一种检测液泡膜质子流的方法

专利名称：一种检测液泡膜质子流的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测液泡膜质子流的方法。
背景技术：
液泡是植物体内多功能的细胞器，在细胞体积、膨压、pH和离子平衡的调节中起重 要作用。液泡能行使这些功能，源于它能积累高浓度离子的能力。 一些离子例如!T和Ca2+ 被认为可以强烈影响胞质中酶活和大分子物质，都被积累于液泡中。因液泡的离子积累能 力，它在调节无机离子平衡上起着非常重要的作用。 在植物细胞中，离子平衡主要通过质膜和胞内细胞器膜如液泡膜的离子进出调节 来实现的。从液泡进出的离子参与许多的信号途径，同时也起始很多的代谢反应。特别是 对胞质中的PH和Ca2+信号的调控是液泡参与调控细胞离子平衡的典型例子。在烟草的悬 浮细胞中，液泡会随着胞质中H+的升高而降低液泡内的pH值来调节胞质的pH。另外，液泡 膜上有很多转运系统，例如Ca2+-ATPase和Ca2+/H+-antiporter，他们可以催化Ca2+进入液 泡，从而通过控制液泡上的慢通道和通道介导的液泡Ca2+流来调控胞质的离子平衡。
尽管已经给出很多液泡参与调控胞质离子平衡的证据，但是对于特异的H+转运和 H+流的研究还是很少。当植物细胞遭受多变的外部环境时，液泡和细胞质H+库里的H+发生 瞬时的分配变化，该过程影响了许多基因功能实现，同时引发了许多的信号反应。
扫描离子选择电极技术(SIET)是一项电生理技术，可以用电脑控制，非损伤地对 样品进行离子和分子的特异活性监测。迄今为止，很多离子和分子的感受器，例如Ca2+， H+， K+， Cl—， NO—， Mg2+， Cd2+，八13+等离子和02分子的电极感受器，都已经研究完成。不同于其他 电生理技术，比如膜片钳，SIET有许多优点第一，SIET对于研究者来说容易操作。第二， SIET由于非损伤特点，测定样品更加准确。第三，SIET能从组织，器官，细胞团，单细胞和细 胞器中测定离子和分子流。第四，SIET不仅能从离子通道，而且也能从转运蛋白通道和逆 向转运蛋白通道收集电流变化的数据。第五，SIET在测定时候，清楚地显示微电极位置和 测定数据，全过程都是可见测定。 近年来，SIET技术已经在许多关于组织和细胞跨膜离子流研究。在盐胁迫下，用 SIET测定杨树根Na+和H+流；另外，通过根中Ca2+离子流测定，证明根中Ca2+离子影响K+/ Na+离子平衡。此外，通过SIET，揭示了云杉花粉管中钙调素调控C^+离子流的作用模式； 同样地，利用SIET技术测定毛白杨花粉管细胞，发现钙离子内流与肌动蛋白丝组织之间的 偶联关系，深入地阐述了 NO介导的细胞壁构成的机理。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种提取植物液泡的方法。
本发明所提供的提取植物液泡的方法，包括如下步骤 提取并裂解植物叶片的原生质体，得到所述植物叶片的原生质体裂解溶液，分离 纯化所述植物叶片的原生质体裂解溶液，得到所述植物的液泡提取液；
所述分离纯化所述植物叶片的原生质体裂解溶液的方法包括如下密度梯度离心 步骤将所述植物叶片的原生质体裂解溶液加入到8% Ficoll-400溶液的上层，所述8% Ficoll-400溶液在下层，所述植物叶片的原生质体裂解溶液在上层，以500g-50000g的离 心力离心10min-50min，收集上数第一层溶液，即为所述植物的液泡提取液；
每1升所述8% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的将25mmol Tris、 (0. 4-1)mol甘露醇和80g相对分子重量为400000的聚蔗糖混合，用水定容至1升，再用HC1 调节pH至7. 0-7. 5，得到1升所述8% Ficoll-400溶液。 上述过程中，所述密度梯度离心步骤中，所述离心的方式为以500g、1000g或 50000g的离心力离心10min、30min或50min ; 上述过程中，所述每l升所述8XFicoll-400溶液的配制方法中，所述甘露醇的用 量为0. 4mol、0. 5mol或lmol ; 上述过程中，所述每1升所述8% Ficoll-400溶液的pH值为7. 5。 上述过程中，所述密度梯度离心步骤中，所述离心的方式为以500g的离心力离
心50min，或以lOOOg的离心力离心30min，或以50000g的离心力离心lOmin ; 上述过程中，所述植物为烟草。 本发明的另一个目的是提供一种检测植物液泡膜离子流的方法。 本发明所提供的检测植物液泡膜离子流的方法，包括如下步骤用扫描离子选择
电极技术检测植物液泡的液泡膜离子流，得到所述植物液泡的液泡膜离子流值。 上述过程中，所述离子流为H+流。 上述过程中，所述方法中，在用扫描离子选择电极技术检测植物液泡的液泡膜离
