专利名称：假丝酵母二羟基丙酮合成酶的原核表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达假丝酵母二羟基丙酮合 成酶蛋白(DAS)的原核表达载体pET28a-DAS及其在DAS蛋白的原核表达和DAS蛋白抗体 制备中的应用。
背景技术：
甲醛是一种无色，有强烈刺激气味的气体，易溶于水、醇和醚，被广泛用于工业生 产中，是胶粘剂工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高， 各种原料制成的建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染 公认最具代表性的化学物质。室内空气中游离甲醛浓度在中国规定的允许值是0.08(mg/ 立方米)，对新装修住宅的调查结果表明室内空气中甲醛浓度是室外空气的6. 65倍，为 0. 492mg/m3，在门窗关闭时甲醛浓度超标100倍。甲醛为较高毒性物质，它反应能力极强，能 与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应，是一种非常活泼的化合物，因此对所有的生物 来说都有很高的毒性长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻烟癌、结肠癌、脑 瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DNA单链内交连和DNA与蛋白质交连及抑制DNA损伤的修 复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异常、白血病，这就是所谓的装修综合病(sick-house)。相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游离甲苯二异氰酸酯(TDI)、挥发性有机化合物 (VOC)等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、 危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三种一是使用环保材料；二是开窗 通风；三是用植物或除污剂清除污染，使用除污剂有二次污染的可能。用室内栽培植物清除 甲醛污染，是最自然、最环保的方式，科学研究证明确实有些植物能够吸收分解甲醛，但吸 收能力和速度非常有限(Giese 等，1994，Plant Physiol. 104 1301-1309)。甲基营养酵母具有利用一碳化合物甲醇的高效代谢机制，在甲醇的代谢途径中， 甲醇首先被乙醇氧化酶氧化为甲醛，甲醛是甲醇代谢过程中的一个关键性的中间产物，它 处于甲醇同化和异化途径的分支点上，甲醛是甲醇代谢过程中的一个关键性的中间产物， 它处于甲醇同化和异化途径的分支点上。二羟基丙酮合成酶(DAS)催化甲醛同化途径中的 第一个反应，DAS催化酵母菌中的甲醛和木酮糖5-P形成二羟基丙酮和甘油醛3-磷酸。甲 醇被乙醇氧化酶氧化成甲醛后，由它把甲醛固定到D-木酮糖5-磷酸分子上(Yurimoto等， 2005，The Chemical Record. 5 :367_375)。通过突变体和酶学特性分析证实了 DAS的生理 作用是甲醇同化作用的关键酶。目前已从甲基营养型酵母菌假丝酵母(Candida boidinii) 中克隆到编码DAS的基因(DHASl)，进一步的调查结果证实DAS主要参与这种酵母菌细 胞中甲醛的同化作用而非异化作用或脱毒作用(Sakai等，1998，American Society for Microbiology. 180 :5885_5890)。 二羟基丙酮对酵母细胞来说是有毒的化合物，在酵母菌中二羟基丙酮激酶(DAK) 参与二羟基丙酮的脱毒作用，它催化的反应使二羟基丙酮磷酸化，形成无毒性的磷酸二羟丙酮，可为酵母细胞所利用。该酶普遍存在于大多数的生物体中，结合遗传学和生物化学 方法，已从酵母菌酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中克隆到两个编码DAK的基因 (YML070W/DAK1和YML053W/DAK2)，它们所编码的蛋白质是同型二聚体(Molin等，2003， The journal of biological chemistry. 278 :1415_1423)。从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中克隆到的DAK基因编码的蛋白质定位于细胞质中(Liiers等，Yeast. 1998，Jun 15，14(8) :759-71)。
