专利名称：一种新的miRNA检测技术及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域一种新的用于检测微小RNA(miRNA)所需试剂(盒)的 制备、技术方法及其在临床医学、生物学和分子生物学等领域的应用。具体地说是一种基于 荧光定量PCR技术应用MGB探针对成熟miRNAs进行高灵敏度、高特异性检测、鉴定的实验 试剂设计、制备与技术方法应用。
背景技术：
1 miRNA及其作用小RNA是长度为19 28nt的RNA调控分子，主要包括微RNA (microRNA, miRNA) 和小干涉 RNA (short-interfering RNA, si RNA)两类，miRNAs 是继 siRNAs 之后新的研 究热点之一，2002年和2003年被美国《科学》杂志评为年度十大科学成就[Couzin J. et al. Science, 2002，298 :2296_2297 Science, 2003，302 :2039_2045]。miRNAs 是长片段 RNA 序列的一部分，同siRNAs —样是比较短小的单链小分子RNA，一般来源于染色体的非编码 区域，由大约70nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来，它通过与其目标mRNA分子的 3’端非编码区域(3-untranslated region, 3UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制 [Stark A，et al. Cell，2005，123 (6) 1133] ；miRNAs在表达上具组织和时间的特异性，是调 节其他功能基因表达的重要调控分子，在基因的稳定和变异、疾病发生发展、细胞功能及信 号转导等领域发挥重要作用[Akao Y, Biol PharmBull，2006，29 :903_906]。截止到2009 年 9 月，在 miRNA 公共数据库 miRBase(htt-p://www. mirbase.org/)中已经有 10883 条来 自不同物种的miRNA序列报道。研究表明，miRNA与多种疾病的发生发展相关。如，miRNAs在肿瘤发生过程中 起至关重要的作用[Hammohd S M. CurrentOpinion in Genetics & Development，2006， 16 :l-6]，癌症的形成与miRNA对致癌和抑癌基因的调控有关；miRNA表达水平还与心肌 肥厚、心律失常、血管内膜损伤和高血压[VanRooij E，et-al. Science, 2007, 316 (5824) 575-579.]等心血管疾病有密切关联。2 miRNA检测方法miRNA表达水平的检测也是科学研究的热点。由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具进行检测，目前 常用的检测方法有2.1 Northern blotting Northern blotting是目前检测miRNA表达的常用手段， 该法是用探针与纯化RNA进行杂交来检测固相支持物(膜)上的目标分子，这种技术较为 复杂且费力、费时。2. 2 RT-PCR :RT_PCR也被用来检测miRNA前体的表达水平，但miRNA前体的表达 水平并不一定和成熟miRNA的表达水平一致。因此，在RT-PCR的基础上，人们改进了一些 技术，从而使得能够检测低表达量的miRNA，而检测对象由前体miRNA转为成熟miRNA。荧 光实时定量PCR (real-time PCR)可以很精确的定量分析miRNA的表达，也可以用于验证预测的miRNA，且具有特异性强、敏感性高、操作相对简单、耗时短、可进行高通量检测等特点。2. 3芯片(microarrays)技术2004年Liu等最先发表了关于微阵列能够获得 高通量的结果。这些结果显示了组织特异性miRNA的表达标记，并通过Northern blot和 real-time PCR进行了验证。芯片技术有着高通量和平行处理的特点，但其弱点就是信号的 稳定性和可重复性较差，灵敏度较低、价格昂贵、难以普及且不能进行精确定量检测。综上所述，不难看出，以Real-time PCR法检测成熟miRNAs是具有很多优势的检 测技术。但目前该方法使用的多是以非特异性荧光标记染料Sybrgreen为主的实验方法， 降低了实验的敏感性和特异性。近来发现高度特异的MGB探针可用于定量有活性的成熟 miRNAs检测，且不受其前体干扰，还可在高度同源性的miRNAs之间进行区分，甚至可以鉴 定只有一个碱基的序列差异。本发明的目的是研制一种基于荧光定量PCR技术的以高度特异的MGB探针为荧光 标记的用于miRNA检测鉴定的试剂(盒)设计、制备及检测技术。本发明所设计、制备、引入的特异性引物和/或所使用的荧光探针和/或所建立的 实验技术不同于目前已有的商品化的miRNA检测试剂盒。
发明内容
本发明的内容是利用RNA加尾和引物延伸法在miRNA用PolyA聚合酶处理后， 用Oligod(T)/特异序列复合引物进行延伸得到反转录cDNA，然后用MGB探针法进行 real-time PCR 检测 miRNA。实验设计、方法与步骤如下1设计Oligod(T)/特异序列复合RT引物miRNA经过PolyA聚合酶处理后，尾端会有多个AA碱基连接的尾巴。要想使 Oligod (T) n/特异序列的复合RT引物与miRNA有效结合，在Oligod (T) η的3，端还要有1_2 个碱基的锚定碱基与成熟miRNA序列匹配。2合成MGB探针代替传统的Taqman探针由于反转录得来的序列很短(大约70bp)，引物探针设计时就需要尽量短小，但特 异性、灵敏度不能随之降低，因此，本发明以合成MGB探针代替传统的Taqman探针，这样探 针的长度可以缩短到13_15bp，同时具有很高的灵敏度和好的特异性。