专利名称：：一种通用可靠的土壤总dna的提取方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种土壤总DNA提取方法，尤其涉及一种通用可靠的土壤总DNA提取方法及其在各类土壤样品中的应用。
背景技术：
：土壤中含有非常丰富的微生物资源，但由于受到研究方法和研究手段的限制，土壤中绝大多数微生物还不为人所知。分子微生物生态学研究表明，利用传统的纯培养技术，仅有1%的微生物可被培养，而未能培养的微生物才是土壤微生物多样性的主体(AmannRI.etal，1995)，这给微生物的多样性资源开发和利用带来很大的局限。在分子水平上研究土壤中未可培养微生物的技术关键之一是从各种土壤样品中获得可进行分子操作的宏基因组DNA。获得高纯度、大片段、完整性好的土壤微生物总DNA是土壤微生物分子生态学研究和宏基因组文库构建的基础。由于土壤样品种类繁多、成分复杂、物化性质多变，含有大量的无机及有机化合物，存在着对某些酶反应的抑制剂，如腐植酸、腐植酸类似物、重金属离子等都会干扰提取反应的进行。加之，微生物细胞通常紧密吸附于土壤颗粒表面。因此，从土壤样品中提取出高质量的、具有代表性的微生物总基因组DNA具有相当难度。因此，建立土壤样品DNA的提取纯化方法对于在分子水平上研究未培养微生物具有重要意义。虽然目前对土壤DNA提取方法的研究报道已有很多，但没有一种方法能适用于所有的土壤样品，而且大部分方法都需要再纯化过程，也没有一种方法能满足不同的实验条件和实验目的。
发明内容为了解决上述现有技术中存在的不足，本发明首要目的在于提供一种能够提取各种类型土壤总DNA的方法。本发明所涉及的土壤样品类型包括大田作物土壤、保护地土壤、浅海污泥、深海污泥、用于污水处理的活性污泥、高盐碱土壤、酸性土壤等类型。本发明的目的通过下述方案实现—种通用可靠的土壤总DNA的提取方法，其特征是包括以下步骤[ooog](1)土壤样品预处理用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸钠缓冲液洗涤土壤样品5g，8000r/min离心10min，沉淀再洗涤一次；(2)裂解细胞将步骤(1)中的沉淀中加入5mL溶液I，37t:水浴10min，然后加入5mL溶液I1，65。C水浴lh，每隔15分钟摇晃，离心10min(6000r/min)弃沉淀；上清中加入2.7mL5mo1/LNaCl，混匀，在65t:水浴中放置5min;[OO13](3)除去蛋白并沉淀DNA:3用氯仿异戊醇(24:1)抽提两次，8000r/min离心；得到的上层水相与等体积的溶液III(13%聚乙二醇8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上静置20min;离心10min(10000r/min)弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一遍，室温干燥；(4)除去腐殖酸等杂质干燥后溶于3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中；力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸钾溶液，混合物在室温条件下放置30min，离心10min(8000r/min)，弃沉淀；上清中加入0.6倍体积的冰异丙醇，混匀后静置10min;沉淀用70%乙醇洗涤后干燥，用90ii1TE溶解DNA，加入等体积2mol/L氯化镁溶液，混匀，室温静置30min，离心10min(8000r/min)，弃沉淀；上清中加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，于70%乙醇洗涤沉淀后干燥，TE溶解；所述的溶液I各成分含量为0.15mol/LNaCl，O.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0;所述的溶液II各成分含量为0.lmol/LNaCl，O.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0。取利用本发明方法分别以白菜地、玉米地、葱地、森林地、保护地、松树、槐树地、柞树地、柏树、温室沙地、近海污泥、深海污泥样品提取的土壤总DNA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳后用0.5%EB染色结果。结果显示各种样品中的DNA条带清晰且单一，无拖尾，无杂带，与A-HindIIIMaker对比均能保证在23kb以上，说明具有较好的完整性。详见实施例1-实施例12;以利用本发明方法分别以白菜地、玉米地、葱地、森林地、保护地、松树、槐树地、柞树地、柏树、温室沙地、近海污泥、深海污泥样品提取的土壤总DNA为模板，PCR扩增16SrDNA的琼脂糖凝胶电泳结果。结果显示各种样品中的总DNA都能有效扩增出目标基因，不受腐植酸等其他PCR抑制剂的影响，说明采用本发明方法提取的各种样品中的总DNA其浓度和质量可以保证后续试验的进行。详见实施例1-实施例12。