子流前，包括按照上述任一所述提取植物液泡的方法提取植物液泡的步骤。 上述过程中，所述用扫描离子选择电极技术检测植物液泡的液泡膜离子流的方法
包括如下步骤处理盖玻片，得到处理后的盖玻片，将所述植物液泡固定于所述处理后的盖
玻片上，再加入测定液，进行测定； 上述过程中，所述处理盖玻片的方法为用(0.005-0.01% )(质量百分含量)多聚 赖氨酸水浸泡所述盖玻片(5-30)分钟，干燥； 上述过程中，每1升测定液是按照如下方法配制得到的将0. 05mmol的2_ (N_吗 啡啉)乙磺酸、(500-800)mmol甘露醇、0. lmmol NaCl、0. lmmol CaCl2禾P lOOmmolKCl混合 均匀，用水定容至1升，再用KOH调节pH至6. 8-7. 5 ; 上述过程中，所述测定中使用的电解液由NaCl、 KH2P04和水组成，NaCl在电解液 中的浓度为(13. 5-16. 5)mM，KH2P04在电解液中的浓度为(36-44)mM，所述电解液的pH值为 6. 8-7. 2。 上述过程中，所述处理盖玻片的方法为如下1)、2)或3) :1)用0.008% (质量百 分含量)多聚赖氨酸水浸泡所述盖玻片5分钟，干燥；2)用0.005% (质量百分含量)多聚 赖氨酸水浸泡所述盖玻片30min，干燥；3)用0.01% (质量百分含量)多聚赖氨酸水浸泡 所述盖玻片15min，干燥； 上述过程中，所述每1升测定液的配制方法中，所述甘露醇为500mmol、650mmo1或 800mmo1 ;所述测定液的pH值为6. 8、7. 0或7. 5 ; 所述测定中使用的电解液由NaCl、 KH2P04和水组成，NaCl在电解液中的浓度为15mM、13. 5mM或16. 5慮，腿2 04在电解液中的浓度为40mM、36mM或44mM，电解液的pH为6. 8、 7. 0或7. 2。 上述过程中，所述植物为烟草。 本发明是首次测定液泡上H+流，且第一次运用SIET测定烟草液泡H+流。
本发明方法中提取液泡的方法不同于传统方法传统的液泡提取方法(M2)，是通 过对裂解的原生质体，进行不连续密度梯度超速离心来获得液泡；然而，直接裂解法(Ml) 是一种高度简化的液泡分离方法，它直接将原生质体裂解得到粗分离的液泡。根据SIET 的技术特点，本发明在M2的基础上，建立了一套简化且高效的适合SIET测定的液泡提取 方法(M3)。简化的方法有以下几处的改动第一，裂解出的液泡，在M3中直接铺设于8% Ficoll-400溶液的顶层，代替M2方法中铺设在四层Ficoll-400不连续梯度溶液的顶 层。第二，在M3中，铺设好的Ficoll-400梯度，直接用水平转头进行500g-50000g离心 10min-50min，4t:;而在M2中，将铺设好的梯度管，进行90， OOOg超速离心2小时。第三，离 心结束后，M3方法收集上层溶液；而M2方法收集1. 5%和7% Ficoll-400界面溶液。
实验证明，通过M3分离的液泡，不仅与M2有相同的分离效果(干净的观测背景和 较高的液泡分离效率)，更重要的是在SIET的测定中M3和M2分离的液泡都表现出相似的 H+流测定数值和测定稳定性(图.2)。同时，作为从M2简化的M3方法，比传统的超速离心 法M2，操作更简单而且费用更低廉。所以，简化的液泡提取方法作为一种替代传统超速离 心液泡提取方法，适合于SIET H+流测定。同时本发明方法对液泡具有非损伤性和稳定性。 另外，用本发明方法检测到盐胁迫下转SeNHXl基因烟草液泡H+外流增强，验证了SeNHXl基 因的功能。 综上所述，本发明建立了适合于SIET的简化液泡提取方法和液泡H+流检测系统。


图1.光学显微镜观察不同提取方法得到的液泡。图中的标尺表示20um。
图2.对通过Ml ， M2和M3方法分离得到的液泡用SIET进行H+流测定。
图3.考察SIET测定液泡H+净流的稳定性和非损伤性。 图4.测定在NaCl胁迫下，转SeNHXl基因烟草和对照烟草液泡H+流变化。标准 误差线上相同的字母表示在P《0. 05情况下没有显著性差异。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 从Yakult公司购买纤维素酶(货号L0012)与离析酶R-10(货号L0021)。从美
国Amresco公司购买SDS， MES， K0H，甘露醇，Ficoll-400， Tris等药品。多聚赖氨酸购买于
美国Sigma公司(货号P4707)。试验中所有步骤都使用双蒸水。光学显微镜使用Zeiss
M-35倒置相差显微镜。普通离心使用Sigma 3-18K离心机；超速离心使用BECKMAN Optima
L-80XP超速离心机。 下述实施例的各结果图中标准误差线上相同的字母表示数据在P《0. 05水平上 没有显著性差异。
实施例1 、检测野生型烟草的液泡膜H+流