3设计上游及下游引物根据miRNA序列信息设计特异上游引物(Forward Primer)，根据Oligod (T) /特异 序列复合RT引物的序列信息设计通用下游引物(Reverse Primer)，Tm值尽量保证在60°C ； 根据miRNA序列信息设计特异MGB探针。本发明在引物延伸法基础上设计采用了通用的Oligod(T)/特异序列复合RT引物和下游引物而减少了实验成本，并使本发明具有自主知识产权，在反转录中使用常规的反 转录酶和方法而增加了试剂的可选择性。本发明技术与其它方法相比具有特异性强、敏感 性高、成本低、操作相对简单等优点。根据本发明，可将本发明所设计、制备和应用的试剂制备成miRNAs分析试剂盒用 于体外检测、鉴定miRNAs和市场开发销售。根据本发明，本发明设计的01 igod (T) /特异序列复合RT引物、合成的MGB探针代替传统的Taqman探针等可以单独试剂或组合试剂的形式应用及开发销售。根据本发明，本发明的试剂设计制备方法、检测技术方法，特别是反转录与扩增条件可根据不同情况，包括miRNAs的种类、长度、GC含量、Tm值等的不同，适当优化反应条件。根据本发明，本发明所制备的试剂和建立的技术方法可以用于人、动物、植物等相 关的基础和应用研究工作。根据本发明，本发明的实施对严重危害人类健康的恶性肿瘤、心血管疾病、神经系 统疾病等的发病机制研究和预防治疗具有重要的社会和经济效益。
具体实施例方式1 miRNA 提取、纯化用QAIGEN 公司的 miRNeasy Mini Kit (PN 217004)提取分离大 Total RNA( > 200nt)和小RNA( < 200nt)，其操作方法参照该试剂盒说明进行。通过测定260nm OD值确 定两种RNA浓度，用1 % TAE琼脂糖凝胶电泳确认大RNA没有降解，以保证小RNA的质量； 亦可以用3-4% TAE琼脂糖凝胶电泳确认小RNA。2 miRNA 加尾取大约1-2 μ g 的 miRNA，用 Poly(A) Tailing Kit (ABI，PN 1350M)进行尾端加 A， 试剂用量和操作方法按照该试剂盒说明进行。加尾后的小RNA进行反转录为cDNA。3 miRNA 反转录用反转录酶superscript III (Invitrogen, PN18080085)，于 50°C反应 1 小时进行 反转录，反转录试剂配制和操作方法按照该产品说明书进行。4 miRNA反转录产物进行real-time PCR检测取反转录产物1. 50 μ L进行real-time PCR检测。设计内参基因(5sRNA等)；用 ABi 公司的 hsa-miR-16TaqMan MicroRNA 检测试剂(ABM 0000084365746)为阳性对照；以 特定的miRNA标准品做标准曲线。Real-time PCR反应混合液如下配制PCR Master Mix试剂用量(④L) 商品编号_Τ0Υ0Β0 RT PCR Master MIX 5.00TOYOBO, QPK-101Forward primer,20 μ M0. 50Universal primer,20 μ M 0. 50MGB probe, 20 μ M0. 25water2. 25_Total8. 5μ LRT-PCR Mix试剂用量(④ L)_反转录产物1. 50PCR Master MIX8. 50_
Total10 μ L振荡混勻，离心。在ABi 7900real-time PCR仪上运行如下程序PCR 反应条件(Real time PCR-ABi 7900)_95 °CIOmin95 "C15sec
60 °C60sec5 Real-time PCR 检测 miRNA 数据分析利用ABi 7900 real-time PCR仪佩带的SDS 2. 2-2. 3分析软件进行扩增曲线以 及样品CT值的分析。以CT值或者标准曲线计算出的copies数进行比较样本间特定miRNAs 的表达水平。
权利要求
设计Oligod(T)/特异序列复合RT引物，可与miRNA有效结合，在Oligod(T)n的3’端有1-2个碱基的锚定碱基与成熟miRNA序列匹配。
2.以合成的特异性MGB荧光探针代替传统的Taqman探针及非特异性荧光染料 SYBRGREEN等，以缩小探针长度，同时具有高度的灵敏度和特异性，探针的特异序列根据 miRNA的序列信息设计。
3.根据miRNA序列信息设计特异上游引物(ForwardPrimer)，根据Oligod (T) /特异 序列复合RT引物的序列信息设计通用下游引物(Reverse Primer)，Tm值尽量保证在60°C。
4.技术方法主要内容包括利用RNA加尾和引物延伸法在miRNA用PolyA聚合酶处理 后，用Oligod (T) /特异序列复合引物进行延伸得到反转录cDNA，然后用上、下游引物及MGB 探针法进行real-time PCR扩增、检测miRNA。
5.含有权利要求1、2、3、4中的技术、方法所制备的单种或多种试剂及试剂组合物以及 试剂盒，进行miRNA检测以用于基础研究和/或临床应用。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域一种新的用于检测微小RNA(miRNA)所需试剂(盒)的制备、技术方法及其在临床医学、生物学和分子生物学等领域的应用。本发明是一种基于荧光定量PCR方法应用特别设计的引物和合成的MGB探针对成熟miRNAs进行检测、鉴定的实验试剂设计、制备与技术方法应用。与其它方法相比本发明所建立的技术方法具有高灵敏度、高特异性、可高通量检测以及耗时短、操作相对简单等特点。故本发明涉及到新的miRNA检测试剂或试剂盒的制备、技术方法的建立及其在基础研究以及临床医学中恶性肿瘤、心血管系统疾病、神经系统疾病等相关的预防、治疗与研究。
文档编号C12N15/11GK101798595SQ201010119369
公开日2010年8月11日 申请日期2010年3月8日 优先权日2010年3月8日
发明者江其生 申请人:江其生