专利名称：一种改良棉花的棉酚性状的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程领域；具体地说，本发明涉及特异降低棉花种子(棉籽)中的棉酚含量，而不影响棉花植株其他组织中的棉酚的方法和材料， 以及由该方法获得的转基因棉花植物。
背景技术：
棉酚是一种倍半萜醛衍生物，大量积累在棉株地上部分的腺体和根的表皮细胞里，且在棉籽中也有大量的积累。其作为棉花的一种植保素，在抗病抗虫反应中起重要作用。棉酚是一类具有普遍毒性的多酚类化合物，是一种危害细胞、血管及神经的有毒物质， 严重影响棉子油和棉子饼的食用和饲料用价值。棉花是集粮、棉、油、饲、药于一身的多用途作物，棉花生产的主要产品是棉纤维 (皮棉)，约占籽棉重量的40%，轧花后留下的棉籽是棉花生产的主要副产品，每生产100公斤皮棉，就有约近200公斤棉籽产出。我国是世界上最大的棉花生产国，同时也是世界上最大的棉籽生产大国。棉籽饼粕是棉籽榨油后的主要副产品，其蛋白的含量约占33. 21% 45. 09%，富含硫胺素，磷含量在1. 0%以上，钙则低于0. 03%，是一种营养丰富的植物性蛋白；棉籽油脂含量高达18% 20%，是一种亚油酸含量极高的高级保健油；有效和合理利用棉仁，能大大提高人们的饮食质量和身体健康状况，而且棉籽的扩大利用和开发可以成为棉花生产增收的一项主要来源。但由于棉籽中含有较高含量的棉酚，这一宝贵资源至今未得到充分利用。根据棉酚的毒理与毒性效应，联合国粮农组织蛋白质机构规定脱毒棉籽饼粕中的棉酚含量小于0.065% ；世界卫生组织规定棉酚含量小于0.04%。在陆地棉棉籽中，一般游离棉酚占干仁重的0.85%左右，结合棉酚占0. 15%左右。我国曾引进和培育了若干个低棉酚含量的棉花品种，但受到种植区域的影响和病虫害抗性低等原因不能大面积推广，因此我国目前主要种植的还是传统的有腺体棉花品种。棉籽榨油后，棉籽饼粕及棉仁粉的利用大多还只局限于用作反刍动物的粗饲料或有机肥料肥田，个别贫困地区的人们甚至还在危险食用。随着人们生活水平的提高和大量棉籽没有充分利用造成极大的浪费，高产和副产品利用的不协调等生产问题，制约了我国棉花生产的进一步发展。培育高产低酚棉花新品种是解决上述问题经济有效的途径。综上所述，为了在不影响棉花植株抗虫抗病能力的前提下，降低棉籽棉酚含量，提高棉籽的综合利用价值，本领域迫切需要开发种子低酚、植株棉酚正常的转基因棉花新品种。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的特异抑制棉花种子中棉酚合成途径、降低棉籽棉酚含量而不影响植株其他部分棉酚含量的方法。本发明的目的还在于提供所述转基因棉花材料的应用。在本发明的第一方面，提供一种降低棉籽(棉花种子)中棉酚含量的方法，所述方法包括在棉籽内特异性下调杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1(LP13》的表达，从而降低棉花种子中的棉酚含量。较佳地，不改变棉花其它组织的棉酚合成。在一个优选例中，所述方法包括(1)提供一构建物，所述构建物依次含有以下结构(5’ 一 3’ )种子(如棉籽)特
异性启动子；Seq正向-X-Seq反向；其中，Seq1^1为在导入棉花后形成特异性干扰(下调)杜松烯-8-羟化酶基因 CYP706B 1表达的分子的核苷酸序列，Seqfi^1为与Seq1^1基本上互补的核苷酸序列；X为位于^q1自和自之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq1^1* Seqfi^1不互补；(2)将所述构建物转入棉花的细胞、组织、器官或种子，从而降低棉籽中的棉酚含量。在另一优选例中，所述的种子特异性启动子是来源于双子叶植物的种子特异性启动子。在另一优选例中，所述的种子特异性启动子是棉籽特异性启动子。在另一优选例中，所述的种子特异性启动子是球蛋白α globulin B的启动子 (ProGlobulin)。在另一优选例中，所述的种子特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。在另一优选例中，所述的在导入棉花后形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因 CYP706B 1表达的分子的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。在另一优选例中，所述的X的序列如SEQ ID NO 2所示。在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。在另一优选例中，所述的启动子与kq正自-X-Seqfi^1之间是操作性相连的。一般地， 两者的间隔 O-IOOObp ；较佳地 0-500bp ；更佳地 0_200bp ；如 IObp, 50bp, IOObp0在另一优选例中，所述Mq1^1-X-Seq&@结构在转入植物细胞后，形成以下二级结
构
权利要求
1.一种降低棉花的棉籽中棉酚含量的方法，其特征在于，所述方法包括在棉籽内特异性下调杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1的表达，从而降低棉籽中的棉酚含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括(1)提供一构建物，所述构建物依次含有以下结构(5’一3’)种子特异性启动子；Seq正向_X_Seq反向；其中，为在导入棉花后形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1表达的分子的核苷酸序列，为与Mq1^1基本上互补的核苷酸序列；X为位于和之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Mq1^1和不互补；(2)将所述构建物转入棉花的细胞、组织、器官或种子，从而降低棉籽中的棉酚含量。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的种子特异性启动子是球蛋白 α globulin B的启动子。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的种子特异性启动子的核苷酸序列如 SEQ ID NO 3 所示。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的在导入棉花后形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1表达的分子的核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括(a)将所述的构建物转化农杆菌，获得携带所述构建物的农杆菌；和(b)将棉花细胞或组织或器官与步骤(a)中的携带所述构建物的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入棉花细胞或组织或器官。
7.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQID N0:1所7J\ ο
8.权利要求7的多核苷酸的用途，用于降低棉籽中的棉酚含量。
9.一种构建物，其特征在于，所述构建物依次含有以下结构(5’一 3’)种子特异性启；Seq 正向 _X_Seq 反向 _ ；其中，为在导入棉花后形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1表达的分子的核苷酸序列，为与Mq1^1基本上互补的核苷酸序列；X为位于和之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Mq1^1和不互补。
10.如权利要求9所述的构建物，其特征在于，所述的在导入棉花后形成特异性干扰杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1表达的分子的核苷酸序列如SEQID NO 1所示；或所述的种子特异性启动子是球蛋白α globulin B的启动子。
11.权利要求9或10所述的构建物的用途，用于降低棉籽中的棉酚含量。
全文摘要
本发明涉及一种改良棉花的棉酚性状的方法及应用。通过在棉籽内特异性下调杜松烯-8-羟化酶基因CYP706B1的表达，可有效地抑制棉籽中的棉酚合成且不改变棉花其它组织的棉酚合成。本发明的方法改良了棉花植株中的棉酚性状，大大提高了棉花的综合利用价值。
文档编号C12N15/113GK102242118SQ20101017557
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者杨长青, 林芝萍, 武秀明, 毛颖波, 王凌健, 陈晓亚, 骆萍 申请人:中国科学院上海生命科学研究院