专利名称：基于杜氏盐藻代谢途径的β-胡萝卜素工程菌及构建方法
技术领域：
本发明涉及一种基于杜氏盐藻代谢途径构建的β -胡萝卜素工程菌及构建方法， 具体地说涉及从杜氏盐藻(Dimaliella salina)中获取八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢酶(Pds)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)、番茄红素β环化酶(LycB)等基因的 cDNA并构建出高产β-胡萝卜素的工程菌。
背景技术：
类胡萝卜素是具有共轭聚烯结构的一类物质。在医学上，类胡萝卜素具有预防和治疗心血管疾病、白内障以及某些癌症等功能。此外，类胡萝卜素也被广泛应用于动物饲料、食物和化妆品中。营养保健、医药、食品以及化妆品上的广泛应用使得类胡萝卜素在世界范围内有着较高的需求量。世界卫生组织调查发现，世界范围内因维生素A缺乏而受到失明甚至死亡威胁的学龄前儿童高达1.4 2. 5亿人。维生素A原类胡萝卜素特别是β-胡萝卜素的充足提供是解决当前难题的关键。据市场研究机构调查显示，2004年的类胡萝卜素的市场销售总额为8. 869亿美元，到2009年它将突破10亿美元。杜氏盐藻(Eukaryota 总界、Viridiplantae 界、Chlorophyta 门、Chlorophyceae 纲、Chlamydomonadales 目、 Dunaliellaceae科、Dimaliella属)在应激条件下能够大量积累β -胡萝卜素，其含量最高可超过干重的10%。因此，从分子生物学角度构建带杜氏藻类胡萝卜素合成基因的高产工程菌株有着重大的社会和经济意义。分子生物学分析显示，类胡萝卜素途径的酶是单一的基因产物，它们催化特定的反应。从番茄红素到玉米黄素或者α胡萝卜素不需要所有酶一齐起作用。此外，不同的酶组合形成的途径产生各种各样的类胡萝卜素。因此，利用杜氏藻类胡萝卜素途径的相关基因通过相关基因工程手段来构建类胡萝卜素高产菌株对提高类胡萝卜素的产量具有根本上的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于杜氏盐藻代谢途径构建的胡萝卜素工程菌及构建方法。本发明通过利用相关基因工程手段获取杜氏盐藻类胡萝卜素合成途径的八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢酶(Pds)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)、 番茄红素β环化酶(LycB)等基因的cDNA，并利用ρ15Α复制起始位点，氯霉素抗性基因以及巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子构建出质粒pDscrtB。转化大肠杆菌 (Escherichia coli)DH5 α (Bacteria 总界、Proteobacteria 门、Gammaproteobacteria
Enterobacteriales 巨、Enterobacteriaceae 禾斗、Escherichia 属、Escherichia coli 种)(细菌呈白色)后获得一种呈橙黄色的胡萝卜素高产工程菌Escherichia coli DH5a (pDscrtB)，它利用了杜氏盐藻的八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、ζ-胡萝卜素脱氢酶和番茄红素β环化酶来合成胡萝卜素。本发明的目的通过以下技术方案实现基于杜氏盐藻代谢途径构建的β “胡萝卜素工程菌的构建方法，包括如下步骤
(1)相关基因的cDNA获取从对数生长期的杜氏盐藻中提取总RNA，利用M-MLV反转录酶以18个T的寡聚核苷酸为引物进行反转录获得杜氏盐藻的总cDNA ；以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物Pl :5，_C CGCTCGAGATGCCCTCCACTTCCGGTGC-3，和下游引物P2 :5，-ATCGATCGATCATCGATCTACTGTGGGCTC TTGG-3’进行PCR扩增得到杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶Psy基因的cDNA ；以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P3 :5，_A TCGATCGACGACGCGTTCAGAACCAAGGGAAGGTGA-3，和下游引物 P4 5，-ATCGATCGACGACGCGTTCAGA ACCAAGGGAAGGTGA-3，进行PCR扩增得到杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的cDNA ；以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P5 :5，_C GACGCGTATGTTGGGACTCCATGGGATG-3，和下游引物P6 :5，-ATCGATCGCCCCTTAAGTCAAATGCTTGGA