经步骤(4)得到的白菜地、玉米地、葱地、森林地、保护地、松树、槐树地、柞树地、柏树、温室沙地、近海污泥、深海污泥样品DNA溶液分别在230nm、260nm、280nm紫外测定腐植酸含量、核酸含量和蛋白质含量。通过测定0D260/0D230和0D260/0D280比值检测提取的DNA纯度，二者比值在1.8-2.2之间为最佳。本方法测定的0D260/0D230和0D260/0D280比值比文献中报道的其他方法提取的土壤中总DNA的纯度要高，文献中报道的其他方法提取的土壤中总DNA样品，其0D260/0D230比值均小于1，0D260/0D280比值也明显低于本方法，且其他方法提取DNA后还需要繁杂的纯化过程，本方法提取的DNA样品中A260/A230及A260/A280比值结果见表1。表1本发明方法提取不同样品DNA中A260/A230及A260/A280比值<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>综上所述，本发明的有益效果包括本发明所提供的土壤样品总DNA提取方法综合使用适当浓度的醋酸钾和氯化镁溶液去除样品中的各类腐植酸等杂质和PCR扩增抑制因子，并能得到较高浓度的大片段DNA，且适合于PCR扩增试验，能够保证后续试验的顺利进行。能满足不同的实验条件和实验目的。提取过程无需再纯化，縮减了提取步骤，降低了提取成本。本发明能适用于所有的土壤样品，具有通用可靠、提取成本低廉的突出优点。图1为利用本发明方法分别提取白菜地、玉米地、葱地、森林地、保护地、松树、槐树地、柞树地、柏树、温室沙地、近海污泥、深海污泥样品的总DNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳后用0.5%EB染色结果。在图中，1-白菜地，2-玉米地，3-葱地，4-森林地，5-保护地，6_松树，7_槐树地，8-柞树地，9-柏树，10-温室沙地，11-近海污泥，12-深海污泥.M-HindIIImarker(Taka:ra)。图2为以本发明方法提取的白菜地、玉米地、葱地、森林地、保护地、松树、槐树地、柞树地、柏树、温室沙地、近海污泥、深海污泥样品的总DNA为模板，PCR扩增16SrDNA的琼脂糖凝胶电泳结果。在图中，1-白菜地，2-玉米地，3-葱地，4-森林地，5-保护地，6_松树，7_槐树地，8-柞树地，9-柏树，10-温室沙地，11-近海污泥，12-深海污泥.M-DL2000(Takara)。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1利用本发明所述方法提取大连董家沟保护地土壤总DNA:(1)土壤采集及预处理大连董家沟黄瓜保护地采用五点法采样，去除表面土，取10-20cm的土样，装入灭菌纸袋带回实验室，研钵研细土样，过200目标准筛。用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸钠缓冲液洗涤土壤样品5g，8000r/min离心10min，沉淀再洗涤一次。(2)裂解细胞将步骤(1)中的沉淀中加入5mL溶液1(0.15mol/LNaCl，0.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0)，37°C7JC》谷10min，然后加入5mL溶夜II(0.lmol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0)，65。C水浴lh，每隔15分钟摇晃，离心10min(6000r/min)弃沉淀。上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混匀，在65。C水浴中放置5min。(3)除去蛋白并沉淀DNA:用氯仿异戊醇(24:1)抽提两次，8000r/min离心。得到的上层水相与等体积的溶液III(13%PEG8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上静置20min。离心10min(10000r/min)弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一遍，室温干燥。(4)除去腐殖酸等杂质干燥后溶于3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中。力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸钾溶液，混合物在室温条件下放置30min，离心10min(8000r/min)，5弃沉淀。上清中加入0.6倍体积的冰异丙醇，混匀后静置10min。沉淀用70%乙醇洗涤后干燥，用90ii1TE溶解DNA，加入等体积2mol/L氯化镁溶液，混匀，室温静置30min，离心10min(8000r/min)，弃沉淀。上清中加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，于70%乙醇洗涤沉淀后干燥，TE溶解，电泳结果如图1-5，PCR扩增电泳结果如图2-5;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。