5-磷酸木酮糖和磷酸二羟丙酮及甘油醛3-磷酸都是开尔文循环的中间产物，本 申请人:的研究结果证明(见本申请人的另一申请专利提高植物吸收和耐受甲醛的方法及 其植物载体与应用，申请号在200810058341. 9)在植物的叶绿体中过量表达来自酵母菌的 DAS和DAK，可以用在转基因植物中利用DAS和DAK构建一条甲醛同化途径，提高植物同化 和吸收甲醛的能力。因此DAS和DAK的过量表达可用于提高观赏植物代谢甲醛能力的分 子育种，把DAS和DAK整合到植物基因组后，DAS和DAK蛋白在植物中的表达量是转基因 是否起作用的关键，其中DAS蛋白特异性抗体是检测转基因植物中DAS蛋白表达水平的有 效工具。目前虽然有些研究用经典方法直接从假丝酵母中纯化到DAS蛋白(Kato et al., Biochim. Biophys. Acta. 1982，715 143-150)，并制备了一些DAS 的抗体(Sakai et al.，The Journal of CellBiology, 1996，134 :37_51)，但是由于天然的甲基营养型酵母菌中DAS的 表达量不高，所以DAS蛋白纯化操作过程很复杂，通常用这类方法纯化DAS蛋白需要大规模 培养假丝酵母菌，过几种性质不同的柱子，并用专业的仪器控制洗脱条件，蛋白纯化的成本 很高，因此这类方法不方便重复使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种假丝酵母DAS的原核表达载体 (pET28a-DAS)，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和DAS基因及一个组 氨酸标签，利用该载体转化大肠杆菌(BL21)，可实现DAS蛋白的高水平表达，表达的DAS 蛋白80%以上形成包涵体，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 DAS蛋白，再从凝胶中回收DAS蛋白可得到纯度极高的DAS蛋白，用于抗体的制备。DAS重 组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化DAS蛋白的操作相当简单，成本也很 低，极易重复使用。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案一种原核表达载体，在该原核表达载体中含有假丝酵母DAS基因。所述原核表达载体的起始载体为pET_28a ；所述DAS基因上游添加有T7的启动子 和细菌核糖体结合位点RBS。所述的DAS基因，其GenBank登录号为AF086822。本发明的原核表达载体由下述方法构建而得(1)从GenBank中查找假丝酵母DAS的全长基因序列，并设计序列如下的一对引 物DAS5 :5， -CATGGCTCTCGCAAAAGCTGCTTC-3’DAS3 :5， -CTCGAGTAAATGATTTTGATCATGTTTTGGTTTTTC-3'5’端引物添加一个C碱基，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物末端加XhoI酶 切位点；以假丝酵母基因组为模板通过PCR扩增，得到DAS的全长DNA序列；(2)回收并纯化DAS全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-DAS ；(3)构建原核载体pET28a-DAS，用NcoI和XhoI双酶切pMD-DAS和pET28a，并回收 纯化DAS基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR扩增检测和酶 切检测，获得原核表达载体pET28a-DAS。上述载体中的二羟丙酮合成酶基因DAS来源于假丝酵母，在GenBank中的登录号 为AF086822。在上述载体中，DAS基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动 子的下游有操作子序列，可被IPTG诱导。为了使DAS基因表达的重组蛋白DAS能用亲和层 析纯化，紧靠DAS基因的起始密码子上游还有6个组氨酸标签序列。 本发明的原核表达载体在制备重组DAS蛋白中的应用，在制备DAS特异性抗体中 的应用。
将上述载体热刺激法导入大肠杆菌蛋白表达专用受体菌株BL21中，获得转化子 菌落，用IPTG进行诱导可高水平表达DAS重组蛋白。本发明的实验结果表明用IPTG于28°C诱导8小时后可获使DAS重组蛋白达到 很高的表达量，可占细菌细胞总蛋白的50%，所表达的DAS重组蛋白有80%会形成包涵 体，包涵体中DAS重组蛋白含量很高，用高浓度的尿素溶解后进行聚丙烯酰氨凝胶电泳 (SDS-PAGE)极易纯化DAS重组蛋白，然后割下含有DAS重组蛋白的凝胶，通过透析从凝胶中 回收获得纯度很高的DAS重组蛋白，可用于DAS特异性抗体的制备，为DAS特异性抗体的制 备提供了 一条新途径。
图1、假丝酵母菌基因组DNA的检测。M λ DNA/HindIII DNA marker ； 1-8 假丝酵