AGTG-3，进行PCR扩增得到杜氏盐藻ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds基因的cDNA;以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P7 :5，_C CCCTTAAGATGCTTCAAACACTGAGCGGTCG-3，和下游引物P8 :5，-ATCGATCGCTATTGCTGCTTTGCAGCA CTTATTG-3，进行PCR扩增得到杜氏盐藻番茄红素β环化酶LycB基因的cDNA ；(2)巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的获取从对数生长期的巴氏杜氏藻中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶，以上游引物 P9 :5，-GGTGACACTATAGGGGAAAGCTTGCATGCCTGC-3， 和下游引物 PlO :5’ -ATCGATCGCCGCTCGAGCCTACACACAGAGGAAGGAAAG-3，进行 PCR 扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子；(3)pl5A复制起始位点和氯霉素抗性基因的获取依次用内切酶Cla I在30°C下和Hind III在37°C下对质粒pVA838处理Ih后，纯化并回收DNA片段；利用T4 DNA聚合酶对获取的DNA片段进行平末端化，纯化并回收DNA产物，利用T4 DNA连接酶使DNA自身环化为质粒pcmpl5A，质粒pcmpl5A转化大肠杆菌DH5 α 进行增殖；(4)质粒的构建纯化后的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子DNA片段在Τ4 DNA连接酶作用下与经纯化和碱性磷酸酶处理过的质粒pcmpl5A的DNA片段进行连接，获得质粒pDsA ；依次用内切酶Xho I和Pvu I对质粒pDsA和纯化后的杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶Psy基因的cDNA在37°C下处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒PDsB;依次用内切酶Cla I在30°C下和Pvu I在37°C下对质粒pDsB和纯化后的杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的cDNA处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA 连接酶作用下形成质粒PDsC ；依次用内切酶Mlu I和Pvu I对质粒pDsC和纯化后的杜氏盐藻ζ _胡萝卜素脱氢酶Zds基因的cDNA在37°C下处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒PDscrtA ；依次用内切酶Afl II和Pvu I对质粒pDscrtA和纯化后的杜氏盐藻番茄红素β 环化酶LycB基因的cDNA在37°C下处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒PDscrtB ；质粒pDscrtB转化大肠杆菌DH5 α后获得β -胡萝卜素工程菌。步骤(4)所述质粒pcmpl5A的纯化和碱性磷酸酶处理是利用内切酶EcoR V对质粒pcmpl5A在37°C下处理Ih后，纯化并回收DNA片段，再用碱性磷酸酶对回收的DNA片段进行去磷酸化，纯化并回收DNA片段。所述巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的纯化是利用T4 DNA聚合酶对获取的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子进行平末端化。步骤⑴所述反转录获得杜氏盐藻的总cDNA的反应程序为42°C，lh;70°C， 15min。本发明与现有技术相比具有如下优点和有益效果该菌株在2YT培养基(1.6%蛋白胨，酵母浸出物，0.5%氯化钠，pH 7. 0)下 37°C摇瓶培养24小时的β-胡萝卜素的产率为2.6 3.2mg/g (细胞干重)。而现有菌株 Escherichia coli DH5a不产β-胡萝卜素。
