专利名称：一种高温酸性木聚糖酶xyn10c1及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温酸性木聚糖酶XYN10C1 及其基因和应用。
背景技术：
半纤维素是由D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖或D-乳糖以直链或支链聚合而成的多糖，分子主链可由一种或几种糖基组成，链短且存在侧链，并且具有多样的侧链取代基，如乙酰基、半乳糖、阿拉伯糖或葡萄糖醛酸残基。木聚糖是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。木聚糖广泛存在于在农业副产物如玉米芯、麦麸、米糠、秸秆、甘蔗渣等中，但这一重要的可再生资源一直难以得到有效的利用；而在造纸制浆过程中富含木聚糖的工业废料往往直接排入水体，导致水质富营养化从而严重破坏生态环境，这些现象在我国尤为突出。而另一方面，作为木聚糖水解产物主要成分的低聚木糖是一种附加值高，市场前景看好的功能性食品添加剂，目前已成为国内外竞相研究开发的功能性低聚糖之一。因此对木聚糖的有效利用和深层开发已成为目前国内外的研究热点。对木聚糖酶的研究已有半个世纪，主要研究集中在适合于饲料工业、食品工业、制浆造纸工业、能源工业等方面的木聚糖酶，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚糖酶，并分离出多种木聚糖酶基因，已工业化生产多种木聚糖酶产品。 其中，大多数木聚糖酶的最适作用PH值在6. 0 7. 0。酸性木聚糖酶已经引起研究人员的广泛关注，酸性木聚糖酶在饲料行业中的应用，可以有效破坏木聚糖分子中的共价交联，显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，从而降低食糜的粘度，改善饲料性能，降低因粘度增加而引起的抗营养作用(刘强和冯学琴，动物营养学报.1999，11 :6-11.)在啤酒酿造行业具有潜在的应用前景，在啤酒酿造过程中，不被降解的阿拉伯木聚糖造成啤酒过滤困难、堵塞过滤膜，增加了啤酒的生产成本和品质，采用酸性木聚糖酶与葡聚糖酶协同作用，可以解决以上问题。因此，酸性木聚糖酶的产生、纯化、性质、酸性特征的结构基础及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工、以及能源等领域的应用正在不断深入。由于不同工业对木聚糖酶性质需求不同，因此，获得新型具有优良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意义。克隆和分离具有高温酸性的木聚糖酶可以更好的应用于饲料、酿酒，食品工业。
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效应用的高温酸性木聚糖酶木聚糖酶。本发明的再一目的是提供编码上述高温酸性木聚糖酶的基因。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述高温酸性木聚糖酶的基因工程方法。
本发明的另一目的提供上述高温酸性木聚糖酶的应用。本发明从青霉(Penicillium sp)中分离得到一种新的高温酸性木聚糖酶 XYmoci。本发明提供了一种高温酸性木聚糖酶XYN10C1，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所不。SEQ ID NO. 1 MHLSSTLVAAAVLPLASAQLNELAQKAGKLYFGTATDNDELNNTEYYSIVTDTREFGQLTPANGMKWQFVEPEYNVFNFSDGAVVADLAAKDRQYLRCHNLVWESELAPWVTEMTWDKANFTAMLRQHVIGEVSHWKGRCYAWDVVNEGLNDNGTYRSDIFYDTLGEDYFKVVYQAASEADPGAKLYYNDYNIEYPGPKADAARGIVKMLQDAGIKIDGIGLESHFIVGETPTIDQQISNMEAFTAMGVEVAVTELDIRLELPATAENLAQQSDDYRTTVGACMQVKGCVGMTVWDFYDPF SWVPSTFPGY⑶ADLYFANFTKHPAYYGVVDALTNNTSKCKSGQHKPKRSKPLDV其中，该酶基因编码356个氨基酸，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列 "mhlsstlvaaavlplasa" (SEQ ID NO. 3)。因此，成熟的高温酸性木聚糖酶XYN10C1的理论分子量为38. OkDa,其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示QLNELAQKAGKLYFGTATDNDELNNTEYYSIVTDTREFGQLTPANGMKffQFVEPEYNVFNFSDGAVVADLAAKDRQYLRCHNLVWESELAPWVTEMTWDKANFTAMLRQHVIGEVSHWKGRCYAWDVVNEGLNDNGTYRSDIFYDTLGEDYFKVVYQAASEADPGAKLYYNDYNIEYPGPKADAARGIVKMLQDAGIKIDGIGLESHFIVGETPTIDQQISNMEAFTAMGVEVAVTELDIRLELPATAENLAQQSDDYRTTVGACMQVKGCVGMTVWDFYDPFSWVPSTFPGY ⑶ ADLYFANFTKHPAYYGWDALTNNTSKCKSGQHKPKRSKPLDV本发明的木聚糖酶XYN10C1同时具有好的热稳定性而在常温下在酸性和中性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性，其最适PH值为5. 0，在pH2. 0 6. 5的范围内维持50%以上的酶活性；最适温度为75°C，在50°C仍具有50%左右的酶活力；用胃蛋白酶和胰蛋白酶处理120分钟，酶活性提高了 13%以上。本发明提供了编码上述高温酸性木聚糖酶xynlOCl。具体地，该基因的基因组序列如 SEQ ID N0. 