专利名称：猕猴成体肝脏前体细胞的分离及培养方法
技术领域：
本发明属于动物前体细胞分离及培养液，特别是猕猴成体肝脏前体细胞的分离及
培养液。
背景技术：
我国现有慢性肝炎病人3000万，其中一部分逐步发展成为肝纤维化，肝纤维化如 果进一步恶化将导致肝硬化、肝衰竭、门静脉高压等。一般说来，早期肝纤维化是可逆的，而 晚期肝纤维化即肝硬化则是不可逆的，器官移植是目前治疗晚期肝脏疾病唯一可行方案， 然而，供体器官严重缺乏限制了其应用。越来越多的研究表明以肝干(前体)细胞为基础的细胞替代治疗已成为治疗肝 脏疾病新的希望。成体肝脏前体细胞Ofepatic Progenitor cells,HPCs)具有较强的细胞 增殖及分化为特定细胞类型的能力，较低的畸胎瘤生成率，而没有胎儿来源的HPCs和胚胎 干细胞存在的伦理问题，因此被认为是细胞替代治疗晚期肝脏疾病的理想种源细胞。目前已分离到多种类型的成体HPCs。来源于人、小鼠和大鼠病理肝脏中的卵圆细 胞(oval cells)是最早被鉴定具有HPCs功能的细胞，卵圆细胞在体内外具有很强的增殖 能力，并能分化为肝细胞或胆管上皮细胞(biliary印ithelial cells, BECs)的能力。但 由于细胞分离是一种甚为复杂的技术，要做到最大限度的富集所需的细胞，同时减少其他 细胞的百分比，要求细胞分离培养的每一个环节都要经过比较分析，才能得到一个简单、高 效、稳定的体系。目前还没有从正常的成体肝脏中得到与卵圆细胞相同表型一致细胞的报 道。成熟的肝细胞由于在体外可以分化为胆管上皮细胞或表达胆管上皮细胞的相关蛋白， 并可参与再生胆管的重塑，因此也被认为是成体HPCs细胞中的一种，遗憾的是成熟的肝细 胞在体外很难扩增培养。除了卵圆细胞和肝细胞外，来源于小鼠、大鼠和猪健康的成体肝上皮细胞(liver epithelial progenitor cells,LEPCs)具有HPC的特性，这些上皮细胞呈现干细胞特有的 扩增能力、并能分化为肝脏特定的细胞类型，移植后可恢复受损肝脏的肝功能水平，所有这 些特性表明肝脏上皮前体细胞是潜在的细胞替代治疗理想的供体细胞。同样，从啮齿类， 人以及SV40T转染的食蟹猴的胎儿肝脏也可分离到类似的肝脏上皮细胞。许多研究进行了从人的成体肝脏中分离HPCs的尝试。利用特定的培养条件可从正 在进行肝切除的病人的肝内分离到一种能在体外长期增殖的肝干细胞(human hepatic stem Cells，HHSC)。然而，该细胞群的表达模式以及分化潜力都表明它们更加类似于间充质干细胞 (mensenchymal stem cells,MSCs)而不是传统意义上的HPCs。最近，从人健康的成体或肝切 除的肝脏中得到了呈现肝胆表达模式的肝上皮细胞，提示它们可能是潜在的前体细胞。但目 前报道并没有完全证实肝脏前体细胞的特性，如细胞的双向(肝和胆)分化能力。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可应用于猕猴成体肝脏前体细胞的分离培养方法，所分离得到的细胞能够为灵长类各个物种的成体肝脏前体细胞的分离 培养和细胞分化机制的研究，尤其是作为替代治疗晚期肝脏疾病的理想种源细胞奠定基 石出。本发明目的通过以下步骤实现(1)取5-10克的猕猴成体肝脏组织，用PBS浸泡洗涤3次，剪成小块，用含5mg/ml 的IV型胶原酶的DMEM消化组织块30 60分钟；(2)收集上清液中的细胞，用DMEM洗三次后以1200转/分速度离心5分钟；(3)将收集到的细胞置于10%胎牛血清DMEM的密封离心管中悬浮培养，以形成细 胞团块；(4)挑出单个的细胞团块，接种于大鼠鼠尾胶原铺板的培养板；(5)细胞培养液含有 10mmol/L nicotinamide, lx ITS, lOOU/mlpenicillin, 100 u g/ml str印tomycin 的 DMEM/F12(3 1)，加入 10% FBS，50ng/mL 表皮生长因子 EGF， lOng/ml肝细胞生长因子HGF ；(6)待细胞在培养板上长满后，用trypsin-EDTA在37°C消化10 30分钟，用流 式细胞术分选E-cad+细胞，收集猕猴成体肝脏前体细胞。