图1为本发明菌株β -胡萝卜素合成流程图。图2为本发明采用质粒构建原理图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此。除特别说明外，本发明所涉及到的引物都是委托英潍捷基贸易有限公司合成。1.杜氏盐藻类胡萝卜素合成途径相关基因的cDNA获取从对数生长期的杜氏盐藻中提取总RNA，利用M-MLV反转录酶(RNaseH-)(宝生物工程有限公司，产品代号D2639S)以18个T的寡聚核苷酸为引物进行反转录获得杜氏盐藻的总 cDNA。反应程序为:42°C,lh ；70°C，15min。以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(宝生物工程有限公司，产品代号DR010S)以上游引物 Pl (5' -CCGCTCGAGATGCCCTCCACTTCCGGTGC-3')和下游引物 P2 :(5，-ATCGATCGATCATCGATCTACTGTGGGCTCTTGG-3，)进行 PCR 扩增得到杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶(Psy)基因的cDNA。反应程序为95°C预变性2min ；98°C变性10s，75°C 退火 15s, 72°C延伸 1. 5min, 30 个循环；72°C延伸 IOmin0以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(宝生物工程有限公司，产品代号DR010S)以上游引物 P3 (5，-ATCGATCGACGACGCGTTCAGAACCAAGGGAAGGTG A-3，)和下游引物 P4 :(5，-ATCGATCGACGACGCGTTCAGAACCAAGGGAAGGTGA-3，)进行 PCR 扩增得到杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因的cDNA。反应程序为95°C预变性2min ； 98°C变性 10s, 78°C退火 15s, 72°C延伸 2min, 30 个循环；72C 延伸 IOmin0以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(宝生物工程有限公司，产品代号:DR010S)以上游引物 P5 :(5，-CGACGCGTATGTTGGGACTCCATGGGATG-3，)和下游引物 P6 (5，-ATCGATCGCCCCTTAAGTCAAATGCTTGGAAGTG-3，)进行 PCR 扩增得到杜氏盐藻ζ -胡萝卜素脱氢酶(Zds)基因的cDNA。反应程序为95°C预变性2min ；98°C变性10s，73°C退火 15s，72°C延伸 2min，30 个循环；72°C延伸 IOmin0以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(宝生物工程有限公司，产品代号DR010S)以上游引物 P7 :(5，-CCCCTTAAGATGCTTCAAACACTGAGCGGTCG-3，)和下游引物 P8 :(5，-ATCGATCGCTATTGCTGCTTTGCAGCACTTATTG-3，)进行 PCR 扩增得到杜氏盐藻番茄红素β环化酶(LycB)基因的cDNA。反应程序为95°C预变性2min ；98°C变性10s， 72°C退火 15s，72°C延伸 2min，30 个循环；72°C延伸 IOmin02.巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的获取从对数生长期的巴氏杜氏藻中提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，利用 PrimeSTARHS DNA聚合酶(宝生物工程有限公司，产品代号DR010S)以上游引物P9 (5，_G GTGACACTATAGGGGAAAGCTTGCATGCCTGC-3，)和下游引物PlO (5，-ATCGATCGCCGCTCGAGCCTACA CACAGAGGAAGGAAAG-3，)进行PCR扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子。反应程序为95°C预变性2min ；98°C变性10s，75°C退火15s，72°C延伸4min，30个循环；72°C 延伸lOmin。3. pl5A复制起始位点和氯霉素抗性基因的获取依次用内切酶Cla I在30°C下和Hind III在37°C下对质粒pVA838 (DSMZ公司，产品代号4417)处理Ih后，纯化并回收DNA片段。利用T4 DNA聚合酶(宝生物工程有限公司，产品代号D2040)对获取的DNA片段进行平末端化。纯化并回收DNA产物，利用T4 DNA 连接酶(宝生物工程有限公司，产品代号D2011A)使DNA自身环化为质粒pcmpl5A。质粒 pcmpl5A转化大肠杆菌DH5ci (宝生物工程有限公司，产品代号D9057)进行增殖。4.质粒构建利用EcoR V对质粒pcmpl5A在37°C下处理Ih后，纯化并回收DNA片段。用碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)(宝生物工程有限公司，产品代号D2250)对回收的DNA 片段进行去磷酸化，纯化并回收DNA片段。利用T4DNA聚合酶(宝生物工程有限公司，产品代号D2040)对获取的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子进行平末端化。如图2 所示，纯化后的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子DNA片段在T4 DNA连接酶(宝生物工程有限公司，产品代号D2011A)作用下与纯化后的经碱性磷酸酶(宝生物工程有限公司，产品代号D2250)处理过的质粒pcmpl5A的DNA片段进行连接，获得质粒pDsA。