实施例2利用本发明所述方法提取大连开发区童牛岭森林土壤总DNA:(1)土壤采集及预处理大连开发区童牛岭森林中去除表层落叶及腐殖质层，取10-20cm的土样，装入灭菌纸袋带回实验室，除去较大石块，研钵研细土样，过200目标准筛。用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸钠缓冲液洗涤土壤样品5g，8000r/min离心10min，沉淀再洗涤一次。(2)裂解细胞将步骤(1)中的沉淀中加入5mL溶液I(O.15mol/LNaCl，0.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0)，37°C7JC》谷10min，然后加入5mL溶夜II(0.lmol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0)，65。C水浴lh，每隔15分钟摇晃，离心10min(6000r/min)弃沉淀。上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混匀，在65。C水浴中放置5min。(3)除去蛋白并沉淀DNA:用氯仿异戊醇(24:1)抽提两次，8000r/min离心。得到的上层水相与等体积的溶液111(13%聚乙二醇8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上静置20min。离心10min(10000r/min)弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一遍，室温干燥。(4)除去腐殖酸等杂质干燥后溶于3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中。力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸钾溶液，混合物在室温条件下放置30min，离心10min(8000r/min)，弃沉淀。上清中加入0.6倍体积的冰异丙醇，混匀后静置10min。沉淀用70%乙醇洗涤后干燥，用90ii1TE溶解DNA，加入等体积2mol/L氯化镁溶液，混匀，室温静置30min，离心10min(8000r/min)，弃沉淀。上清中加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，于70%乙醇洗涤沉淀后干燥，TE溶解，电泳结果如图1-4，PCR扩增电泳结果如图2-4;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。实施例3利用本发明所述方法提取大连近海污泥土壤总DNA:(1)污泥采集及预处理大连开发区泊石湾乘船入近海，收集10m左右海泥装入无菌塑料袋带回实验室，除去较大沙粒，用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸钠缓冲液洗涤污泥样品5g，8000r/min离心10min，沉淀再洗涤一次。(2)裂解细胞将步骤(1)中的沉淀中加入5mL溶液1(0.15mol/LNaCl，0.lmol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0)，37°C7JC》谷10min，然后加入5mL溶夜II(0.lmol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10%SDS，pH8.0)，65。C水浴lh，每隔15分钟摇晃，离心10min(6000r/min)弃沉淀。上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混匀，在65。C水浴中放置5min。(3)除去蛋白并沉淀DNA:用氯仿异戊醇(24:1)抽提两次，8000r/min离心。得到的上层水相与等体积的溶液III(13%PEG8，000，1.6mol/LNaCl)混合，冰上静置20min。离心lOmin(lOOOOr/min)弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一遍，室温干燥。(4)除去腐殖酸等杂质干燥后溶于3mlTE(10mmol/LTris—HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0)中。力口入707ii1(7.5mol/L)醋酸钾溶液，混合物在室温条件下放置30min，离心lOmin(8000r/min)，弃沉淀。上清中加入0.6倍体积的冰异丙醇，混匀后静置10min。沉淀用70%乙醇洗涤后干燥，用90ITE溶解DNA，加入等体积2mol/L氯化镁溶液，混匀，室温静置30min，离心lOmin(8000r/min)，弃沉淀。上清中加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，于70%乙醇洗涤沉淀后干燥，TE溶解，电泳结果如图l-ll，PCR扩增电泳结果如图2-11;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。