所述的细胞培养条件为37°C，5%的C02，每两天换一次培养液。所述步骤(1)在37°C的摇床中，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM消化组织块 30分钟。所述步骤(3)中密封的离心管中细胞悬浮液在37°C的摇床中悬浮培养，所述的猕猴成体肝脏前体细胞用步骤(5)中的培养液，在大鼠鼠尾胶原铺板的培 养板上进行培养，可按1 2或1 3多次传代。本发明具有的积极意义及进步是经过反复比较，我们成功地在本发明中建立了一个合适的体系，用来分离培养 来自于正常成年猕猴的肝脏前体细胞(monkey liver epithelialprogenitor cells, mLEPCs)，包括分离过程中的肝脏组织小块消化时间的长度，消化酶的浓度，培养板的大鼠 鼠尾胶原铺板，细胞团块的制备和单个细胞团块的挑选，培养液中各种成分的组合，以及 E-cad+细胞的流式细胞术分选等关键环节。本发明能够为灵长类各个物种的成体肝脏前体 细胞的分离培养和细胞分化机制的研究提供条件，更重要的是，由于猕猴和人的高度相似 性，利用同样的技术，将可能分离得到类似于猕猴的人肝脏前体细胞，从而使细胞替代治疗 晚期肝脏疾病成为可能。本发明方法简单，所需设备都是细胞培养实验室必备的设备，易于推广。实验研究 结果表明，本发明的方法能够有效地分离得到猕猴成体肝脏前体细胞，该前体细胞能在体 外分化为包括肝细胞和胆管细胞在内的多种细胞。该前体细胞移植到肝损伤小鼠，能参与 肝损伤小鼠的肝组织再生，并能分化为功能性的肝细胞。
具体实施例方式实施例1 取5克的猕猴成体肝脏组织，用PBS浸泡洗涤3次，剪成小块，用含5mg/ml的IV 型胶原酶的DMEM消化组织块30分钟，收集上清液中的细胞，用DMEM洗三次并以1200转/分的速度离心5分钟。将收集到的细胞悬浮于10%胎牛血清的DMEM中，再置于密封的离心 管中悬浮培养，以形成细胞团块。在显微镜下，将单个的细胞团块挑出，并接种于大鼠鼠尾 胶原铺板的培养板。待细胞在培养板上长满后，用trypsin-EDTA在37°C消化10-30分钟， 消化得到的细胞用流式细胞术分选E-cad+细胞，得到猕猴成体肝脏前体细胞。上述方法中，大鼠鼠尾胶原制备方法见(Malhi，2002)。
细胞培养液含有IOmmol/L nicotinamide, Ix ITS, 100U/ml penicillin, 100 μ g/ ml streptomycin 的 DMEM/F12(3 1)，加入 10% FBS,50ng/mL 表皮生长因子，10ng/ml 肝 细胞生长因子。实施例2 取大约8克的猕猴成体肝脏组织，用PBS浸泡洗涤3次，剪成小块，在37°C的摇床 中，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM消化组织块50分钟，收集上清液中的细胞，用DMEM 洗三次并以1200转/分的速度离心5分钟。将收集到的细胞悬浮于10%胎牛血清的DMEM 中，再置于密封的离心管中在37°C的摇床中悬浮培养，以形成细胞团块。在显微镜下，将单 个的细胞团块挑出，并接种于大鼠鼠尾胶原铺板的培养板。细胞培养条件为37°C，5%的 CO2，每两天换一次培养液。待细胞在培养板上长满后，用trypsin-EDTA在37°C消化10-30 分钟，消化得到的细胞用流式细胞术分选E-cad+细胞，得到猕猴成体肝脏前体细胞。大鼠鼠尾胶原制备方法、细胞培养液同实施例1。实施例3 将分离获得的猕猴成体肝脏前体细胞用实施例1的细胞培养液，在大鼠鼠尾胶原 铺板的培养板上进行培养，可按1 2或1 3多次传代，生长扩增。
权利要求