质粒 PDsA转化大肠杆菌DH5ci (宝生物工程有限公司，产品代号D9057)进行增殖。依次用内切酶Xho I和Pvu I对质粒pDsA和纯化后的杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶(Psy)基因的cDNA在37°C下处理lh，纯化并回收DNA片段。接着两者在T4 DNA连接酶(宝生物工程有限公司，产品代号D2011A)作用下形成质粒pDsB。质粒pDsB转化大肠杆菌DH5ci (宝生物工程有限公司，产品代号D9057)进行增殖。依次用内切酶Cla I在30°C下和Pvu I在37°C下对质粒pDsB和纯化后的杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因的cDNA处理lh，纯化并回收DNA片段。接着两者在T4 DNA连接酶(宝生物工程有限公司，产品代号D2011A)作用下形成质粒pDsC。质粒pDsC转化大肠杆菌DH5ci (宝生物工程有限公司，产品代号D9057)进行增殖。依次用内切酶Mlu I和Pvu I对质粒pDsC和纯化后的杜氏盐藻ζ _胡萝卜素脱氢酶(Zds)基因的cDNA在37°C下处理lh，纯化并回收DNA片段。接着两者在T4 DNA连接酶(宝生物工程有限公司，产品代号D2011A)作用下形成质粒pDscrtA。质粒pDscrtA转化大肠杆菌DH5ci (宝生物工程有限公司，产品代号D9057)进行增殖。依次用内切酶Afl II和Pvu I对质粒pDscrtA和纯化后的杜氏盐藻番茄红素β 环化酶(LycB)基因的cDNA在37°C下处理lh，纯化并回收DNA片段。接着两者在T4 DNA 连接酶(宝生物工程有限公司，产品代号D2011A)作用下形成质粒pDscrtB。质粒pDscrtB 转化大肠杆菌DH5ci (宝生物工程有限公司，产品代号D9057)(细菌呈白色)后获得一种显橙黄色的基于杜氏盐藻代谢途径的β-胡萝卜素高产工程菌大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a (pDscrtB)，它能够高度累积β -胡萝卜素。该菌株在2ΥΤ培养基(1.6%蛋白胨，酵母浸出物，0.5%氯化钠，ρΗ 7.0)下37°C摇瓶培养24小时的β -胡萝卜素的产率为2. 6 3. 2mg/g (细胞干重)。本发明的番茄红素高产工程菌Escherichia coli DH5 α (pDscrtB)呈橙黄色，肉眼便可以把它挑选出来。该工程菌的胡萝卜素合成途径如图1所示，丙酮酸与3-磷酸-甘油醛反应生成栊牛儿栊牛儿焦磷酸，再依次利用杜氏盐藻的八氢番茄红素合成酶、 八氢番茄红素脱氢酶、胡萝卜素脱氢酶和番茄红素β环化酶通过八氢番茄红素、六氢番茄红素、胡萝卜素、链孢红素、番茄红素、Y-胡萝卜素等中间产物最终合成胡萝卜素。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.基于杜氏盐藻代谢途径的胡萝卜素工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤(1)从杜氏盐藻中获取相关基因的CDNA从对数生长期的杜氏盐藻中提取总RNA，利用M-MLV反转录酶以18个T的寡聚核苷酸为引物进行反转录获得杜氏盐藻的总cDNA ；以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物Pl :5，-CCGC TCGAGATGCCCTCCACTTCCGGTGC-3，和下游引物 P2 5，-ATCGATCGATCATCGATCTACTGTGGGCTCTTG G-3’进行PCR扩增得到杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶Psy基因的cDNA ；以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P3 5'-ATCGA TCGACGACGCGTTCAGAACCAAGGGAAGGTGA-3，和下游引物 P4 5，-ATCGATCGACGACGCGTTCAGAACCA AGGGAAGGTGA-3，进行PCR扩增得到杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的cDNA ；以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P5 :5，-CGAC GCGTATGTTGGGACTCCATGGGATG-3，和下游引物P6 :5，-ATCGATCGCCCCTTAAGTCAAATGCTTGGAAGT G-3’进行PCR扩增得到杜氏盐藻ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds基因的cDNA;以杜氏盐藻总cDNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA聚合酶，以上游引物P7 :5，_CCCCT TAAGATGCTTCAAACACTGAGCGGTCG-3，和下游引物 P8 