母基因组；图2、DAS基因的TA克隆策略；图3、DAS基因TA克隆质粒的检测。(A)重组质粒pMD18_DAS的电泳检测。1 正 对照(分子量为4. 8kb的质粒DNA) ；2-5 重组质粒pMD18_DAS。(B)重组质粒pMD18_DAS 的酶切检测。M =DNA marker III ； 1-2 没有酶切的质粒pMD18_DAS ；3 用 EcoRI 酶切的 pMD18_DAS ；4-5 用 HindIII 酶切的 pMD18_DAS。(C)重组质粒 PMD18-DAS 的 PCR 检验。M :DNA marker III ； 1-5 以 pMD18_DAS 为模版用 DAS5 和 DAS3 引 物扩增的PCR产物；图4、DAS基因的原核表达载体构建策略；图5、DAS基因原核表达载体的检测。(A)重组质粒pET28a_DAS的电泳检测。 1 正对照(分子量为7. 4kb的质粒DNA) ； 2-5 重组质粒pET28a_DAS。(B)重组质粒 pET28a-DAS 的酶切检测。M :DNA marker ；1 没有酶切的质粒 pET28a_DAS ；2-5 用 EcoRV 酶 切的 pET28a-DAS。(C)重组质粒 pET28a_DAS 的 PCR 检验。M =DNAmarkerIII ；1 正对照(以 PMD18-DAS为模版用DAS5和DAS3引物扩增的PCR产物)；2-4 重组质粒pET28a_DAS的PCR 扩增产物；图6、DAS重组蛋白表达条件的优化；图7、DAS重组蛋白的纯化。
具体实施例方式试剂与仪器试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物 鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制 齐IJ、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物 技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司。其余试剂均为国产 分析纯。
仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明 均为常规方法。实施例1 假丝酵母(Candida boidinii)基因组DNA的制备与检测本发明所用的假丝酵母(Candida boidinii)购自中国工业微生物菌种保藏中心， 假丝酵母菌基因组DNA的制备采用CTAB法，。取1. 5mL菌液于4°C 4000rpm离心2min，弃尽 上清液，收集菌体。加 400 μ 1 2 X CTAB (Tris-HCl ρΗ 7. 5100mM, EDTA20mM, NaCl 1.4M，CTAB 2% )勻浆，65°C保温20min，加500 μ 1氯仿混勻后于室温下13000rpm离心lOmin。转移上 清，加50μ 1的10% CTAB，加650μ 1异丙醇置于室温1小时，4°C 12000rpm离心25min.，沉 淀用500 μ 1 75%酒精洗一次.，真空干燥，加20 μ 1含有RNase的TE溶解，37°C保温一小 时。实施例2 =DAS基因的扩增与TA克隆DAS基因的扩增及TA克隆的策略如图2所示，首先从GenBank中查找DAS的全长 基因序列(DAS基因的GenBank登录号为AF086822)，并设计一对引物，序列如下DAS5 CATGGCTCTCGCAAAAGCTGCTTCDAS3 :CTCGAGTAAATGATTTTGATCATGTTTTGGTTTTTC5’端引物DAS5末端加一个C，由此形成NcoI酶切位点；3’端引物DAS3末端加 XhoI酶切位点。在PCR反应混合液中加入10 μ g的假丝酵母基因组DNA作为模板，同时加入50 μ g 的特异性引物 DAS5 和 DAS3、1. 8 μ IdNTP (2. 5mM)，5 μ 1 的 Long Taq 反应 Buffer 和 0. 3 μ 1 的long Taq (2. 5U/ μ 1)聚合酶(购自天根生化科技)，加双蒸水使反应终体积为20 μ 1。 在PCR仪上于94°C加热3分钟，然后按照94°C、45秒，55°C、45秒，72°C、2分钟45秒的程 序进行28个循环的反应，最后在72°C延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增得到DAS 基因。反应完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物。回收并纯化DAS全长基因 DNA (2. Ikb)，然后用宝生物(TaKaRa)的TA克隆试剂盒亚克隆到pMD18_T (购自大连宝生物 公司)载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应混合液转化大肠杆菌 感受态DH5ci (购自天根生化科技公司)，采用碱裂解法提取质粒DNA，用琼脂糖凝胶电 泳检测其大小(图3A)，选取大小和理论值相符的重组质粒进行酶切检测。用EcoRI酶切重 组质粒，用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD-DAS只有一条带， 分子量为4. 