—、提取液泡 植物组织液泡提取过程主要包括以下三个步骤原生质体制备，原生质体的裂解， 液泡分离纯化。根据不同的实验需要，不同液泡纯度的要求，可以采取不同的液泡提取方 法。不同于其他电生理技术，SIET对测定的样品有自己的要求.首先，样品要求直径超过 10um，并且能在显微镜镜头下清楚找到；其次，对样品测定环境要求越纯越好；第三，样品 准备不能改变缓冲液成分，最好不要引入其他离子或者官能团。 本实验所用植物材料为野生型烟草'W38' (Nicotiana tabacum cv 'Wisconsin38')。 野生型烟草'W38'(即'威斯康辛38'或Wisconsin 38)的种子购自中国农业科 学院烟草研究所(即中国烟草总公司青州烟草研究所)。 下述实验中的烟草叶片均是按照如下方法获得野生型种子消毒后播于MS培 养基上。两周之后，将有活力的萌发苗转移到温室，种植在含有蛭石、泥炭和腐殖质
(i : i : i ;V : v : v)的塑料盆中。温室条件控制为白天温度控制在25士2t:，夜间温
度控制在20士2t:，光照16小时/天，相对湿度50±10%。苗期每周浇1/2Hoagland营养 液一次，如此培养获得烟草植株。( — )实验组-简化梯度离心法(记作方法M3)
方法M3-l :
1、制备原生质体 lg烟草叶片，剪成2mmX2mm的方块，放进细胞裂解缓冲液中，28。C轻微摇晃(40r/
min)6-8小时，得到的混合物即为细胞裂解液。细胞裂解液通过一层纱布过滤，取滤液；滤
液通过平转头4°C， 100g离心2分钟，离心结束，丢弃上清液，留下沉淀。 1升细胞裂解缓冲液的配制方法是将15g离析酶、20g纤维素酶、0. 05g MES、和
0. 5mo1甘露醇用水混匀，用水定容至1升，用K0H调pH值至5. 7。 得到的原生质体如图la所示，显示原生质体状态良好。 2、裂解原生质体 将步骤1得到的沉淀加入原生质体裂解缓冲液中，轻轻吸打10分钟，得到烟草叶 片的原生质体裂解溶液(即液泡初提液)； 1升原生质体裂解缓冲液的配制方法将36. 43g甘露醇和3g Tris加入1L水，混 匀，并用HCl调节pH值至7.5.
3、分离纯化液泡 将步骤2得到的液泡初提液加入8% Ficoll-400溶液的顶层(8% Fico11-400溶 液在下层，液泡初提液在上层)。利用Sigma 3-18K冷冻离心机，使用平转头1000g普通离 心30miri，4°C，收集第一层溶液(从上至下数，即上数第一层溶液)，即得到液泡提取液。
每1升所述8% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的将25mmo1的Tris、 0. 5mo1甘露醇和80g相对分子重量为400000的聚蔗糖(即Ficol 1-400)混合均匀，用水定 容至1升，再用HC1调pH至7. 5，得到1升所述8% Ficoll-400溶液。
方法M3-2 : 1、制备原生质体与方法M3-l中所述一致。
2、裂解原生质体与方法M3-l中所述一致。
3、分离纯化液泡 将步骤2得到的液泡初提液加入8% Ficoll-400溶液的顶层(8% Ficoll-400溶 液在下层，液泡初提液在上层)。利用Sigma 3-18K冷冻离心机，使用平转头500g普通离心 50miri，4°C，收集第一层溶液(从上至下数，即上数第一层溶液)，即得到液泡提取液。
每1升所述8% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的将25mmo1的Tris、
0. 4mo1甘露醇和80g相对分子重量为400000的聚蔗糖(即Ficol 1-400)混合均匀，用水定 容至1升，再用HC1调pH至7. 5，得到1升所述8% Ficoll-400溶液。 方法M3-3 : 1、制备原生质体与方法M3-l中所述一致。
2、裂解原生质体与方法M3-l中所述一致。
3、分离纯化液泡 将步骤2得到的液泡初提液加入8% Ficoll-400溶液的顶层(8% Ficoll-400溶 液在下层，液泡初提液在上层)。利用Sigma 3-18K冷冻离心机，使用平转头50000g普通离 心10min，4t:，收集第一层溶液(从上至下数，即上数第一层溶液)，即得到液泡提取液。
每1升所述8% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的将25mmo1的Tris、
1. Omol甘露醇和80g相对分子重量为400000的聚蔗糖(即Ficol 1-400)混合均匀，用水定 容至1升，再用HC1调pH至7. 5，得到1升所述8% Ficoll-400溶液。 ( 二 )对照组-直接裂解法(记作方法Ml) 直接裂解法就是通过直接裂解原生质体粗分离液泡的方法，此方法为现有技术。 1、制备原生质体 方法与实验一中所述一致。 2、裂解原生质体 将步骤1得到的沉淀加入原生质体裂解缓冲液，用移液器反复吸打4次，然后间隔 2分钟再次吸打，每次吸打4次，如此进行10分钟。最后，加入甘露醇存储液，直到混合溶液 中甘露醇浓度达到0. 5M。待溶液渗透势稳定后，进行H+流的SIET测定。