4 所示atgcatctgtcttccactctcgtcgccgccgcggtcctgccgctggcctcggcccagctcaacgagctg gcccagaaggccgggaagctgtacttcggcacggctactgacaacgacgagctgaacaacaccgagtactacagcatagtgact gacacgagggagttcgggcagctcacgccggccaacggtatgaagtggcaattcgtcgagcccgaatacaacgtgttcaacttc agcgacggcgccgtcgtcgcagacctcgccgccaaggacaggcagtacctgcgctgccacaacctggtctgggagagcgagctc gcgccgtgggtcaccgagatgacgtgggacaaggccaactttacggccatgctgcgccagcacgtcatcggggaggtgagccactggaagggccggtgctacgcctgggacgtggtgaacgagggcctcaacgacaacggcacgtaccggtccgacatctttta cgacaccctgggcgaggactacttcaaggtggtctaccaggcggccagcgaggccgacccgggcgcgaagctgtactacaacg actacaacatcgagtacccgggccccaaggccgacgccgccagggggatcgtcaagatgctccaggacgccggcatcaagat cgacggcatcgggctggagagccactteatcgtcggcgagacgcccaccatcgaccagcagatcagcaacatggaggcctt caccgccatgggcgtcgaggtggccgtgaccgagctcgacatccggctcgagctgccggccaccgccgagaacctggcccagc agagcgacgactaccgcaccacggtcggcgcgtgcatgcaggtcaagggctgtgtcggcatgaccgtctgggacttctacg atcctttttcatgggtgccgagtacatttcccggatacggggacgcggatctttacttcgccaacttcaccaagcacccggcctac tacggcgtcgtcgacgcgctgaccaacaacaccagcaagtgcaagtctggccagcacaagcccaagaggagcaagccgctggacg tgtaa本发明通过PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xynlOCl，DNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYN10C1结构基因xynlOCl全长1071bp。其中，信号肽的碱基序列为ATGCATCTGTCTTCCACTCTCGTCGCCGCCGCGGTCCTGCCGCTGGCCTCGGCC(SEQ ID NO. 6)。成熟的木聚糖酶XYN10C1的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。SEQ ID NO. 5cagctcaacgagctggcccagaaggccgggaagctgtacttcggcacggctactgacaacgacgagctg aacaacaccgagtactacagcatagtgactgacacgagggagttcgggcagctcacgccggccaacggtatgaagtggcaat tcgtcgagcccgaatacaacgtgttcaacttcagcgacggcgccgtcgtcgcagacctcgccgccaaggacaggcagtacctg cgctgccacaacctggtctgggagagcgagctcgcgccgtgggtcaccgagatgacgtgggacaaggccaactttacggccatg ctgcgccagcacgtcatcggggaggtgagccactggaagggccggtgctacgcctgggacgtggtgaacgagggcctcaacga caacggcacgtaccggtccgacatcttttacgacaccctgggcgaggactacttcaaggtggtctaccaggcggccagcga ggccgacccgggcgcgaagctgtactacaacgactacaacatcgagtacccgggccccaaggccgacgccgccagggggatcg tcaagatgctccaggacgccggcatcaagatcgacggcatcgggctggagagccactteatcgtcggcgagacgcccaccat cgaccagcagatc
agcaacatggaggccttcaccgccatgggcgtcgaggtggccgtgaccgagctcgacatccggctcgag ctgccggccaccgccgagaacctggcccagcagagcgacgactaccgcaccacggtcggcgcgtgcatgcaggtcaagggct gtgtcggcatgaccgtctgggacttctacgatcctttttcatgggtgccgagtacatttcccggatacggggacgcggatct ttacttcgccaacttcaccaagcacccggcctactacggcgtcgtcgacgcgctgaccaacaacaccagcaagtgcaagtctggccagc acaagcccaagaggagcaagccgctggacgtgtaa成熟蛋白理论分子量为38. OkDa，将木聚糖酶基因xynlOCl序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Glomerella graminicola Ml. 001 的木聚糖酶氨基酸序列一致性为53%。说明XYN10C1是一种新的木聚糖酶。本发明还提供了包含上述高温酸性木聚糖酶基因xynlOCl的重组载体，优选为 pPIC-xynlOCl。将本发明的木聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间， 使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因插入到质粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒 pPIC9-xynlOCl。本发明还提供了包含上述高温酸性木聚糖酶基因xynlOCl的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株GS115/XynlOCl。本发明还提供了一种制备高温酸性木聚糖酶XYN10C1的方法，包括以下步骤1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；幻培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10C1。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia past0ris)GS115，得到重组菌株GS115/ xynlOCl。本发明还提供了上述高温酸性木聚糖酶XYN10C1的应用。目前，青霉来源的木聚糖酶在pH 4.0 5.0条件下具有较高酶活，但在pH 3.0 下几乎没有活性，而且热稳定较差。本发明介绍的木聚糖酶XYN10C1最适pH值为5. 0，在 PH2. 0 6. 5的范围内维持50%以上的酶活性；最适温度为75°C，在50°C仍具有50%左右的酶活力，在65°C具有良好的热稳定性。本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在饲料、酿酒、食品工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适PH为5.0，在 PH2. 0 6. 5都有较高的酶活性；pH稳定性好；具有良好的抗蛋白酶的能力。其耐高温特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本木聚糖酶可应用于饲料工业，有效降低粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可有效降解可溶性何不可溶性的阿拉伯木聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。另外，在白酒、清酒的酿造中有助于提高发酵效率，提高淀粉利用率，增加酒精的产率。还可以将造纸工业废料及农业废弃物中的木聚糖可被转化为D-木糖单体，而D-木糖又可被细菌、酵母及真菌转化成有价值的燃料。因此，本木聚糖酶在能源工业中的应用也显示出其巨大的潜力。