8kb (图3B)。用HindIII酶切重组质粒，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物， 连接成功的重组质粒pMD-DAS产生二条带，其中一条较小为1. 9kb左右的DAS基因DNA片段(图3B)，另一条为2. 9kb的载体片断。选取酶切检测正确的重组质粒pMD18-DAS做进一 步的PCR检测，用DAS基因上下游特异性引物DAS5和DAS3作PCR，亚克隆成功的重组质粒 均能扩增出2. Ikb左右的DAS基因DNA片段(图3C)，测序分析证明重组质粒载体中插入的 DAS全长基因序列正确。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 α，挑单个 菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒PMD18-DAS。实施例3 原核表达载体pET28a_DAS的构建
pET28a-DAS 的构建策略如图 4 所示，用 Nco I (Fermentas)和 Xho I (Fermentas) 切开纯化的原核表达质粒载体pET28a(购自Novagen公司)和pMD18_DAS，通过琼脂糖 凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收pET28a被切割后产生的载体片断 pET28a(5. 4kb)及pMD18_DAS被切割产生的DAS基因的DNA片断(2. 1kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pET28a载体片段和DAS基因 的DNA片断产生原核表达载体pET28a-DAS。用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆 菌感受态细胞(DH5 α，购自天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有卡那霉素(Km， 50 μ g/ml)的平板上，于37°C过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落，从Km抗性重组子菌落中 提取质粒(图5A)，用EcoRV (Fermentas)进行酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳 图上产生两条带，分子量小的一条为1. 4kb，另一条为6. Ikb (图5B)。选出连接成功的质粒 载体pET28a-DAS，用DAS基因上下游特异性引物进行PCR检测，亚克隆成功的重组质粒均能 扩增出2. Ikb左右的DAS基因DNA片段(图5C)，再次确认是连接成功的质粒后，重新转化 大肠杆菌DH5 α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pET28a_DAS。实施例4 重组DAS蛋白的表达与表达条件的优化用原核表达载体pET28a_DAS转化大肠杆菌BL21的感受态细胞(DH5 α，天根生化 科技)。挑取单菌落加入2mL LB (含有Km 50mg/L)中，37°C过夜培养(OD600值约为1. 5)。 加0. 5mM和1. OmM的IPTG于28°C诱导0_8小时后，离心收集菌体，去掉上清液，加入0. Iml SDS-PAGE上样缓冲液(Sample loading buffer)，于95°C加热10分钟煮沸菌体。冰浴冷却 后于4°C离心(12000rpm)10分钟，取上清作SDS-PAGE。根据文献资料和软件分析预测目的 蛋白分子量大小为80kDa左右，采用12%分离胶做SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳参看《分 子克隆实验指南(第三版)》。SDS-PAGE电泳结果(图6)表明用1. OmM的IPTG于28°C诱 导的时间越长，DAS蛋白表达量越高，8小时后DAS蛋白表达量最高。实施例5 重组DAS蛋白的纯化用原核表达载体pET28a_DAS转化大肠杆菌BL21的感受态细胞，挑取单菌落入 500mL LB (含有 Kan 50mg/L)中，37°C培养至 0D600 值约为 0. 6 时，加 1. Ommol/LIPTG 诱导 后12小时，离心收集菌体，用wash buffer (0. IM Tris-Cl，ρΗ7· 4)洗2次，加入30ml蛋白 抽提缓冲液(磷酸钠缓冲液(pH7.4)20mmol/L)，悬浮菌体。于冰浴上超声波破碎细菌细胞 (工作3秒，间歇9秒，功率30W,全程30分钟)。于4°C离心(6000g) 30分钟，得到上清和沉 淀。沉淀用8M尿素(IOml)溶解，加入适量上样缓冲液，用80ul (每孔)跑12% SDS-PAGE, 然后用0. 25M KCl于4°C染色30分钟，割出DAS蛋白条带，放入透析袋，加入2ml SDS-PAGE buffer，进行水平电泳4-5小时或过夜，将DAS蛋白从凝胶中洗脱出来，可获得纯度达95% 以上的DAS蛋白样品(图7)。最后在IXPBS溶液中透析过夜后可用于DAS抗体的制备。