1升原生质体裂解缓冲液的配制方法将36. 43g甘露醇和3g Tris加入1L水，混 匀，并用HCl调节pH值至7.5.(三)对照组-传统超速离心法(记作方法M2)，此方法为现有技术。 1、制备原生质体 方法与实验一中所述一致。 2、裂解原生质体 将步骤1得到的沉淀加入原生质体裂解缓冲液中，轻轻吸打10分钟，得到悬浮 液； 1升原生质体裂解缓冲液的配制方法将36. 43g甘露醇和3g Tris加入1L水，混 匀，并用HCl调节pH值至7.5。
3、分离纯化液泡 将步骤2得到的悬浮液加入铺设4层Ficoll-400溶液(25mM Tris-HC1，0. 5M甘 露醇，pH7. 5)的顶层。其中，四层不连续梯度的Ficoll-400浓度从上至下分别为1. 5， 7，12. 5和20% (质量百分含量)。利用BECKMAN Optima L-80XP超速离心机，使用平转子进
行90，000g离心2h，4。C。完整的液泡带在1.5%和7% Ficoll-400梯度界面之间，用枪吸
取1. 5%和7% Ficoll-400梯度界面之间的溶液，即得到液泡提取液。 每l升所述1.5% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的将25mmo1 Tris、
0. 5mo1甘露醇和15g相对分子重量为400000的聚蔗糖(即Ficol 1-400)混合均匀，用水定
容至1升，用HC1调pH值至7. 5，得到1升所述1. 5% Ficoll-400溶液。 每1升所述7% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的将25mmo1 Tris、0. 5mo1
甘露醇和70g相对分子重量为400000的聚蔗糖(即Ficoll-400)混合均匀，用水定容至1
升，用HC1调pH值至7. 5，得到1升所述7% Ficoll-400溶液。 每1升所述12. 5% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的将25mmol Tris、
0. 5mo1甘露醇和125g相对分子重量为400000的聚蔗糖(即Ficoll-400)混合均匀，用水
定容至1升，用HC1调pH值至7. 5，得到1升所述12. 5% Ficoll-400溶液。 每1升所述20% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的将25mmo1 Tris、
0. 5mo1甘露醇和200g相对分子重量为400000的聚蔗糖(即Ficoll-400)混合均匀，用水
定容至1升，用HC1调pH值至7. 5，得到1升所述20% Ficoll-400溶液。 将上述三组实验获得的液泡，分别通过Zeiss M-35倒置相差显微镜进行观测，统
计通过显微镜镜头能清楚辨认的液泡数量。对于每种提取方法提取的液泡，均取100ul的
液泡提取液，进行检测，然后统计其中的液泡数量。将相对于M1方法提取所得液泡数量的
倍数设定为液泡提取效率。液泡提取效率二不同方法提取所得液泡数量/Ml方法提取所得
液泡数量。"能清楚辨认的液泡"的判断标准为在光镜下能清晰看见规则、透明封闭的泡状球 体。 上述三个实验均设3次重复，结果取平均数。 镜检结果如图lb-d所示。Ml方法结果如图lc所示，M2方法结果如图ld所示， M3-l方法结果如图le所示。M2和M3-1方法获得的液泡，在显微镜下观察具有相似干净背 景，而由Ml分离得到的液泡溶液在显微镜下可以看到较多的杂质，甚至有未完全裂解的原 生质体。经过原生质体的裂解，液泡、原生质体、原生质体和液泡复合物都会出现在裂解液 中。因为液泡是无色且透明，所以通过M1方法分离的液泡在许多不同颜色的杂质背景下， 很难被显微镜观测发现。 液泡分离效率统计结果如图lb所示，M2方法的液泡提取效率为Ml方法的10倍， M3-l方法的液泡提取效率为Ml方法的5倍。结果表明，通过M2和M3-l方法可以分离得到 比Ml更多的液泡，尽管M3-l的提取效率比传统的M2方法有所下降，但对于利用SIET进行 H+流的测定，M3-l方法分离液泡的数量已经完全达到测试的要求(实验二中实验证明)。
M3-2、 M3-3方法与M3-1方法的结果一致。
二、SIET测定液泡膜H+流
( — )方法
方法I : SIET测定系统使用的是美国扬格公司的BI0-001A测试系统。SPSS 13. 0分析软 件用于数据分析。显著性检测用LSD在5%的显著水平进行衡量。
使用SIET对通过Ml 、M2和M3分离得到的液泡进行H+流测定，对于每种方法提取
的液泡均取12个液泡进行测定，对每一个液泡均测2分钟。具体步骤如下 在离子流测定之前，盖玻片用0.008%多聚赖氨酸水溶液进行处理将干净的盖