一种猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，包括以下步骤(1)取5-10克的猕猴成体肝脏组织，用PBS浸泡洗涤3次，剪成小块，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM消化组织块30～60分钟；(2)收集上清液中的细胞，用DMEM洗三次后以1200转/分速度离心5分钟；(3)将收集到的细胞置于10％胎牛血清DMEM的密封离心管中悬浮培养，以形成细胞团块；(4)挑出单个的细胞团块，接种于大鼠鼠尾胶原铺板的培养板；(5)细胞培养液含有10mmol/L nicotinami de，1x I TS，100U/mlpenicillin，100μg/ml streptomycin的DMEM/F12(3∶1)，加入10％FBS，50ng/mL表皮生长因子EGF，10ng/ml肝细胞生长因子HGF；(6)待细胞在培养板上长满后，用t ryps in-EDTA在37℃消化10～30分钟，用流式细胞术分选E-cad+细胞，收集猕猴成体肝脏前体细胞。
2.根据权利要求1所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是细胞培 养条件为37°C，5%的C02，每两天换一次培养液。
3.根据权利要求1或2所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是步 骤(1)在37°C的摇床中，用含5mg/ml的IV型胶原酶的DMEM消化组织块30分钟。
4.根据权利要求1或2所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是步 骤(3)中密封的离心管中细胞悬浮液在37°C的摇床中悬浮培养。
5.根据权利要求3所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是步骤 (3)中密封的离心管中细胞悬浮液在37°C的摇床中悬浮培养。
6.根据权利要求1、2所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是所述 的猕猴成体肝脏前体细胞用步骤(5)中的培养液，在大鼠鼠尾胶原铺板的培养板上进行培 养，可按1 2或1 3多次传代。
7.根据权利要求3所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是所述 的猕猴成体肝脏前体细胞用步骤(5)中的培养液，在大鼠鼠尾胶原铺板的培养板上进行培 养，可按1 2或1 3多次传代。
8.根据权利要求4所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是所述 的猕猴成体肝脏前体细胞用步骤(5)中的培养液，在大鼠鼠尾胶原铺板的培养板上进行培 养，可按1 2或1 3多次传代。
9.根据权利要求5所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是所述 的猕猴成体肝脏前体细胞用步骤(5)中的培养液，在大鼠鼠尾胶原铺板的培养板上进行培 养，可按1 2或1 3多次传代。
10.根据权利要求6所述的猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，其特征是所述 的猕猴成体肝脏前体细胞用步骤(5)中的培养液，在大鼠鼠尾胶原铺板的培养板上进行培 养，可按1 2或1 3多次传代。
全文摘要
猕猴成体肝脏前体细胞的分离和培养方法，属于动物前体细胞分离及培养液，特别是猕猴成体肝脏前体细胞的分离及培养液。本发明将猕猴肝脏切除手术或其他途径得到的少量肝脏组织，用IV型胶原酶将组织块消化，收集细胞悬浮于10％胎牛血清DMEM中培养、挑出单个细胞团块接种于大鼠鼠尾胶原铺板的培养板，培养液为专用的培养液，经培养的细胞用流式细胞术分选E-cad+细胞获得目的细胞。本方法分离得到的细胞可用于细胞分化机制研究，并可能成为细胞替代治疗晚期肝脏疾病的理想种源细胞。
文档编号C12N5/071GK101864394SQ20101019877
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月12日 优先权日2010年6月12日
发明者季维智, 纪少珲, 金立方 申请人:昆明亚灵生物科技有限公司