实施例4土壤采集地为白菜地，其它同实施例1。电泳结果如图1-1，PCR扩增电泳结果如图2-1;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。实施例5土壤采集地为玉米地，其它同实施例1。电泳结果如图1-2，PCR扩增电泳结果如图2-2;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。实施例6土壤采集地为葱地，其它同实施例1。电泳结果如图1-3，PCR扩增电泳结果如图2-3;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。实施例7土壤采集地为松树地，其它同实施例2。电泳结果如图1-6，PCR扩增电泳结果如图2-6;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。实施例8土壤采集地为槐树地，其它同实施例2。电泳结果如图1-7，PCR扩增电泳结果如图2-7;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。实施例9土壤采集地为柞树地，其它同实施例2。电泳结果如图1-8，PCR扩增电泳结果如图2-8;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。实施例10土壤采集地为柏树地，其它同实施例2。电泳结果如图1-9，PCR扩增电泳结果如图2-9;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。实施例11土壤采集地为温室沙地，其它同实施例3。电泳结果如图l-10，PCR扩增电泳结果如图2-10;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。实施例12土壤采集地为深海污泥，其它同实施例3。电泳结果如图l-12，PCR扩增电泳结果如图2-12;样品DNA中A260/A230及A260/A280比值见表1。权利要求一种通用可靠的土壤总DNA的提取方法，其特征是包括以下步骤(1)土壤样品预处理用10mLpH8.0的0.12mol/L的磷酸钠缓冲液洗涤土壤样品5g，8000r/min离心10min，沉淀再洗涤一次；(2)裂解细胞将步骤(1)中的沉淀中加入5mL溶液I，37℃水浴10min，然后加入5mL溶液II，65℃水浴1h，每隔15分钟摇晃，离心10min(6000r/min)弃沉淀；上清中加入2.7mL5mol/LNaCl，混匀，在65℃水浴中放置5min；(3)除去蛋白并沉淀DNA用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提两次，8000r/min离心；得到的上层水相与等体积的溶液III(13％聚乙二醇8,000，1.6mol/LNaCl)；混合，冰上静置20min；离心10min(10000r/min)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤一遍，室温干燥；(4)除去腐殖酸等杂质干燥后溶于3mlTE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0)中；加入707μl(7.5mol/L)醋酸钾溶液，混合物在室温条件下放置30min，离心10min(8000r/min)，弃沉淀；上清中加入0.6倍体积的冰异丙醇，混匀后静置10min；沉淀用70％乙醇洗涤后干燥，用90μlTE溶解DNA，加入等体积2mol/L氯化镁溶液，混匀，室温静置30min，离心10min(8000r/min)，弃沉淀；上清中加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，于70％乙醇洗涤沉淀后干燥，TE溶解；所述的溶液I各成分含量为0.15mol/LNaCl，0.1mol/LEDTA，15mg/mllysozym，pH8.0；所述的溶液II各成分含量为0.1mol/LNaCl，0.5mol/LTris-HCl，10％SDS，pH8.0。2.如权利要求1所述的通用可靠的土壤总DNA的提取方法在各种类型土壤总DNA的制备中的应用。全文摘要本发明涉及一种通用可靠的土壤总DNA的提取方法及其应用，属于分子生物学领域。土壤中含有非常丰富的微生物资源，但利用传统的纯培养技术，仅有1％的微生物可被培养，而未能培养的微生物才是土壤微生物多样性的主体，这给微生物的多样性资源开发和利用带来很大的局限。本研究所提供的提取方法使用溶液I、溶液II、醋酸钾和氯化镁移除腐植酸等杂质，能满足不同类型土壤样品的需要，且能得到高质量、大片段并且适合后续克隆实验的DNA，为研究各种环境中土壤(污泥)样品微生物多样性奠定了基础。提取过程无需再纯化，缩减了提取步骤，降低了提取成本。文档编号C12N15/10GK101775388SQ20101010329公开日2010年7月14日申请日期2010年1月29日优先权日2010年1月29日发明者于基成,刘秋,胡英畅,闫建芳申请人:大连民族学院