权利要求
一种原核表达载体，在该原核表达载体中含有假丝酵母DAS基因。
2.如权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于所述原核表达载体的起始载体为 pET-28a ；所述DAS基因上游添加有T7的启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下 游有可被IPTG诱导的操纵子序列，紧靠DAS基因的起始密码子上游还有6个组氨酸标签序 列。
3.如权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于上述载体中的二羟丙酮合成酶基因 DAS来源于假丝酵母，在GenBank中的登录号为AF086822。
4.一种原核表达载体，由下述方法构建而得(1)从GenBank中查找假丝酵母DAS的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物DAS5 :5’ -CATGGCTCTCGCAAAAGCTGCTTC-3’DAS3 :5’ -CTCGAGTAAATGATTTTGATCATGTTTTGGTTTTTC-3'5’端引物添加一个C碱基，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物末端加XhoI酶切位 点；以假丝酵母基因组为模板通过PCR扩增，得到DAS的全长DNA序列；(2)回收并纯化DAS全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法提取 质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-DAS ；(3)构建原核载体pET28a-DAS，用NcoI和XhoI双酶切pMD_DAS和pET28a，并回收纯 化DAS基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR扩增检测和酶切 检测，获得原核表达载体pET28a-DAS。
5.权利要求1-4原核表达载体的构建方法，包括下述步骤(1)从GenBank中查找假丝酵母DAS的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物DAS5 :5’ -CATGGCTCTCGCAAAAGCTGCTTC-3’DAS3 :5’ -CTCGAGTAAATGATTTTGATCATGTTTTGGTTTTTC-3'5’端引物添加一个C碱基，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物末端加XhoI酶切位 点；以假丝酵母基因组为模板通过PCR扩增，得到DAS的全长DNA序列；(2)回收并纯化DAS全长基因片段，并将其连接到pMDlS-Τ载体上，采用碱裂解法提取 质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-DAS ；(3)构建原核载体pET28a-DAS，用NcoI和XhoI双酶切pMD-DAS和pET28a，并回收纯 化DAS基因片段以及载体片段pET28a，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR扩增检测和酶切 检测，获得原核表达载体pET28a-DAS。
6.权利要求1-4的原核表达载体在制备重组DAS蛋白中的应用。
7.权利要求1-4的原核表达载体在制备DAS特异性抗体中的应用。
全文摘要
本发明提供一种高效表达假丝酵母二羟基丙酮合成酶蛋白DAS的原核表达载体(pET28a-DAS)，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点和DAS基因及一个组氨酸标签，从假丝酵母中克隆出DAS基因，用T7启动子控制它在大肠杆菌中的表达，利用该载体转化大肠杆菌(BL21)，可实现DAS蛋白的高水平表达，表达的DAS蛋白80％以上形成包涵体，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DAS蛋白，再从凝胶中回收DAS蛋白可得到纯度极高的DAS蛋白，用于抗体的制备。DAS重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化DAS蛋白的操作相当简单，成本较低，极易重复使用。
文档编号C12N9/00GK101838662SQ20101011729
公开日2010年9月22日 申请日期2010年3月4日 优先权日2010年3月4日
发明者孙振, 张婧, 肖素勤, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学