5，-ATCGATCGCTATTGCTGCTTTGCAGCACTTA TTG-3’进行PCR扩增得到杜氏盐藻番茄红素β环化酶LycB基因的cDNA ；(2)巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的获取从对数生长期的巴氏杜氏藻中提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用PrimeSTAR HS DNA 聚合酶，以上游引物 P9 :5，-GGTGACACTATAGGGGAAAGCTTGCATGCCTGC-3，和下游引物 PlO :5，-ATCGATCGCCGCTCGAGCCTACACACAGAGGAAGGAAAG-3，进行 PCR 扩增得到巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子；(3)pl5A复制起始位点和氯霉素抗性基因的获取依次用内切酶Cla I在30°C下和Hind III在37°C下对质粒pVA838处理Ih后，纯化并回收DNA片段；利用T4 DNA聚合酶对获取的DNA片段进行平末端化，纯化并回收DNA产物，利用T4 DNA连接酶使DNA自身环化为质粒pcmpl5A，质粒pcmpl5A转化大肠杆菌DH5 α 进行增殖；(4)质粒的构建纯化后的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子DNA片段在T4DNA连接酶作用下与经纯化和碱性磷酸酶处理过的质粒pcmpl5A的DNA片段进行连接，获得质粒pDsA ；依次用内切酶Xho I和Pvu I对质粒pDsA和纯化后的杜氏盐藻八氢番茄红素合成酶 Psy基因的cDNA在37°C下处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒PDsB ；依次用内切酶Cla I在30°C下和Pvu I在37°C下对质粒pDsB和纯化后的杜氏盐藻八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的cDNA处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒pDsC;依次用内切酶Mlu I和Pvu I对质粒pDsC和纯化后的杜氏盐藻ζ ~胡萝卜素脱氢酶 Zds基因的cDNA在37°C下处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒PDscrtA ；依次用内切酶Afl II和Pvu I对质粒pDscrtA和纯化后的杜氏盐藻番茄红素β环化酶LycB基因的cDNA在37°C下处理lh，纯化并回收DNA片段；接着两者在T4 DNA连接酶作用下形成质粒PDscrtB ；质粒pDscrtB转化大肠杆菌DH5 α后获得β -胡萝卜素工程菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述质粒pcmpl5A的纯化和碱性磷酸酶处理是利用内切酶EcoR V对质粒pcmpl5A在37°C下处理Ih后，纯化并回收DNA片段，再用碱性磷酸酶对回收的DNA片段进行去磷酸化，纯化并回收DNA片段；所述巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的纯化是利用T4 DNA聚合酶对获取的巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子进行平末端化。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述反转录获得杜氏盐藻的总 cDNA 的反应程序为:42°C,lh ；70°C，15min。
4.一种由权利要求1 3任意一项所述的方法制得的β -胡萝卜素工程菌，菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a (pDscrtB)，呈橙黄色。
5.根据权利要求4所述的β-胡萝卜素工程菌，其特征在于，该菌株利用杜氏盐藻的八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、胡萝卜素脱氢酶和番茄红素β环化酶来合成β-胡萝卜素。
全文摘要
本发明公开了一种基于杜氏盐藻代谢途径的β-胡萝卜素工程菌的构建方法，包括如下步骤(1)从杜氏盐藻中获取相关基因的cDNA；(2)巴氏杜氏藻八氢番茄红素合成酶Psy启动子的获取；(3)p15A复制起始位点和氯霉素抗性基因的获取；(4)构建质粒pDscrtB，质粒pDscrtB转化大肠杆菌DH5α后获得β-胡萝卜素工程菌。该菌株呈橙黄色，利用杜氏盐藻的八氢番茄红素合成酶、八氢番茄红素脱氢酶、ζ-胡萝卜素脱氢酶和番茄红素β环化酶来合成β-胡萝卜素。该菌株在2YT培养基下37℃摇瓶培养24小时的β-胡萝卜素的产率为2.6～3.2mg/g(细胞干重)。
文档编号C12N15/70GK102168096SQ20111000894
公开日2011年8月31日 申请日期2011年1月14日 优先权日2011年1月14日
发明者叶志伟, 姜建国 申请人:华南理工大学