图1重组木聚糖酶的最适pH。图2重组木聚糖酶的pH稳定性。图3重组木聚糖酶的最适温度。图4重组木聚糖酶的热稳定性。
具体实施例方式试验材料和试剂1、菌株及载体毕赤酵母表达载体PPIC9及菌株GSl 15购自于hvitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自hvitrogen公司。 桦木木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基(I)Penicillium sp.培养基为马铃薯汁培养基1000mL马铃薯汁，IOg葡萄糖， 25g 琼脂，pH2. 5。(2)大肠杆菌培养基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH7.0)。(3)BMGY 培养基酵母提取物，2%蛋白胨，1·34%ΥΝΒ，0·00004% Biotin,l% 甘油(V/V)。(4)BMMY培养基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，ρΗ4. 0。说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J-萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1 青霉Penicillium sp.木聚糖酶编码基因xynlOCl的克隆提取青霉Penicillium sp.基因组 DNA:将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨 5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，65°C水浴锅裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在 4°C下IOOOOrpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4°C下IOOOOrpm离心lOmin。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20°C备用。根据第十家族木聚糖酶基因的保守(WDVVNE和NDY(F)NL(I)EY)序列设计合成了简并引物P1，P2Pl 5' -TGGGAYGTNGTNAAYGARGC-3‘；P2 5' -TAYTCTATRTTRffARTCRTT-3‘。以 Penicillium sp. Cl CGMCC 4432 总 DNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应参数为94°C变性5min ；然后94°C变性30sec，45°C退火30sec，72°C延伸lmin，30个循环后72°C 保温lOmin。得到一约158bp片段，将该片段回收后与pEASY_T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。
根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在spl的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22 30nt，退火温度在60 65°C。并将它们分别命名为uspl，卿2，usp3(上游特异性引物)，dspl, dsp2, dsp3(下游特异性引物)见表1。表1.木聚糖酶XYN10C1 TAIL-PCR特异性引物
权利要求
1.一种高温酸性木聚糖酶XYN10C1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2 所示。
2.如权利要求1所述的高温酸性木聚糖酶XYN10C1，其特征在于，序列SEQID NO. 1在 N端包含信号肽，所述信号肽的序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.—种高温酸性木聚糖酶xynlOCl，其特征在于，编码权利要求1所述的高温酸性木聚糖酶 XYmoci。
4.如权利要求3所述的高温酸性木聚糖酶基因xynioci，其特征在于，其碱基序列如 SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
5.如权利要求3所述的高温酸性木聚糖酶基因xynlOCl，其特征在于，所述高温酸性木聚糖酶基因xynlOCl包括信号肽序列，所述序列如SEQ ID NO. 6所示。
6.包含权利要求3所述高温酸性木聚糖酶基因xynlOCl的重组载体。
7.包含权利要求3所述高温酸性木聚糖酶基因xynlOCl的重组载体pPIC-xynlOCl。
8.包含权利要求3所述高温酸性木聚糖酶基因xynlOCl的重组菌株。
9.一种制备高温酸性木聚糖酶基因xynlOCl的方法，其特征在于，包括以下步骤1)用权利要求6的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10C1。
10.权利要求1所述高温酸性木聚糖酶XYN10C1的应用。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温酸性木聚糖酶XYN10C1及其基因和应用。本发明提供了一种来源于青霉的木聚糖酶XYN10C1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述木聚糖酶的编码基因xyn10C1。本发明的木聚糖酶的具有以下性质最适pH4.0～5.5，最适温度75℃，比活为137.36U/mg；良好的蛋白酶抗性，有效的降解小麦阿拉伯木聚糖以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料，酿酒、食品、能源工业等。
文档编号C12N15/63GK102586206SQ20111000925
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者张菁, 詹志春, 陈小燕 申请人:武汉新华扬生物股份有限公司