玻片浸入0. 008%多聚赖氨酸水溶液中，浸泡5分钟后，过夜风干，并干燥保存使用。实验前
将处理过的盖玻片固定在测试小室的底部。取液泡提取液加在盖玻片的中央，静置5分钟，
液泡固定在盖玻片上，剩余的液体用枪吸掉，最后加入3ml的测定液。待液体稳定过后，开
始进行SIET测定。 每1升测定液的配制方法将0. 05mmo1的2_(N_吗啡啉)乙磺酸(MES) 、500mmol 甘露醇、0. lmmol NaC1、0. lmmol CaCl2和lOOmmol KC1混合均匀，用水定容至1升，再用KOH 调节pH至7. 0。 使用非损伤微测系统(BI0-001A， Younger USA Sci. & Tech. Corp. ， USA)以静态 和动态的方式选择性地测定离子浓度。测定所用非损伤微电极(XY-H-01型)由旭月(北 京)科技有限公司提供。 选择性的氢离子的液态交换剂(LIX)购自Sigma，产品目录号为 Hydrogenionophore I_cocktail B，95293; 电解液由NaCl、KH2P04和水组成，NaCl在电解液中的浓度为15mM， KH2P04在电解 液中的浓度为40mM，电解液的pH7. 0。 数据采集软件Asetl. 05 ;流速计算软件Mageflux :http: 〃xuyue. net/ mageflux。 H+选择性微电极前端灌充有20 m的选择性的氢离子的液态交换剂 (LIX) ， H+选择性微电极后端灌充有1cm的电解液柱。将电极固定器(EHB-1 ;World Precisionlnstruments)上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触。接地参比电 极(DRIREF-2 ;World Precision Instruments)为固体电极。 H+选择性微电极在使用前经过校正，能斯特斜率(Nernstian slopes)为58mV/ decade,校正液为pH5. 5和p朋.5的PBS缓冲液。 选择性微电极在预先确定距离(5-30 iim)的两点间重复运动，从而测得氢离子的 绝对浓度或浓度梯度，微电极的运动频率通过编程设定在0. 3-0. 5Hz的范围内。
方法II: 除盖玻片的处理、测定液和电解液不同外，其余与方法I相同。 所述处理盖玻片的方法为用0.005% (质量百分含量)多聚赖氨酸水浸泡所述 盖玻片30min，干燥； 所述每1升测定液的配制方法为将0. 05mmol的2_(N_吗啡啉)乙磺酸(MES)、 650mmol甘露醇、0. lmmol NaCl、0. lmmol CaCl2和lOOmmol KCl混合均匀，用水定容至1升， 再用K0H调节pH至6. 8。 所述测定中使用的电解液由NaCl、 KH2P04和水组成，NaCl在电解液中的浓度为 13. 5mM， KH2P04在电解液中的浓度为36mM，电解液的p朋.8。
方法III: 除盖玻片的处理、测定液和电解液不同外，其余与方法I相同。
所述处理盖玻片的方法为用0.01% (质量百分含量)多聚赖氨酸水浸泡所述盖玻片15min，干燥; 所述每1升测定液的配制方法为将0. 05mmol的2_(N_吗啡啉)乙磺酸(MES)、 800mmol甘露醇、0. lmmol NaCl、0. lmmol CaCl2和lOOmmol KC1混合均匀，用水定容至1升， 再用K0H调节pH至7. 5。 所述测定中使用的电解液由NaCl、 KH2P04和水组成，NaCl在电解液中的浓度为 16. 5mM， KH2P04在电解液中的浓度为44mM，电解液的pH7. 2。用上述方法I分别检测上述M3-l方法、M3-2方法、M3-3方法、M1方法、M2方法得 到的液泡，再用方法11 、方法111检测上述M3-1方法得到的液泡。
(二)结果 方法1、方法11、方法III检测上述M3-1方法得到的液泡，结果一致。
结果如图2所示。 如图2A，对12个液泡进行H+流的测定，考察数值的偏离度。图中每一数据均为 用SIET进行2分钟IT流测定的统计平均值，分析不同液泡提取方法对SIET进行IT流 测定稳定性的影响。Ml得到的液泡H+流测定数据，出现大范围的偏离，从-7nmolcm—、一1 到-0. 2翻lcm—2s—1 ;然而，M2和M3-1得到的液泡H+流测定数据，表现比较稳定，都 在-0. 2nmolcm—2s—1附近波动。 如图2B，对12个液泡测定值进行平均数统计，显示M2和M3_l得到液泡H+流测定 数值几乎一致，但与Ml得到的液泡H+流测定平均值相差很大，标准误差线上相同的字母表 示在P《0. 05情况下没有显著性差异。 这些结果表明，通过M3-1方法分离的液泡，在SIET测定下与通过M2方法分离得 到的液泡有相似的H+流测定结果和数据稳定性。SIET的测量稳定性是受缓冲液中离子浓 度的波动和外界杂质的干扰所影响的，由于通过M1分离的液泡溶液中具有许多的杂质、细 胞碎片和叶绿体等，影响了 SIET测定H+流数据的准确性和稳定性；而M2和M3-l有着相似 的测定背景，所以表现出相似的数值和稳定性。 M3-2、M3-3方法得到的液泡的测定结果与M3_l方法得到的液泡的测定结果一致。
