的象限和凋亡细胞的象限的点均比对照组要少，而003中死亡细胞的象限区域明显比对照组要多出很多点。由此可以看出，含有基因 survivin (T34A)的酵母明显发生的促凋亡现象，导致在相同条件和情况下，酵母细胞死亡数相对较多，而含有基因survivin的酵母也能看出其死细胞的数目略有减少的现象，即证明其促生长作用。将酵母的抗凋亡蛋白Birlp同源类似物Survivin和其突变体Survivin (T34A) 构建至原核生物和真核生物穿梭质粒PGAPZA中，并将构建的重组质粒转化到毕赤酵母中， 使其同源重组，将基因片段整合到毕赤酵母X33的基因组上。毕赤酵母会组成型的表达 Survivin蛋白和Survivin(T34A)蛋白。按照培养毕赤酵母的最佳条件进行培养，并测定其生长曲线，含有促生长的survivin基因的重组毕赤酵母X33的生长率和最终稳定期菌液 OD值均比含有具有促细胞凋亡的survivin (T34A)基因的重组毕赤酵母X33的OD值要高， 而对照组的检测值处于二者之间。在M小时、48小时、72小时取样利用MTT法测定酵母凋亡的抑制率，突变组的抑制率分别为5. 577%、10. 401%、14. 239%。而未突变组的负抑制率， 即促生长率为 4. 615%,6. 721%,9. 255%。流式细胞仪分析结果证明两种重组毕赤酵母在生长率、死亡率和抑制率具有明显的差异。实施例三中的诱导型表达的结果与实施例四中组成型表达的结果相比较，诱导型的结果显示比组成型的结果要明显，相同时间和条件下的培养菌液OD值诱导型的较高，抑制率和促生长率诱导型的较高。 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种耐凋亡转基因酵母系统，其特征在于，所转基因为survivin基因，所用载体为组成型质粒PGAPZA或者诱导型质粒pPICZA。
2.一种促凋亡转基因酵母系统，其特征在于，所转基因为survivin第34位突变体基因，所用载体为诱导型质粒PPICZA或者组成型质粒pGAPZA。
3.权利要求1或2所述转基因酵母系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤(1)构建重组质粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin(T34A)、pGAPZA_survivin 或者 pGAPZA-survivin(T34A)，分别对原始质粒 pREST-survivin (T34A)和 pGEM-T-survivin 进行双酶切处理，所用内切酶为EcoRI和BioI，然后利用TAKARA公司生产的T4 DNA Ligase 试剂盒将基因片段和载体片段进行连接，获得重组质粒，所述载体为诱导型质粒PPICZA或者组成型质粒PGAPZA ；(2)将步骤(1)获得的重组质粒分别利用电穿孔方式转化进入毕赤酵母，经过同源重组整合到毕赤酵母基因组中，获得目标转基因酵母系统。
4.权利要求1或2所述转基因酵母系统在研究survivin及其突变体作用与功能中的应用。
5.权利要求1所述转基因酵母系统在外源蛋白与酶高效生产中的应用。
全文摘要
本发明公开一种耐凋亡或促凋亡转基因酵母系统，所转基因为survivin基因或survivin第34位突变体，所用载体为组成型质粒pGAPZA或者诱导型质粒pPICZA。本发明提供的转基因酵母具有与原来不同的生长特性与用途，这既显示了survivin及其突变体在酵母中的作用，可以此作为研究其作用与功能的一个模型，同时又获得了可以通过对毕赤酵母的分子重组与遗传改良，实现降低酵母正常生长的死亡率和凋亡率来提高毕赤酵母的生长密度和速率，从而开发出具有生长活力强、生长周期短、耐凋亡的毕赤酵母表达系统，使其更好地应用于外源蛋白与酶高效生产。
文档编号C12P21/00GK102367422SQ201110008959
公开日2012年3月7日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者刘琨, 姚碧, 李林凤, 郑文云, 马兴元 申请人:华东理工大学