这些结果证明，通过M3分离的液泡，不仅与M2有相同的分离效果(干净的观测背 景和较高的液泡分离效率)，更重要的是在SIET的测定中M3和M2分离的液泡都表现出相 似的H+流测定数值和测定稳定性。同时，作为从M2简化的M3方法，比传统的超速离心法 M2，操作更简单而且费用更低廉。所以，简化的液泡提取方法作为一种替代传统超速离心液 泡提取方法，适合于SIET H+流测定。该结果还证明尽管M3的提取效率比传统的M2方法 有所下降，但对于利用SIET进行H+流的测定，M3方法分离液泡的数量已经完全达到测试的 要求。 实验设3次重复，结果均一致。 实施例2、 SIET对液泡H+流非损伤测定 —、方法 检测M3-l、 M3-2、 M3-3方法制备的液泡。同一个液泡每隔5分钟测定一次，测三 次；每次检测为2分钟内连续测定；共检测1个液泡，将3次测定所得到的平均值进行绘图。 考察该方法对样品的非损伤性。SIET测定方法如实施例2中方法I所述。
实验设3次重复，结果取平均数。
二、结果 图3 (a)，对同一个液泡进行三次连续2分钟的H+净流测定，每次结果分别记作 VI， V2和V3。图3(b) ， VI、 V2和V3三次测定的平均值。标准误差线上相同的字母表示在 P《0. 05情况下没有显著性差异。 结果显示，H+流在三次2分钟的测定(V1、V2和V3)过程中的所有值，表现出极其 相似的趋势和稳定性(图3a)，同时每次测定的平均值几乎都一致(图3b)。表明，SIET表 现出良好的非损伤性和稳定性。 比较其他离子流测定技术，SIET能精确地测定微弱的离子流。如图2和3显示， 微弱的H"流如0. 15cm—S—1和0. 2nmolcm—2s—1都可以被SIET检测到，这些结果证明SIET可 以更准确地测定离子转运过程中极其微弱的差别。 M3-2、M3-3方法得到的液泡的测定结果与M3_l方法得到的液泡的测定结果一致。
研究表明，组织和细胞受损伤可以引发一系列信号反应，同时许多离子运输也参
与在信号转导过程中，这就使得细胞损伤会导致离子流测定不准确和不稳定。比其他电生
理技术如膜片钳更优异的是，SIET可以在测定过程中，保护样品不受伤害，因此可以准确地
测定实时的H+流变化。另一个优势是，因为SIET的非损伤性，同一个液泡可以保持相同的
活性状态，用于不同离子流的反复测定，这样的数据具有更高的可比性。 实施例3、检测转基因烟草的液泡膜H+流 —、实验材料的获得( — )转SeNHXl基因烟草的制备 pBI121载体购自北京科创胜达科技有限公司；农杆菌LBA4404菌株购自北京鼎国 生物技术有限公司；盐角草购自江苏晶隆海洋产业发展有限公司。 转基因烟草是按照文献(Zhou SF，Chen XY，Zhang XG，Li YX (2008) Improvedsalt tolerance in tobacco plants by co—transformation of a betaine synthesisgene BADH and a vacuolar Na+/H+ antiporter gene SeNHXl. Biotechnol Lett 30 :369-376) 中所述方法获得的。 SeNHXl基因是以下述引物1和2为引物，用盐角草的RNA合成的第一链cDNA作为 模板，PCR扩增出核苷酸序列如Genbank号为AY131235的第301-2200位的编码基因，该编 码基因编码氨基酸序列如Genbank号为AAN08157所示的蛋白。
引物1:5' -TCTAGATGGAGGGAATTTGGAGGAGC-3';
引物2:5' -GGATCCTGCCTAACTGCCTCGGATT-3'。 扩增得到的SeNHXl基因插入含35S启动子的pBI121的Xball和BamHI位点，构 建了 pBI121-35S-SeNHXl基因表达载体，将其转化大肠杆菌并提取质粒进行测序鉴定，结 果表明构建的pBI121-35S-SeNHXl基因表达载体中基因插入方向及插入序列正确。确认无 误后，将载体pBI121-35S-SeNHXl转化农杆菌LBA4404菌株。随后，利用农杆菌介导的叶盘 转化法，对"W38"的叶盘组织进行菌液侵染转化，侵染后的叶盘放置于含有卡那霉素的分化 培养基上培养。通过卡那霉素的筛选，将具有抗性的烟草再生苗转移到温室培养，并对再 生苗进行PCR检测(引物为上述引物1和引物2)，最终得到ll株转化阳性苗，然后随机从 11株阳性苗中选取5株，进行Southern和Northern分析；并通过杂交结果，选择了 TO代 SeNHXl基因能够转录表达、并单拷贝插入基因组的T1、T11和T15株系，将由此三个株系获得的Tl代转基因烟草分别记作TS1、 TS11和TS15。 [OH9] ( 二 )转PBI空载体烟草(对照) 按照实验(一)中所述方法将空载体pBI121转入烟草中，得到第T0代烟草植株
的种子，进行如下实验。 二、烟草叶片的获得 将转基因种子(TO代转基因株系Sl， Sll和S15的种子、对照TO代种子)播在含 有150mgml—1卡那霉素的MS培养基上进行筛选，两周之后，将存活的卡纳抗性转基因萌发苗
转移到温室，种植在含有蛭石、泥炭和腐殖质(i : i : i ;v : v : v)的塑料盆中。温室条
件控制为白天温度控制在25±2°C ，夜间温度控制在20±2°C ，光照16小时/天，相对湿度 50±10%。苗期每周浇1/2Hoagland营养液一次，如此培养获得烟草植株。
三、提取液泡 按照实施例1中实验一中所述方法(M3-l、2、3)提取液泡，得到液泡提取液。 四、用SIET测定液泡膜H+流 用实施例1中的方法I进行检测。 将来自于转PBI空载体烟草的液泡、来自于转基因株系TS1， TS11和TS15的液泡 分别进行如下检测实验。用SIET测定液泡膜H+流的方法与实施例1中所述一致。
在进行NaCl胁迫研究液泡瞬时H+流动力学分析之前，先进行0. 5分钟不加NaCl 的对照测定，系统稳定，向液泡提取液中加入NaCl储存液，使得NaCl在混合溶液中的终浓 度达到150mM，经过1分钟的离子浓度均匀扩散后，进行H+流连续测定3-5分钟。因为每一 个液泡状态和每一次系统稳定时间都不一样。所以在正常的测定过程中，需要等待0. 5-5 分钟的时间不等，用以达到液泡在对照状态(不加盐)情况下的稳定。而图4a中是不同液 泡在经过不同的等待时间，达到最后稳定之前的0. 5分钟的测定数据。
实验设6次重复，结果取平均数。 在图4a中，每一个点表示6个不同液泡在此刻测定值的平均数。
图4b，是对图4a中加完NaCl后所得到动力学数据的平均值。
五、结果
结果如图4所示。 图4a为NaCl处理后时间依赖的瞬时H+动力曲线(M3_l方法得到的液泡)。表明， 转SeNHXl基因烟草液泡H+流由内流转为微弱外流；而PBI烟草表现出液泡H+内流争强。
图4b为150mM NaCl处理后液泡H+流平均值统计(M3_l方法得到的液泡)。表 明，在NaCl处理后，对照烟草表现出液泡净H+内流增加，然而转SeNHXl烟草表现出液泡净 H+内流的减少，甚至H+转向外流达到大约0. lpmolm—2s—、 M3-2、M3-3方法得到的液泡的测定结果与M3_l方法得到的液泡的测定结果一致。
六、结果分析 为了进一步证明SIET适合于液泡H+流测定，本发明检测了在NaCl胁迫下转 SeNHXl基因烟草和转PBI空载体烟草(对照)中液泡H+流的变化情况。
已有研究证明SeNHXl是一个Na7H+逆向转运蛋白基因，转SeNHXl基因的T0代烟 草表现出抗盐性的增强。转基因TO代植株在盐胁迫下比对照植株具有更高的干重，更强的 光合效率；同时，表现出增加的Na+离子浓度、K7Na+和细胞液渗透势。(Zhou SF，Chen XY，Zhang XG， Li YX - Improved salt tolerance in tobacco plants byco—transformationof a betaine synthesis gene BADH and a vacuolar Na+/H+antiporter gene SeNHXl.Biotechnol. Lett. 2008,30 :369-376.)。 本实验的结果证明在NaCl处理后，对照烟草表现出液泡净!1+内流增加，然而转SeNHXl烟草表现出液泡净H+内流的减少，甚至H+转向外流达到大约0. lpmolm—2s—、同时，NaCl处理后时间依赖的瞬时H+动力曲线也表明，转SeNHXl基因烟草液泡H+流由内流转为微弱外流；而PBI烟草表现出液泡H+内流争强。，这些结果证明转SeNHXl基因烟草在盐胁迫下液泡H+外流得以加强。 通过本实验证明，SeNHXl基因转入烟草，增强转基因植株在盐胁迫下H+的外流，同时偶联着Na+离子的液泡区隔化。所得的结论与NHXl被证明的基因功能，以及之前转SeNHXl基因烟草所得的生理证据(耐盐，植株积累高浓度Na+，增强的细胞渗透势)相一致。
许多研究表明，转NHXl基因植株，例如拟南芥，番茄，多年生黑麦草等，都表现出抗盐性的增强。同时，NHX1在盐胁迫下的离子转运功能也在体外液泡膜H+转运系统中得到证明。然而，迄今还没有在盐胁迫下，对亚活体液泡进行实时Na+和H+流测定。本发明对被分离的处于亚活体状态的液泡进行盐胁迫下实时H+流变化测定，证明了 SeNHXl作为Na7H+逆向转运蛋白，增强了转SeNHXl基因烟草中液泡H+的外流，同时也伴随着更多Na+在液泡中的区隔化集中。
权利要求
一种提取植物液泡的方法，包括如下步骤提取并裂解植物叶片的原生质体，得到所述植物叶片的原生质体裂解溶液，分离纯化所述植物叶片的原生质体裂解溶液，得到所述植物的液泡提取液；所述分离纯化所述植物叶片的原生质体裂解溶液的方法包括如下密度梯度离心步骤将所述植物叶片的原生质体裂解溶液加入到8％Ficoll-400溶液的上层，所述8％Ficoll-400溶液在下层，所述植物叶片的原生质体裂解溶液在上层，以500g-50000g的离心力离心10min-50min，收集上数第一层溶液，即为所述植物的液泡提取液；每1升所述8％Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的将25mmol Tris、(0.4-1)mol甘露醇和80g相对分子重量为400000的聚蔗糖混合，用水定容至1升，再用HCl调节pH至7.0-7.5，得到1升所述8％Ficoll-400溶液。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述密度梯度离心步骤中，所述离心的方 式为以500g、 lOOOg或50000g的离心力离心10min、30min或50min ;所述每1升所述8% Ficoll-400溶液的配制方法中，所述甘露醇的用量为0. 4mol、 0. 5mol或lmol ;所述每1升所述8% Ficoll-400溶液的pH值为7.5。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述密度梯度离心步骤中，所述离心 的方式为:以500g的离心力离心50min，或以lOOOg的离心力离心30min，或以50000g的离 心力离心lOmin。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述植物为烟草。
5. —种检测植物液泡膜离子流的方法，包括如下步骤用扫描离子选择电极技术检测 植物液泡的液泡膜离子流，得到所述植物液泡的液泡膜离子流值。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述离子流为H+流。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述方法中，在用扫描离子选择电极 技术检测植物液泡的液泡膜离子流前，包括按照权利要求1-3中任一所述方法提取植物液 泡的步骤。
8. 根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于所述用扫描离子选择电极技术检测植物液泡的液泡膜离子流的方法包括如下步骤处理盖玻片，得到处理后的盖玻片，将 所述植物液泡固定于所述处理后的盖玻片上，再加入测定液，进行测定；每1升测定液是按照如下方法配制得到的将0. 05mmol的2_(N_吗啡啉)乙磺酸、 (500-800)mmol甘露醇、0. lmmol NaCl、0. lmmol CaCl2和lOOmmol KC1混合均匀，用水定容 至1升，再用KOH调节pH至6. 8-7. 5 ;所述测定中使用的电解液由NaCl、 KH2P04和水组成，NaCl在电解液中的浓度为 (13. 5-16. 5)mM， KH2P04在电解液中的浓度为(36-44) mM，所述电解液的pH值为6. 8-7. 2。
9. 根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于所述每1升测定液的配制方法中，所述甘露醇为500mmol、650mmo1或800mmo1 ;所述测 定液的pH值为6.8、7.0或7. 5 ;所述测定中使用的电解液由NaCl、腿^04和水组成，NaCl在电解液中的浓度为15mM、 13. 5mM或16. 5mM，KH2P04在电解液中的浓度为40mM、36mM或44mM，电解液的pH为6. 8、7. 0 或7. 2。
10.根据权利要求5-9中任一所述的方法，其特征在于所述植物为烟草:
全文摘要
本发明涉及一种检测液泡膜质子流的技术。该方法包括如下步骤用扫描离子选择电极技术检测植物液泡的液泡膜离子流，得到所述植物液泡的液泡膜离子流值。实验证明，通过M3分离的液泡，不仅与M2有相同的分离效果(干净的观测背景和较高的液泡分离效率)，更重要的是在SIET的测定中M3和M2分离的液泡都表现出相似的H+流测定数值和测定稳定性(图.2)。同时，作为从M2简化的M3方法，比传统的超速离心法M2，操作更简单而且费用更低廉。所以，简化的液泡提取方法作为一种替代传统超速离心液泡提取方法，适合于SIET H+流测定。同时本发明方法对液泡具有非损伤性和稳定性。另外，用本发明方法检测到盐胁迫下转SeNHX1基因烟草液泡H+外流增强，验证了SeNHX1基因的功能。综上所述，本发明建立了适合于SIET的简化液泡提取方法和液泡H+流检测系统。
文档编号C12N5/04GK101792730SQ201010117670
公开日2010年8月4日 申请日期2010年3月3日 优先权日2010年3月3日
发明者李银心, 陈显扬 申请人:中国科学院植物研究所